具有增加的油含量的經修飾植物的制作方法
【專利摘要】本發明提供用以增加植物（尤其產油植物）的油含量的方法和手段，其是通過以各種方式防止這些植物的細胞中的乙酰基CoA-羧化酶受18:1-輔酶A或18:1-酰基載體蛋白的反饋抑制來實現。
【專利說明】具有增加的油含量的經修飾植物
[0001]本發明是在美國能源部(U.S.Department of Energy)所授予的合同號DE-AC02-98CH10886下通過政府支持而完成。政府對本發明具有某些權利。
[0002]相關申請的交叉引用和序列表的并入
[0003]本申請要求2011年6月28日提交的美國臨時專利申請61/502，163的優先權權益，這個申請以全文引用的方式并入本文中。在名為“58764000510PCT”的文件中所含的序列表與此一同提交并且以引用的方式并入本文中，這個文件為276kb (在MS-Windows操作系統中測得)并且在2012年6月15日創建。
【技術領域】
[0004]本發明關于農學領域。更具體地說，本發明提供用以增加植物、尤其產油植物的油含量的方法和手段，其是通過以各種方式防止這些植物的細胞中的乙酰基CoA-羧化酶受18:1-輔酶A或18:1-酰基載體蛋白的反饋抑制來實現,包括通過提供對反饋不敏感或敏感性較小的乙酰基CoA-羧化酶，通過過度表達FATA基因或乙酰基CoA結合蛋白。
【背景技術】
[0005]植物油在經濟上日益重要，因為其被廣泛用于人類和動物膳食中以及許多工業應用中，包括作為用以生產生物燃料或生物柴油的再生源。最廣泛使用的植物油來源于棕櫚(在2008年全球消耗量為4131萬噸)或大豆(4128萬噸)，其次是菜籽油(1824萬噸)、向日葵油(991萬噸)、花生油(482 萬噸)棉籽油(499萬噸)棕櫚仁油(485萬噸)椰子油(348萬噸)和橄欖油(284萬噸)。其他重要的甘油三酸酯油包括玉米油、葡萄籽油、榛子油、亞麻籽油、米糠油、紅花油和芝麻油。
[0006]增加每株植物的油產量似乎是一種提供更多油用于這些不同目的的有前景的方法，并且避免了一方面用于食物和飼料與另一方面用于工業的油之間的土地競爭。植物中的油合成似乎受脂肪酸的產生所限制，并且脂肪酸生物合成中的第一關鍵步驟，即，由乙酰基-Cok羧化酶使乙酰基-Cok羧化產生丙二酰基-Coh,已表明是限速的。
[0007]Roesler 等人 1997(Plant Physiol.113，75-81)描述了擬南芥同質型乙酸基-CoA羧化酶的表達以及使蛋白質靶向油菜籽的質體使得種子油增加5%。
[0008]Madoka 等人 2002 (Plant Cell Physiol.43，1518-1525)報導了通過質體轉化而過度表達質體編碼的乙酰基CoA羧化酶羧基轉移酶(6-亞單元(accD)誘導煙草植物中的葉子油含量增加5-10%。
[0009]US5, 962，767描述了編碼251kD細胞溶質乙酰基CoA羧化酶的擬南芥乙酰基coA
羧化酶基因的分離。
[0010]W094/17188披露了具有植物乙酰基-Cok羧化酶的密碼的另一個DNA序列以及所述DNA序列的等位基因和衍生物。
[0011]W095/13039關于植物硫酯酶，特別是對棕櫚酰基-ACP底物具有實質活性的植物酰基-ACP硫酯酶。描述了適用于在植物種子細胞中表達植物棕櫚酰基-ACP硫酯酶的DNA構筑體。這些構筑體將含有在調控元件控制下編碼所關注的植物棕櫚酰基-ACP硫酯酶的DNA序列，當這類構筑體在轉基因植物中表達時，這些調控元件能夠相較于其他植物組織優先引導種子組織中植物棕櫚酰基-ACP硫酯酶的表達。這個文獻還描述了使用編碼植物棕櫚酰基-ACP硫酯酶的DNA序列來修飾植物種子細胞中所產生的游離脂肪酸部分的方法。在此所例示的植物棕櫚酰基-ACP硫酯酶序列包括Cuphea、leek、mango和elm。還提供了由于這些棕櫚酰基-ACP硫酯酶序列的表達而使種子中C16:0脂肪酸的水平提高的轉基因植物。
[0012]W000/09721關于一種增加作為大豆種子中所存在的總甘油三酸酯的組分的硬脂酸酯的方法。這種方法一般包含種植具有整合到基因組中的DNA構筑體的大豆植物，這種DNA構筑體在轉錄的5’到3’方向上包含:在大豆植物種子細胞中發揮功能的啟動子、編碼對C18:0酰基-ACP底物具有實質活性的酰基-ACP硫酯酶蛋白的DNA序列，以及在植物細胞中發揮功能的轉錄終止區。這個文獻還提供了一種大豆種子，其具有約33重量％或更多的硬脂酸酯作為種子甘油三酸酯中所存在的總脂肪酸的組分。
[0013]US2010/033329描述了使用酰基-CoA結合蛋白來增強經過遺傳修飾的植物的低溫耐受性的方法。
[0014]US2009/0291479描述了操縱酰基-CoA結合蛋白用于改變微生物宿主中的脂質產生。
[0015]US7, 880，053描述了在植物修復中使用表達來源于植物的酰基-輔酶A結合蛋白的轉化植物的方法。
[0016]US2008/0229451描述了在植物中表達微生物蛋白以產生具有改善特性的植物。
[0017]生物合成路徑的`反饋調控通過將對代謝物的需求傳達給供應其的酶來優化細胞經濟。典型地，當下游代謝物積累并且使得用于其自身產生的限速酶受抑制，從而限制通過整個路徑的通量時，反饋發生。不幸的是，這些機制當未知或了解不足時，可能成為成功代謝工程的阻礙。植物脂肪酸生物合成為靶向顯示反饋抑制的操縱的此類路徑之一(Ramli等人 2002，Biochem J, 364，385-391 ；Shintani 和 0hlroggel995, Plant J, 7，577-587 ；Terzaghi 1986Plant Physiol, 82，780-786)。然而，尚未確定反饋的機制和目標。對這個基本過程的更充分理解將有助于在增加植物中的脂肪酸產生方面的未來工程嘗試的設計和分析。
