組織和器官的制作方法
【專利摘要】本發明提供重構有成熟功能的組織及器官的手段。組織或器官的制作方法，其特征在于將器官細胞與血管內皮細胞及未分化間葉系細胞共培養，制作器官芽，將其移植進非人動物，其后，從非人動物取出移植的器官芽來源的組織或器官。
【專利說明】組織和器官的制作方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及從人工多能性干細胞(iPS細胞)等的未分化細胞制作器官芽、組織、和器官的方法。
【背景技術】
[0002]近年，利用具有向各種各樣的功能細胞分化的能力的iPS細胞等的多能性干細胞，通過對創造性新藥篩選或再生醫療有益的人功能細胞的分化誘導來開展研發的方法引人關注。至今進行著通過向多能性干細胞的培養系統添加各種各樣的誘導因子等，分化誘導各種功能細胞的多種嘗試(M.Schuldiner，et al.PNAS，97 (21)，11307-11312 (2000)，K.Si_Taiyeb，et al.Hepatology, 51 (1):297-305 (2010))。但是，在以往的不伴隨三維組織結構的重構的分化誘導法中，存在難以誘導功能細胞的終末分化，分化誘導的效率低，再現性也低這樣的大問題。
[0003]另一方面，對于重度的器官功能衰竭，在臨床上進行器官移植或人工器官置換治療。但是，器官移植存在排斥反應或絕對的供體不足，人工器官僅可短期間代替功能的一部分等(特開平9-56814號公報、特開2004-166717號公報)，根本性的問題還是留下來沒有解決。對于人組織的人為的制造而言，雖然考查了使用將終末分化的細胞下雹接種到載體(支架材料)的方法等，但對于肝臟等有復雜的高級功能的器官而言，現狀是尚不存在已經明確建立的方法(非專利文獻I)。即，現狀是尚未實現明確建立用由在成體組織見到的多個細胞譜系構成的有秩序的立體結構的人組織一器官的重構法。
[0004]現有技術文獻
[0005]專利文獻
[0006]專利文獻1:特開平9-56814號公報
[0007]專利文獻2:特開2004-166717號公報
[0008]非專利文獻
[0009]非專利文獻l:Uygun，B.E.，et al.Nat Med, 16 (7)，814-820 (2010)

【發明內容】

[0010]發明要解決的技術課題
[0011]以往、使用多能性干細胞的分化誘導法是，通過組合添加液性因子的或基因導入等各種各樣的分化因子來試圖誘導細胞分化。但是，這些以往的方法不僅無法誘導終末分化的功能細胞，也未充分實現朝向其前體集團的組織干細胞的初期分化誘導。
[0012]另一方面，構成組織或器官的細胞不僅只有`功能細胞，還存在血管系細胞或間充質細胞等多種細胞種類，再者，它們依靠取得有秩序的空間配置，通過發生協調性的相互作用而形成組織結構。但是，現狀是，作為人組織一器官的重構技術只存在使用支架材料等的載體的方法，存在著接種的功能細胞的植入率極其低，長期培養困難，重構的組織一器官的功能顯著未成熟的問題。[0013]本發明旨在解決以上的問題，以提供重構有成熟功能的組織及器官的手段作為目的。
[0014]解決課題的技術方案
[0015]為了解決這些問題，發明人認為精致地再現化器官發生過程，同時誘導細胞分化和形態形成是必須的。即，開發出用于使用多種細胞，將不同的細胞譜系適宜地在時間空間內再構建成配置為3維組織結構體的新技術是極其重要的。本發明試著通過器官生長中產生的由多種細胞的細胞間相互作用的再現化的方法，開發3維的組織一器官的重構技術。
[0016]在生理性的器官生長過程中，通過器官細胞與血管內皮細胞及未分化之間葉系細胞具有密切的細胞間相互作用而進行自律性的組織結構的構建和伴隨細胞分化的器官形成。
[0017]在本發明中旨在通過人為地再現這樣的器官發生的早期過程，進行經由多種細胞譜系的相互作用的初期分化誘導，誘導完成初期分化的器官細胞的組織形成能力，在試管內人為地制作成為組織一器官的基原的器官芽(organ bud)。再者，將在培養系統中誘導的器官芽移植到活體內而開始血液流通，進行由終末分化的功能細胞和血管系統組成的組織一器官的制作。