[0018]動物、真菌和細菌具有關于脂肪酸生物合成的反饋調控的已知機制。其中的共同特征為乙酰基-CoA羧化酶(ACCase，EC6.4.1.2)的抑制，其單獨產生用于脂肪酸合成的丙二酰基-CoA并且被視為脂肪酸合成的限速步驟(Cronan和Waldrop2002ProgLipid Res, 41,407-435 ；0hlrogge 和 Jaworski1997Rev Plant Physiol Plant MolBiol, 48，109-136 ；ffakil 等人 1983Annu Rev Biochem, 52，537-579)。在大鼠和酵母中，脂肪酸合成的最終產物棕櫚酰基-CoA結合到ACCase上并抑制ACCase (Ogiwara等人1978Eur J Biochem, 89，33-41 )。另外，酵母ACCase和脂肪酸合酶(FAS)基因表達通過以酰基-CoA依賴性方式整夜暴露于長鏈脂肪酸而降低(Feddersen等人2007BiochemJ，407，219-230)。細菌具有類似反應。大腸桿菌ACCase和P -酮基酰基-酰基載體蛋白合酶(KAS)兩者都受脂肪酸合成中間物長鏈(C16-C18)酰基-酰基載體蛋白(酰基-ACP)抑制(Davis 和 Cronan2001J Bacteriol, 183, 1499-1503 ；Heath 和 Rockl995J BioiChem, 270, 15531-15538)。在外源脂肪酸存在下生長通過長鏈酰基-ACP或酰基-CoA與轉錄因子的相互作用也使細菌脂肪酸生物合成基因(包括ACCase)受抑制(Zhang和Rock2009J.Lipid Res, 50增刊，S115-119)。基于這些研究，已浮現出一幅畫面，其中對從頭脂肪酸的較低需求是通過酰基-ACP和/或酰基-CoA的積累而發信號。這些代謝物變構抑制ACCase并且因此可以快速限制用于脂肪酸合成的丙二酰基-CoA的產生。在抑制ACCase之后酰基-ACP和酰基-CoA的水平并未降低的情況下，整個脂肪酸生物合成路徑的基因表達受抑制。組合起來，這些反應在細胞需求短期和長期減少的時段內防止脂肪酸不必要的產生。
[0019]關于植物中脂肪酸合成的反饋調控的機制尚未確定。吐溫-脂肪酸酯有效補給脂肪酸(Terzaghil986Plant Physiol, 82，771-779)，并且已顯示在以下植物中引起反饋抑制:煙草(Shintani 和 0hlroggel995, Plant J.7，577-587)和大豆(Terzaghil986PlantPhysiol, 82，780-786)細胞培養物，以及油棕櫚和橄欖愈傷組織(Ramli等人2002BiochemJ，364，385-391)。基于煙草中酰基-ACP的合成速率和ACCase蛋白水平，Shintani和Ohlrogge假定反饋通過ACCase和可能存在的FAS的生物化學或翻譯后修飾而發生。經過純化的玉米和娃藻ACCase受:掠桐酸基-CoA抑制(Nikolau和Hawkel984Arch BiochemBiophys, 228，86-96 ；Roesslerl990Planta, 198，517-525)，但長鏈酰基-ACP 未能抑制來自蓖麻和豌豆的部分純化的ACCase(Roesler等人1996Planta, 198, 517-525)。然而，中鏈酰基-ACP抑制芥花和菠菜的粗提取物中的KAS活性(Bruck等人1996Planta，198，271-278)。這些結果與反饋抑制的關聯尚不明朗，因為尚未測量在反饋期間酰基-CoA或酰基-ACP的穩態庫的變化。由于在質體中和細胞溶質中存在分別負責脂肪酸合成和伸長的結構上不同的ACCase和FAS系統，因此這種情況進一步牽涉到植物中。細胞溶質伸長路徑是否對反饋有反應是未知的。先前研究使用營養組織或發芽幼苗來建立細胞培養物，并且因此也不知曉反饋是否在需要高速脂肪酸合成的組織(諸如油籽)中發生。
[0020]因此，現有技術缺乏乙酰基-CoA羧化酶的哪個同種型在植物中受到反饋抑制以及哪些分子負責反饋抑制的教示。如下文所描述，這個問題已得到解決，從而防止或避免植物細胞、植物部分、植物組織、種子和植物中乙酰基-CoA羧化酶的反饋抑制，以達到增加脂肪酸合成和油合成的目的，如從不同實施方案和權利要求書中顯而易見。
發明概要
[0021]在一個實施方案中，本發明關于一種用以增加植物細胞中的油含量的方法，其包含防止植物細胞中的質體乙酰基CoA-羧化酶受18:1-輔酶A或18:1-酰基載體蛋白的反饋抑制的步驟。這種防止反饋抑制可以通過提供具有乙酰基Cok-羧化酶變體酶或其亞單元的植物細胞(包括提供植物細胞的質體)來實現，這種乙酰基CoA-羧化酶變體酶或其亞單元與植物的野生型乙酰基CoA-羧化酶相比對反饋抑制的敏感性較小。敏感性較小的乙酰基CoA-羧化酶變體酶或其亞單元可以由植物細胞中的變體等位基因編碼或可以由引入到植物細胞中的轉基因編碼。
[0022]在本發明的另一個實施方案中，提供一種用以增加植物細胞中的油含量的方法，其包含防止植物細胞中的質體乙 酰基CoA-羧化酶受18:1-輔酶A或18:1-酰基載體蛋白的反饋抑制的步驟，其中植物細胞具有來自使用3-羥基丙酸循環進行碳固定的生物體的乙酰基CoA-羧化酶或其一個或多個亞單元，例如來自從以下組中選出的生物體的乙酰基CoA-羧化酶或其亞單元:硫化葉菌目(Sulfolobales)、餐古菌目(Cenarchaeles)、古生球菌目(Archeaoglobales)、除硫球菌目(Desulfurococcales)、熱變形菌目(Thermoproteales)> 熱球菌目(Thermococcales)或鹽桿菌目(Halobacterales)0 乙酰基CoA-羧化酶或其亞單元可以來源于從以下組中選出的生物體:勤奮金屬球菌(Metallosphaera sedula)、布氏酸菌(Acidianus brierleyi)、硫橫礦硫化葉菌(Sulfolobus solfataricus)、Sulfolobus tokodai1、嗜酸熱硫化葉菌(Sulfolobusacidocaldaricus)、Cenarcheum symbiosum、閃爍古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)、丁酸棲高溫菌(Hyperthermus butylicus)、海生葡萄狀嗜熱菌(Staphylotthermusmarinus)、依賴熱絲菌(Thermofilum pendens)、Ingicoccus hospitalis、Pyobaculumaerophilum、冰島熱棒菌(Pyrobaculum islandicum)、坎地熱棒菌(Pyrobaculumcalidifontis)、激烈熱棒菌(Pyrobaculum furisous)、深海熱棒菌(Pyrobaculumabyssi)> 掘越氏熱棒菌(Pyrobaculum horykoshii)、死海鹽盒菌(Haloarculamarismortui )、鹽桿菌屬(Halobacterium sp.) NRC-1> Haloquatratum walsby1、湖淵鹽紅菌(Halorubrum Iacusprofundi)或法老鹽喊單抱菌(Natromonas pharaonis)。植物細胞還可以具有來自橙色綠屈撓菌(Chloroflexus auranticus)的乙酰基CoA-羧化酶或其亞單元。
[0023]在本發明的另一個實施方案中，提供一種用以增加植物細胞中的油含量的方法，其包含提供植物細胞的步驟，這種植物細胞具有包含以下可操作地連接的DNA片段的DNA分子:
[0024]a)植物可表達啟動子；
[0025]b)編碼一個或多個乙酰基CoA-羧化酶亞單元的一個或多個編碼區，其具有從氨基酸序列SEQ ID N0.2、3、5、7、9、11、13、15、17或19中選出的氨基酸序列，優選地為異源編碼區；或與從氨基酸序列SEQ ID N0.2、3、5、7、9、11、13、15、17或19中選出的氨基酸序列具有 70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%`、96%、97%、98% 或 99% 序列一致性并且具有乙酰基 CoA羧化酶酶促活性的編碼區；以及任選地
[0026]c)在植物細胞中發揮功能的轉錄終止和/或聚腺苷酸化區。
[0027]DNA分子可以進一步包含編碼葉綠體靶向肽的DNA區。編碼區可以從以下核苷酸序列中選出:從位置331的核苷酸到位置1860的核苷酸的SEQ ID N0.1、從位置1860的核苷酸到位置 2360 的核苷酸的 SEQ ID N0.USEQ ID N0.4、SEQ ID No6、SEQ ID No8、SEQ IDNo 10,SEQ ID Nol2、SEQ ID Nol4、SEQ ID No 16 或 SEQ ID Nol8，或與其具有 70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%核苷酸序列一致性的編碼區。在一個特定實施方案中，植物可表達啟動子為在質體中表達的啟動子并且其中終止和/或聚腺昔Ife化區為在質體中發揮功能的轉錄終止區。DNA分子可以被整合于植物細胞的核基因組中，或者，DNA分子可以被整合于植物細胞的質體的基因組中。植物細胞還可以含有多于一個DNA分子，其各自表達乙酰基-CoA羧化酶的一個亞單元。
[0028]本發明還提供一種用以增加植物細胞中的油含量的方法，其包含防止植物細胞中的質體乙酰基CoA-羧化酶受18:1-輔酶A或18:1-酰基載體蛋白的反饋抑制的步驟，其中防止反饋抑制是通過降低植物細胞的質體中18:1-輔酶A或18:1-酰基載體蛋白的水平來實現。一個降低質體中18:1-輔酶A或18:1-酰基載體蛋白的水平的替代實施方案是通過增加細胞質體中FATA酶的水平。為此，可以將包含以下各項的DNA分子引入到植物細胞中:植物可表達啟動子，可操作地連接到編碼FATA酶的DNA區，這種FATA酶為例如具有從以下各項中選出的氨基酸序列的FATA酶:氨基酸序列SEQ ID21，或與其具有70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的氨基酸序列；以及任選地，在植物細胞中發揮功能的轉錄終止和/或聚腺苷酸化區。此外，DNA分子可以進一步包含編碼葉綠體靶向肽的DNA區，或植物可表達啟動子為在質體中表達的啟動子并且其中終止和/或聚腺苷酸化區為轉錄終止區
[0029]在本發明的另一個實施方案中，提供一種用于增加植物細胞中的油含量的方法，其包含防止植物細胞中的質體乙酰基CoA-羧化酶受18:1-輔酶A或18:1-酰基載體蛋白的反饋抑制的步驟，其中降低質體中18:1-輔酶A或18:1-酰基載體蛋白的水平是通過提高植物細胞中酰基-Cok結合蛋白的水平來實現。為此，可以將DNA分子引入到植物細胞中，其中DNA分子包含可操作地連接到編碼酰基-CoA結合蛋白的DNA區的植物可表達啟動子；以及任選地，在植物細胞中發揮功能的轉錄終止和/或聚腺苷酸化區。酰基-CoA結合蛋白可以包含從以下各項中選出的氨基酸序列:SEQ ID No23或SEQ ID No25中任一項的氨基酸序列，或與其具有 70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 序列一致性的氨基酸序列。
[0030]在所提及的任一 種方法中，植物細胞可以再生到植物中。因此，本發明還提供了如上文所描述的方法，其中植物細胞是在植物中；并且其中油含量是在植物的儲油部分(如種子)中得到增加。
[0031]這些方法可以應用于任何植物，但尤其適用于產油植物，如油菜，包括歐洲油菜(Brassica napus)、蕓笞(Brassica campestris (rapa))、芥菜(Brassica juncea)或埃塞俄比亞芥(Brassica carinata),向日葵、紅花、大豆、棕櫚、麻風樹、亞麻、海甘藍、亞麻莽、玉米、芝麻、蓖麻子。