[0018]具體而言，將由iPS細胞等的多能性干細胞得到的最適分化階段的器官細胞與血管內皮細胞及間葉系細胞進行共培養。將這3種不同的細胞成分以最適的混合比率進行培養，在被細胞外基質成分支持的特殊的環境下，進行含特定的營養因子一液性因子的分化誘導培養基的初步短期間培養，從而使在試管內誘導有微小血管結構的立體的器官芽變得可能。再者，通過將在培養系統中誘導的器官芽移植到活體內，通過促進血管化而開始血液流通，從而使制作有與成體組織同等的有高度秩序的組織結構的組織一器官變得可能。認為血管內皮細胞和間葉系細胞中任何一方或兩方也可用由血管內皮細胞分泌的因子，由間葉系細胞分泌的因子，由于血管內皮細胞和間葉系細胞這二者存在而分泌的因子等的物質代替。·
[0019]關注于這樣的多種細胞的細胞間相互作用，嘗試組織一器官的3維的重構的方法在過去是不存在的，被認為是新穎性極高的方法。
[0020]本發明的要點如下。
[0021](I)器官芽的制作方法，其包括將器官細胞與選自下述至少I種細胞及/或因子一同培養，所述的細胞及/或因子是:血管內皮細胞、間葉系細胞、血管內皮細胞分泌的因子；由間葉系細胞分泌的因子；由于血管內皮細胞和間葉系細胞這二者存在而分泌的因子。
[0022](2) (I)所述的器官芽的制作方法，其中器官細胞是分化的細胞。
[0023](3) (I)所述的器官芽的制作方法，其中器官細胞是未分化的細胞。
[0024](4) (I)~(3)中任一項所述的器官芽的制作方法，其中器官細胞是:內胚葉性器官的細胞或可能分化為內胚葉性器官的細胞的細胞、中胚葉性器官的細胞或可能分化為中胚葉性器官的細胞的細胞、或者外胚葉性器官的細胞或可能分化為外胚葉性器官的細胞的細胞。
[0025](5) (4)所述的器官芽的制作方法，其中器官細胞是內胚葉性器官的細胞或可能分化為內胚葉性器官的細胞的細胞。[0026](6) (5)所述的器官芽的制作方法，其中內胚葉性器官是肝臟或胰腺。
[0027](7) (I)~(6)中任一項所述的器官芽的制作方法，其中器官細胞是人工多能性干細胞來源的細胞。
[0028](8) (7)所述的器官芽的制作方法，其中人工多能性干細胞是人來源。
[0029](9) (I)~(8)中任一項所述的器官芽的制作方法，其與選自由血管內皮細胞、間葉系細胞、血管內皮細胞分泌的因子，由間葉系細胞分泌的因子，由于血管內皮細胞和間葉系細胞這二者存在而分泌的因子的至少I種細胞及/或因子一同將器官細胞在血管內皮細胞培養用培養基中培養。
[0030](10) (I)~(9)中任一項所述的器官芽的制作方法，其與選自由血管內皮細胞、間葉系細胞、血管內皮細胞分泌的因子，由間葉系細胞分泌的因子，由于血管內皮細胞和間葉系細胞這二者存在而分泌的因子的至少I種細胞及/或因子一同將器官細胞接種于凝膠上進行培養。
[0031](11) (I)~(10)中任一項所述的器官芽的制作方法，其中血管內皮細胞是分化的細胞。
[0032](12) (I)~(10)中任一項所述的器官芽的制作方法，其中血管內皮細胞是未分化的細胞。
[0033](13) (I)~(12)中任一項所述的器官芽的制作方法，其中間葉系細胞是分化的細胞。
[0034](14) (I)~(12)中任一項所述的器官芽的制作方法，其中間葉系細胞是未分化的細胞。
·[0035](15)組織或器官的制作方法，其包括:將由(I)~(14)中任一項所述的方法制作的器官芽移植到非人動物，分化為組織或器官。
[0036](16)器官芽的移植方法，其包括:將由(I)~(14)中任一項所述的方法制作的器官芽移植進人或非人動物。
[0037](17) (16)所述的器官芽的移植方法，其中器官芽的移植部位選自:顱內、腸系膜、肝臟、脾臟、腎臟、腎被膜下、門靜脈上。
[0038](18)組織或器官的再生或功能恢復方法，其包括:將由(I)~(14)中任一項所述的方法制作的器官芽移植到人或非人動物，使之分化為組織或器官。
[0039](19)非人嵌合體動物的制作方法，其包括:將由(I)~(14)中任一項所述的方法制作的器官芽移植到非人動物，使之分化為組織或器官。
[0040](20)評價藥劑的方法，其中使用選自由(I)~(14)中任一項所述的方法制作的器官芽、由(15)所述的方法制作的組織及器官、以及由(19)所述的方法制作的非人嵌合體動物的至少一種。
[0041]【發明效果】
[0042]以往、從多能性干細胞通過分化誘導得到的功能細胞，與構成活體組織的功能細胞相比，止于未成熟的分化階段。這是因為，在以往的分化誘導法中，不誘導功能細胞的終末分化。由本發明，期待基于立體的的組織重構的人功能細胞的終末分化的誘導法的確立(例如，對血管結構的細胞極性的再構成等)，從而作為人功能細胞的制造技術價值高。