[0032]本發明進一步提供一種植物，其包含一個或多個質體ACCase變體酶或其亞單元，這種質體ACCase變體酶或其亞單元與植物的野生型乙酰基CoA-羧化酶相比對18:1-輔酶A或18:1-酰基載體蛋白作出的反饋抑制的敏感性較小，例如來自使用3-羥基丙酸循環進行碳固定的生物體的CoA-羧化酶或其亞單元，特別是，其中乙酰基CoA-羧化酶或其亞單元來自從以下組中選出的生物體:硫化葉菌目、餐古菌目、古生球菌目、除硫球菌目、熱變形菌目、熱球菌目或鹽桿菌目，例如勤奮金屬球菌、布氏酸菌、硫磺礦硫化葉菌、Sulfolobustokodai1、嗜酸熱硫化葉菌、Cenarcheum symbiosum、閃爍古生球菌、丁酸棲高溫菌、海生葡萄狀嗜熱菌、依賴熱絲菌、Ingicoccus hospitalis、Pyobaculum aerophilum、冰島熱棒菌、坎地熱棒菌、激烈熱棒菌、深海熱棒菌、掘越氏熱棒菌、死海鹽盒菌、鹽桿菌屬NRC-1、Haloquatratum walsby1、湖淵鹽紅菌或法老鹽堿單孢菌。乙酰基CoA-羧化酶或其亞單元還可以來自橙色綠屈撓菌。
[0033]在另一個替代實施方案中，本發明提供一種植物，其包含有包含以下可操作地連接的DNA片段的DNA分子:
[0034]a.植物可表達啟動子；
[0035]b.編碼一個或多個乙酰基CoA-羧化酶亞單元的一個或多個編碼區，其具有從氨基酸序列SEQ ID N0.2、3、5、7、9、11、13、15、17或19中選出的氨基酸序列，優選地為異源編碼區；或與從氨基酸序列SEQ ID N0.2、3、5、7、9、11、13、15、17或19中選出的氨基酸序列具有 70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 序列一致性并且具有乙酰基 CoA羧化酶酶促活性的編碼區，例如包含以下核苷酸序列的編碼區:從位置331的核苷酸到位置I860的核苷酸的SEQ ID N0.1、從位置1860的核苷酸到位置2360的核苷酸的SEQ IDN0.1、SEQ ID N0.4、SEQ ID No6、SEQ ID No8、SEQ ID No 10, SEQ ID Nol2、SEQ ID Nol4、SEQ ID Nol6 或 SEQ ID Nol8，或與其具有 70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或99%核苷酸序列一致性的編碼區；以及任選地
[0036]c.在植物細胞中發揮功能的轉錄終止和/或聚腺苷酸化區。
[0037]DNA分子可以進一步包含編碼葉綠體靶向肽的DNA區，或植物可表達啟動子可以為在質體中表達的啟動子并且終止和/或聚腺苷酸化區可以為在質體中發揮功能的轉錄終止區。植物細胞還可以含有多于一個DNA分子，其各自表達乙酰基-CoA羧化酶的一個亞單元。
[0038]本發明進一步提供如本文所描述的植物的細胞、組織、儲油組織或種子，以及從這種植物產生的油。
[0039]本發明的另一個目的為提供一種嵌合DNA，其包含以下可操作地連接的DNA片段:`[0040]a.植物可表達啟動子；
[0041]b.編碼一個或多個乙酰基CoA-羧化酶亞單元的一個或多個編碼區，其具有從氨基酸序列SEQ ID N0.2、3、5、7、9、11、13、15、17或19中選出的氨基酸序列，優選地為異源編碼區；或與從氨基酸序列SEQ ID N0.2、3、5、7、9、11、13、15、17或19中選出的氨基酸序列具有 70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 序列一致性并且具有乙酰基 CoA羧化酶酶促活性的編碼區；以及任選地
[0042]c.在植物細胞中發揮功能的轉錄終止和/或聚腺苷酸化區。
[0043]因此，本發明關于與植物細胞的質體中的野生型乙酰基CoA-羧化酶相比對18:1-輔酶A或18:1-酰基載體蛋白作出的反饋抑制的敏感性較小的乙酰基CoA-羧化酶變體酶或其亞單元的用途，其用于增加植物細胞中的油含量。
[0044]在本發明的另一個實施方案中，提供一種用以分離與植物的野生型乙酰基CoA-羧化酶相比對18:1-輔酶A或18:1-酰基載體蛋白作出的反饋抑制的敏感性較小的質體乙酰基CoA-羧化酶或其亞單元的變體的方法，其包含以下步驟:
[0045]a.產生一大批來源于優選來自植物的反饋抑制敏感性CoA-羧化酶的變體乙酰基CoA-羧化酶或其亞單元；
[0046]b.在18:1-輔酶A或18:1-酰基載體蛋白或18:1吐溫存在下鑒別變體乙酰基CoA-羧化酶或其亞單元中每一種的酶促活性；[0047]c.分離在18:1-輔酶A或18:1-酰基載體蛋白或18:1吐溫存在下與反饋抑制敏感性CoA-羧化酶的酶促活性相比具有較大酶促活性的那些酶變體或其亞單元。
[0048]本發明還提供一種用以增加植物細胞中的油含量的方法，其包含以下步驟:分離與植物的野生型乙酰基CoA-羧化酶相比對18:1-輔酶A或18:1-酰基載體蛋白作出的反饋抑制的敏感性較小的乙酰基CoA-羧化酶或其亞單元的變體；以及將乙酰基CoA-羧化酶或其亞單元的變體引入到植物細胞中，優選地通過從編碼乙酰基CoA-羧化酶或其亞單元的DNA構筑體轉錄。
[0049]本發明的另一個目的為一種用以分離包含編碼乙酰基CoA-羧化酶變體酶(如質體乙酰基CoA-羧化酶變體酶)或其亞單元的變體等位基因的植物細胞或植物的方法，這種乙酰基CoA-羧化酶變體酶或其亞單元與植物的野生型乙酰基CoA-羧化酶相比對18:1-輔酶A或18:1-酰基載體蛋白作出的反饋抑制的敏感性較小，這種方法包含以下步驟:
[0050]a.提供植物細胞或植物的群體，其包含一大批變體乙酰基CoA-羧化酶或其亞單元;
[0051]b.在18:1-輔酶A或18:1-酰基載體蛋白或18:1吐溫存在下鑒別變體乙酰基CoA-羧化酶或其亞單元中每一種的酶促活性；
[0052]c.分離包含在18:1-輔酶A或18:1-酰基載體蛋白存在下與反饋抑制敏感性CoA-羧化酶的酶促活性相比具有較大酶促活性的酶變體或其亞單元的那些植物細胞或植物；
[0053]以及通過這種方法獲得的植物細胞或植物。
[0054]本發明進一步關于一種生產食物、飼料或工業產品的方法，其包含獲得如本文所描述的植物以及從這種植物或其部分制備食物、飼料或工業產品的步驟。食物或飼料可以為油、粗粉、谷物、淀粉、面粉或蛋白質；或工業產品可以為生物燃料、纖維、工業化學品、醫藥品或營養保健品。
[0055]附圖簡述
[0056]圖1- (a)生長，(b)蛋白質組成，以及(C)在多種濃度的吐溫-80下生長的細胞的脂質概況。
[0057]圖2-在多種濃度的吐溫-80下生長8天之后歐洲油菜(B.napus)細胞中的脂肪酸含量。(a)極性脂質中的脂肪酸。(b)三酰甘油(TAG)中的脂肪酸。(c)總脂肪酸含量。所有數據都是平均值土SD (n=3)。FW，鮮重。
[0058]圖3-歐洲油菜細胞從13C-油酰基-吐溫中吸收脂肪酸的定量。當向細胞補給10mM13C-油酰基-吐溫時13C-脂肪酸出現在(a)極性脂質和(b)三酰甘油(TAG)中的時程。暗區為未標記的內源脂肪酸并且亮區為來自吐溫的13C-脂肪酸。個別脂肪酸種類列在每個圖的左上角。所有數據都是平均值土SD (n=3)。FW，鮮重。
[0059]圖4-在吐溫-80存在下歐洲油菜細胞對脂質的14C-乙酸鹽標記的抑制。(a)顯示在IOmM吐溫-80存在下14C-乙酸鹽并入到總脂質中的時程。(b)暴露于多種濃度的吐溫-80達3小時之后總脂質的14C-乙酸鹽標記。(c)暴露于IOmM吐溫-80達3小時之后在去除吐溫-80之后總脂質的14C-乙酸鹽標記的時程。所有數據都是平均值土SD (n=3)。
[0060]圖5-在存在或不存在吐溫-80的情況下14C-乙酸鹽并入到(a)甾醇和(b)游離脂肪酸中的情況。[0061]圖6-在吐溫-80補給3小時之后歐洲油菜細胞中質體ACCase的特異性抑制。(a)在IOmM吐溫-80補給3小時之后相對14C-乙酸鹽并入到個別脂肪酸中的情況。(b)在IOmM吐溫-80補給3小時之后由多種濃度的氟吡甲禾靈(haloxyfop)補給的細胞將14C-乙酸鹽并入到總脂質中的情況。(c)在IOmM吐溫-80補給3小時之后來自14C-丙二酸鹽和14C-乙酸鹽的標記并入到16和18碳脂肪酸中的情況。所有數據都是平均值土SD (n=3)。
[0062]圖7- (a)氟吡甲禾靈、(b)磷酸酶處理和2-氧化戊二酸以及(c)吐溫-80對來自粗細胞提取物的ACCase酶活性的影響。
[0063]圖8-丙二酸鹽對(a)極性脂質和(b)TAG中的脂肪酸含量以及對(C)脂質的14C-乙酸鹽標記的影響。
[0064]圖9-在吐溫-80補給3小時之后歐洲油菜細胞中的脂質中間物的定量。在IOmM吐溫-80補給3小時之后細胞中的(a)游離脂肪酸(FFA)、(b)酰基-ACP以及(c)酰基-Cok含量。當存在時，數字代表在IOmM13C-油酰基-吐溫補給3小時之后13C標記的18:1的百分比。所有數據都是平均值土SD (n=3)。
[0065]圖10-脂質中間物對粗歐洲油菜細胞提取物中的ACCase活性的影響。(a)10 μ M游離脂肪酸對粗提取物中的ACCase活性的影響。(b)歐洲油菜16:0-ACP和18:1-ACP對粗提取物中的ACCase活性的影響。(C)多種長鏈酰基-CoA對粗提取物中的ACCase活性的影響。所有數據都是平均值土 SD (n=3)。
[0066]圖11-脂肪酸合成的反饋抑制的建議機制的模型。質體ACCase受18:1-ACP和18:1-CoA抑制。這些代謝物為在質體內從頭脂肪酸合成的產物，或從吐溫-18:1所提供的外源脂肪酸合成。可以產生或消耗18:1-ACP或18:1-CoA并且因此參與調控18:1-ACP或18:1-CoA的反應以箭頭指示。
`[0067]圖12-與不存在ACCase亞單元的情況下(EVL:空載體系列)經過骨架T-DNA載體轉化的擬南芥(Arabidopsis thaliana)系列的種子油含量相比，過度表達Cenarcheumsymbiosum的ACCase亞單元(ACCase系列)的擬南芥系列的種子油含量。基于對每個系列3個種子樣品的分析來確定脂肪酸甲酯(FAME)濃度。所分析的種子為T2-種子。
[0068]發明的各種實施方案描述
[0069]本發明是基于鑒別在脂肪酸生物合成中實現初始步驟的反饋抑制的目標和分子。如下文所展示，特別是在實施例中，本
【發明者】已鑒別，在植物中，其特定地為受到反饋抑制的質體異質型乙酰基-CoA羧化酶，并且效應分子特定地為油酰基-ACP和油酰基-CoA。
[0070]因此，本發明提供一種用于增加植物細胞中的油含量的方法，其包含防止這種植物的這些細胞中的質體乙酰基CoA-羧化酶受18:1-輔酶A或18:1-酰基載體蛋白的反饋抑制的步驟。
[0071]在本發明的第一實施方案中，通過提供具有乙酰基CoA羧化酶變體酶或其亞單元的植物細胞、尤其植物細胞的質體來防止反饋抑制，這種乙酰基CoA羧化酶變體酶或其亞單元與植物的相應野生型乙酰基CoA-羧化酶相比對這種反饋抑制的敏感性較小。
[0072]如本文所用的“乙酰基-CoA羧化酶”(ACC)E.C.編號6.4.1.2為催化脂肪酸生物合成中的第一關鍵酶促步驟的生物素依賴性酶，即，通過其兩種催化活性的生物素羧化酶(BC)和羧基轉移酶(CT)使乙酰基-CoA不可逆地羧化產生丙二酰基-CoA。初始部分反應是由生物素羧化酶催化并且使用碳酸氫鹽和ATP經由羧基磷酸鹽中間物來羧化經賴氨酸殘基連接到生物素羧基載體蛋白(BCCP)上的生物素輔基。
[0073]HC(V+ATP+BCCP=>ADP+P i +BCCP-COO-
[0074]羧基然后被轉移到受體乙酰基-輔酶A上以產生丙二酰基-輔酶A，這是由羧基轉移酶催化的反應。
[0075]BCCP-C0CT+ 乙酰基 _CoA=> 丙二酰基-CoA+BCCP
[0076]ACC已在大多數活的生物體中發現，包括古細菌、細菌、酵母、真菌、植物、動物和人類。在大多數真核生物中，ACC為多域酶(同質型)，其中BC、BCCP和CT活性位于大的多肽(>200kDa)上。原核生物具有由若干多肽組成的多亞單元ACC，這些多肽由不同基因編碼。生物素羧化酶(BC)活性、生物素羧基載體蛋白(BCCP)各自含于不同亞單元上，其編碼基因通常分別被稱為accC和accB。羧基轉移酶(CT)活性分裂為兩種肽，羧基轉移酶(由accA編碼)和(6-羧基轉移酶(由accD編碼)。在古細菌中，a和0亞單元是由一個基因編碼。除禾本科以外的大多數植物含有“原核”異質型和“真核”同質型兩者。異質型位于質體中并且用于脂肪酸的從頭合成。三個編碼基因(用于生物素羧化酶、生物素羧基載體蛋白和a-羧基轉移酶亞單元)是核編碼的，而編碼3 -羧基轉移酶的基因位于質體基因組中。同質型位于質體外的細胞溶質中。禾本科不含有ACC的“原核”形式，但在質體和細胞溶質兩者中都含有同質型。
[0077]用于測量ACC活性的試驗在本領域中眾所周知，并且包括例如Howard和Ridley, 1990 (FEBS Letters261, 2，261-2641990年2月)所描述的利用磷酸鹽的測量結果來估算酶促活性的試驗或 Kroeger 等人，2011 (Analytical Biochemistry411, 100-105)所描述的分光光度試驗。
[0078]編碼來自植物的ACC多域蛋白或ACC亞單元的眾多基因已經被分離出，并且ACC多域蛋白或ACC亞單元的蛋白`序列可以在資料庫中找到。擬南芥同質型ACC蛋白的氨基酸序列可以例如在編錄號NP_174850 (乙酰基-CoA羧化酶2)或NP_174849 (乙酰基-CoA羧化酶2)下找到。NP_197143 (ACC1的生物素羧基載體蛋白)、NP_001031968 (生物素羧化酶)、NP_850291 (羧基轉移酶亞單元a )和ACCD_ARATH (羧基轉移酶亞單元P )代表擬南芥異質型ACC的不同亞單元的氨基酸序列。
[0079]歐洲油菜、甘藍(Brassica oleracea)、蕓苔和芥菜的同質型ACC蛋白的氨基酸序列或異質型蛋白的不同亞單元的氨基酸序列的編錄號可以在下表1到5中找到。所有氨基酸序列特此以引用的方式并入。
[0080]表1:來自蕓苔屬的同質型乙酰基CoA羧化酶
[0081]
歐洲油菜 j長度(AA)~[TO~j長度(AA)~[WW j長度(AA)~~j長度(AA)
CBU86998 2321ABA1005~1065
CBV09123 2304ABA1006~1063
CBV09287 2321ABA1007~1065
CAA54683 2304
【權利要求】
1.一種用以增加植物細胞中的油含量的方法，其包含防止所述植物的所述細胞中的質體乙酰基CoA羧化酶受18:1-輔酶A或18:1-酰基載體蛋白的反饋抑制的步驟。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述防止反饋抑制是通過提供具有乙酰基CoA-羧化酶變體酶或其亞單元的植物細胞、尤其植物細胞的質體來實現，所述乙酰基CoA-羧化酶變體酶或其亞單元與所述植物的野生型乙酰基CoA-羧化酶相比對所述反饋抑制的敏感性較小。
3.根據權利要求2所述的方法，其中所述敏感性較小的乙酰基CoA-羧化酶變體或其亞單元是由所述植物細胞中的變體等位基因編碼。
4.根據權利要求2所述的方法，其中所述敏感性較小的乙酰基CoA-羧化酶變體或其亞單元是由引入到所述植物細胞中的轉基因編碼。
5.根據權利要求2所述的方法，其中所述植物細胞具有來自使用3-羥基丙酸循環進行碳固定的生物體的乙酰基CoA-羧化酶或其亞單元。
6.根據權利要求5所述的方法，其中所述乙酰基CoA-羧化酶或其亞單元是來自從以下組中選出的生物體:硫化葉菌目、餐古菌目、古生球菌目、除硫球菌目、熱變形菌目、熱球菌目或鹽桿菌目。
7.根據權利要求5所述的方法，其中所述乙酰基CoA-羧化酶或其亞單元是來自從以下組中選出的生物體:勤奮金屬球菌、布氏酸菌、硫磺礦硫化葉菌、Sulfolobus tokodai1、嗜酸熱硫化葉菌、Cenarcheum symbiosum、閃爍古生球菌、丁酸棲高溫菌、海生葡萄狀嗜熱菌、依賴熱絲菌、Ingicoccus hospitalis、Pyobaculum aerophilum、冰島熱棒菌、坎地熱棒菌、激烈熱棒菌、深海熱棒菌、掘越氏熱棒菌、死海鹽盒菌、鹽桿菌屬NRC-1、Haloquatratumwalsby1、湖淵鹽紅菌或法老鹽堿單孢菌。
8.根據權利要求5所述的方法，其中所述乙酰基CoA-羧化酶或其亞單元是來自從以下組中選出的生物體:勤奮金屬球菌、布氏酸菌或Cenarcheum symbiosum。
9.根據權利要求2所述的方法，其中所述植物細胞具有來自橙色綠屈撓菌的乙酰基CoA-羧化酶或其亞單元。
10.根據權利要求2所述的方法，其中所述植物細胞具有SEQID No46-128中任一項的乙酰基CoA-羧化酶或其亞單元。
11.根據權利要求6至10中任一項所述的方法，其中所述植物細胞具有包含以下可操作地連接的DNA片段的DNA分子: a)植物可表達啟動子； b)編碼一個或多個乙酰基CoA-羧化酶亞單元的一個或多個編碼區，其具有從氨基酸序列SEQ ID N0.2、3、5、7、9、11、13、15、17或19中選出的氨基酸序列，優選地為異源編碼區；或與從氨基酸序列SEQ ID如.2、3、5、7、9、11、13、15、17或19中選出的氨基酸序列具有70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 序列一致性并且具有乙酰基 CoA 羧化酶酶促活性的編碼區；以及任選地 c)在植物細胞中發 揮功能的轉錄終止和/或聚腺苷酸化區。
12.根據權利要求11所述的方法，其中所述DNA分子進一步包含編碼葉綠體靶向肽的DNA 區。
13.根據權利要求11或12所述的方法，其中所述編碼區包含以下核苷酸序列:從位置331的核苷酸到位置1860的核苷酸的SEQ ID N0.1、從位置1860的核苷酸到位置2360的核苷酸的 SEQ ID N0.USEQ ID N0.4、SEQ ID No6、SEQ ID N0.8、SEQ ID N0.10、SEQ IDN0.12,SEQ ID N0.14,SEQ ID N0.16 或 SEQ ID N0.18，或與其具有 70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%核苷酸序列一致性的編碼區。
14.根據權利要求11或13所述的方法，其中所述植物可表達啟動子為在質體中表達的啟動子并且其中所述終止和/或聚腺苷酸化區為在質體中發揮功能的轉錄終止區。
15.根據權利要求11至13中任一項所述的方法，其中所述DNA分子被整合于所述植物細胞的核基因組中。
16.根據權利要求11、13或14所述的方法，其中所述DNA分子被整合于所述植物細胞的質體的基因組中。
17.根據權利要求1所述的方法，其中所述防止反饋抑制是通過降低所述植物細胞的質體中18:1_輔酶A或18:1-酰基載體蛋白的水平來實現。
18.根據權利要求17所述的方法，其中所述降低質體中18:1-輔酶A或18:1-酰基載體蛋白的水平是通過提高所述細胞的所述質體中FATA酶的水平來實現。
19.根據權利要求18所述的方法，其中所述FATA酶的水平是通過將包含以下可操作地連接的DNA片段的DNA分子引入到所述植物細胞中來提高: a)植物可表達啟動子； b)編碼FATA酶的DNA區；以及任選地 c)在植物細胞中發揮功能的 轉錄終止和/或聚腺苷酸化區。
20.根據權利要求19所述的方法，其中所述FATA酶包含從以下各項中選出的氨基酸序列:氨基酸序列 SEQ ID No21，或與其具有 70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或99%序列一致性的氨基酸序列。
21.根據權利要求19所述的方法，其中編碼所述FATA酶的所述DNA區包含來自以下任一項的核苷酸序列:核苷酸序列SEQ ID No20，或與其具有70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的核苷酸序列。
22.根據權利要求20或21所述的方法，其中所述DNA分子進一步包含編碼葉綠體靶向肽的DNA區。
23.根據權利要求20或21所述的方法，其中所述植物可表達啟動子為在質體中表達的啟動子并且其中所述終止和/或聚腺苷酸化區為在質體中發揮功能的轉錄終止區。
24.根據權利要求17所述的方法，其中所述降低質體中18:1_輔酶A或18:1_酰基載體蛋白的水平是通過提高所述植物細胞中酰基-CoA結合蛋白的水平來實現。
25.根據權利要求24所述的方法，其中所述酰基-CoA結合蛋白的水平是通過將包含以下可操作地連接的DNA片段的DNA分子引入到所述植物細胞中來提高: a)植物可表達啟動子； b)編碼酰基-Cok結合蛋白的DNA區；以及任選地c)在植物細胞中發揮功能的轉錄終止和/或聚腺苷酸化區。
26.根據權利要求25所述的方法，其中所述酰基-CoA結合蛋白包含從以下各項中選出的氨基酸序列:SEQ ID No23或SEQ ID No25中任一項的氨基酸序列，或與其具有70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 序列一致性的氨基酸序列。
27.根據權利要求1至26中任一項所述的方法，其中所述植物細胞是在植物中。
28.根據權利要求1至26中任一項所述的方法，其中所述油含量是在所述植物的儲油部分中得到增加。
29.根據權利要求28所述的方法，其中所述油含量是在所述植物的種子中得到增加。
30.根據權利要求1至29中任一項所述的方法，其中所述植物是從以下各項中選出的產油植物:油菜、向日葵、紅花、大豆、棕櫚、麻風樹、亞麻、海甘藍、亞麻薺、玉米、芝麻、蓖麻子。
31.根據權利要求30所述的方法，其中所述植物是歐洲油菜、蕓苔、芥菜、埃塞俄比亞芥。
32.一種植物，其質體中包含一個或多個ACCase變體酶或其亞單元，所述ACCase變體酶或其亞單元與所述植物的野生型乙酰基Cok-羧化酶相比對18:1-輔酶A或18:1-酰基載體蛋白作出的反饋抑制的敏感性較小。
33.根據權利要求32所述的植物，其中所述乙酰基CoA-羧化酶或其亞單元是來自使用3-羥基丙酸循環進行碳固定的生物體。
34.根據權利要求33所述的植物，其中所述乙酰基CoA-羧化酶或其亞單元是來自從以下組中選出的生物體:硫化葉菌目、餐古菌目、古生球菌目、除硫球菌目、熱變形菌目、熱球菌目或鹽桿菌目。
35.根據權利要求34所述的植物，其中所述乙酰基CoA-羧化酶或其亞單元是來自從以下組中選出的生物體:勤奮金屬球菌、布氏酸菌、硫磺礦硫化葉菌、Sulfolobus tokodai1、嗜酸熱硫化葉菌、Cenarcheum symbiosum、閃爍古生球菌、丁酸棲高溫菌、海生葡萄狀嗜熱菌、依賴熱絲菌、Ingicoccus hospitalis、Pyobaculum aerophilum、冰島熱棒菌、坎地熱棒菌、激烈熱棒菌、深海熱棒菌、掘越氏熱棒菌、死海鹽盒菌、鹽桿菌屬NRC-1、Haloquatratumwalsby1、湖淵鹽紅菌或法老鹽堿單孢菌。
36.根據權利要求33所述的植物，其中所述乙酰基CoA-羧化酶或其亞單元是來自從以下組中選出的生物體:勤奮金屬球菌、布氏酸菌或Cenarcheum symbiosum。
37.根據權利要求32所述的植物，其中所述乙酰基CoA-羧化酶或其亞單元是來自橙色綠屈撓菌。
38.根據權利要求32所述的植物，其包含有包含以下可操作地連接的DNA片段的DNA分子: a)植物可表達啟動子； b)編碼一個或多個乙酰基CoA-羧化酶亞單元的一個或多個編碼區，其具有從氨基酸序列SEQ ID如2、3、5、7、9、11、13、15、17或19中選出的氨基酸序列，優選地為異源編碼區；或與從氨基酸序列 SEQ ID No2、3、5、7、9、ll、13、15、17 或 19 或 SEQ ID No46_128 中任一項中選出的氨基酸序列具有 70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 序列一致性并且具有乙酰基CoA羧化酶酶促活性的編碼區；以及任選地 c)在植物細胞中發揮功能的轉錄終止和/或聚腺苷酸化區。
39.根據權利要求38所述的植物，其中所述DNA分子進一步包含編碼葉綠體靶向肽的DNA 區。
40.根據權利要求38所述的植物，其中所述編碼區包含以下核苷酸序列:從位置331的核苷酸到位置I860的核苷酸的SEQ ID N0.1、從位置1860的核苷酸到位置2360的核苷酸的 SEQ ID N0.USEQ ID N0.4、SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.8、SEQ ID N0.10、SEQ ID N0.12、SEQ ID N0.14、SEQ ID N0.16 或 SEQ ID N0.18，或與其具有 70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%核苷酸序列一致性的編碼區。
41.根據權利要求38或40所述的植物，其中所述植物可表達啟動子為在質體中表達的啟動子并且其中所述終止和/或聚腺苷酸化區為在質體中發揮功能的轉錄終止區。
42.一種根據權利要求32至41中任一項所述的植物的細胞、組織、儲油組織或種子。
43.一種油，其來源于根據權利要求31至41中任一項所述的植物。
44.一種嵌合DNA， 其包含以下可操作地連接的DNA片段: a)植物可表達啟動子； b)編碼一個或多個乙酰基CoA-羧化酶亞單元的一個或多個編碼區，其具有從氨基酸序列SEQ ID N0.2、3、5、7、9、11、13、15、17或19中選出的氨基酸序列，優選地為異源編碼區；或與從氨基酸序列 SEQ ID No2、3、5、7、9、ll、13、15、17 或 19 或SEQ ID No46_128 中任一項中選出的氨基酸序列具有 70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 序列一致性并且具有乙酰基CoA羧化酶酶促活性的編碼區；以及任選地 c)在植物細胞中發揮功能的轉錄終止和/或聚腺苷酸化區。
45.一種與植物的野生型乙酰基CoA-羧化酶相比對18:1-輔酶A或18:1-酰基載體蛋白作出的反饋抑制的敏感性較小的質體乙酰基CoA-羧化酶變體酶或其亞單元的用途，其用于增加植物細胞中的油含量。
46.一種用以分離與植物的野生型乙酰基CoA-羧化酶相比對18:1_輔酶A或18:1_酰基載體蛋白作出的反饋抑制的敏感性較小的乙酰基CoA-羧化酶或其亞單元的變體的方法，其包含以下步驟: a)產生一大批來源于優選來自植物的反饋抑制敏感性CoA-羧化酶的變體乙酰基CoA-羧化酶； b)在18:1-輔酶A或18:1-酰基載體蛋白或18:1吐溫存在下鑒別所述變體乙酰基CoA-羧化酶中每一種的酶促活性； c)分離在18:1-輔酶A或18:1-酰基載體蛋白存在下與所述反饋抑制敏感性CoA-羧化酶的酶促活性相比具有較大酶促活性的那些酶變體。
47.一種用以增加植物細胞中的油含量的方法，其包含以下步驟:a)根據權利要求45所述的方法分離與植物的野生型乙酰基CoA-羧化酶相比對18:1-輔酶A或18:1-酰基載體蛋白作出的反饋抑制的敏感性較小的乙酰基CoA-羧化酶或其亞單元的變體； b)將所述乙酰基CoA-羧化酶或其亞單元的變體引入到植物中，優選地通過從編碼所述乙酰基CoA-羧化酶的DNA構筑體轉錄。
48.一種用以分離包含編碼質體乙酰基CoA-羧化酶變體酶或其亞單元的變體等位基因的植物細胞或植物的方法，所述質體乙酰基CoA-羧化酶變體酶或其亞單元與植物的野生型乙酰基CoA-羧化酶相比對18:1-輔酶A或18:1-酰基載體蛋白作出的反饋抑制的敏感性較小，所述方法包含以下步驟: a)提供植物細胞或植物的群體，其各自包含一大批變體乙酰基CoA-羧化酶或其亞單元; b)在18:1-輔酶A或18:1-酰基載體蛋白或18:1吐溫存在下鑒別所述變體乙酰基CoA-羧化酶或其亞單元中每一種的酶促活性； c)分離包含在18:1-輔酶A或18:1-酰基載體蛋白存在下與所述反饋抑制敏感性CoA-羧化酶的酶促活性相比具有較大酶促活性的酶變體的那些植物細胞或植物。
49.一種植物細胞或植物，其是通過根據權利要求48所述的方法獲得。
50.一種生產食物、飼料或工業產品的方法，其包含 a)獲得根據權利要求32至41和49中任一項所述的植物或其部分；以及 b )從所述植物或其部分制備所述食物、飼料或工業產品。
51.根據權利要求50所述的方法，其中 a)所述食物或飼料為油、粗粉、谷物、淀粉、面粉或蛋白質；或 b)所述工業產品為生物燃料、纖維、工業化學品、醫藥品或營養保健品。
【文檔編號】C12N15/82GK103813709SQ201280041569
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2012年6月28日 優先權日:2011年6月28日
【發明者】J·尚克林, C·安德烈 申請人:布魯克黑文科學聯合會