[0043]另外，在以往的多能性干細胞的分化誘導法中，完全無法得到組織干細胞。由本發明，只要實現從iPS細胞制造組織干細胞，本發明人通過聯用過去開發的人肝干細胞操作技術(國際公開編號:W0/2009/139419)，可期待對于人肝細胞的大量制造有用的細胞操作技術。
[0044]再者，在本發明中，通過人為地再現器官發生中發生的多種細胞間相互作用來重構有血管系統的立體的人組織結構體是可能的。從而，期待成為以往的技術完全無法實現的，用于制作有血管系統適宜地配置的血流的人組織一器官的平臺技術。
[0045]本說明書包含作為本申請的優先權的基礎的日本國專利申請、特愿2011-210157的說明書及/或附圖中記載的內容。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0046]圖1:顯示人iPS細胞來源的肝臟內胚葉細胞的自律的組織化的圖。左下圖顯示人肝臟內胚葉細胞。左上圖顯示由肝臟內胚葉細胞、血管內皮細胞及未分化間葉系細胞的三者的共培養形成的三維結構體(肝芽)(培養開始4天后)。右上圖是上述三維結構體的熒光顯微鏡照片。血管內皮細胞(HUVEC)被EGFP標記，未分化間葉系細胞(hMSC)被KO標記。iPS細胞未被標記。
[0047]圖2:顯示構成器官芽的細胞等的標志物蛋白質的表達量的圖。圖中的“H印.End.HUVEC MSC”表示構成器官芽的細胞，“undiff iPS”及“ iPS”表示iPS細胞，“Def End”表示由激活素誘導的內胚葉系細胞，“Hep End”表示由BMP4及FGF2誘導的肝臟內胚葉細胞。“IH-樣”表示 K.S1-Taiyeb，et al.Hepatology, 51 (I):297-305 (2010)所述的不成熟的肝細胞樣細胞，“MH-樣”表示 K.Si_Taiyeb，et al.Hepatology, 51 (1):297-305 (2010)所述的成熟的肝細胞樣細胞。
[0048]圖3:顯示構成器官芽的細胞等的標志物蛋白質的表達量的圖。圖中的“H印.End.HUVEC MSC”表示構成器官芽的細胞，“iPS”表示iPS細胞，“Def End”表示由激活素誘導的內胚葉系細胞，“H印End”表示由BMP4及FGF2誘導的肝臟內胚葉細胞。“ IH-樣”表示K.S1-Taiyeb, et al.Hepatology, 5`1 (1):297-305 (2010)所述的不成熟的肝細胞樣細胞，“MH-樣”表示 K.S1-Taiyeb，et al.Hepatology, 51 (I):297-305 (2010)所述的成熟的肝細胞樣細胞。
[0049]圖4:顯示向免疫缺陷小鼠活體內移植的肝芽的狀態的圖。iPS細胞被GFP標記，未分化內皮細胞被KO標記。
[0050]圖5:組織學解析移植2周后的肝芽的圖。
[0051]圖6:顯示胰腺β細胞的自立的組織化的圖。左圖顯示共培養的胰腺β細胞，右圖顯示單獨培養的胰腺β細胞。
[0052]圖7:顯示胰腺β細胞的集塊及血管樣管腔結構的圖。
[0053]圖8:顯示向移植的細胞塊的血液回流的圖。
[0054]圖9:顯示胰腺β細胞的球形形成過程的圖。血管內皮細胞(HUVEC)被GFP標記，胰腺β細胞(ΜΙΝ6)被KO標記。
[0055]圖10:顯示向胰腺β細胞集團內的血管形成的圖。血管內皮細胞(HUVEC)被GFP標記，胰腺β細胞(ΜΙΝ6)被KO標記。
[0056]圖11:顯示向胰腺β細胞集團內部的血液回流的圖。由標記的右旋糖苷可視化血流。
[0057]圖12:組織學解析胰腺β細胞集團的圖。
[0058]圖13:使用hiPSCs的人肝芽(hiPSC-LBs)的制成。(a)本方法的略圖。(b)肝內胚葉分化(hiPSC-Hep)在第9天將HNF4A及AFP用抗體染色評價(結果以平均值土標準偏差表示、n=3)。(c)將hiPSC-H印s與HUVECs及hMSCs共培養時的hiPSC-LBs的3維的自身組織化。在hiPSC-LBs內確認內皮發芽。綠色、EGFP標記的HUVEC ;紅色、KOFP (Kusabira橙色熒光蛋白)標記的hMSC。標尺長度是100μπι。(d)在不含hMSCs的培養系統中確認不到hiPSC-LBs的形成。標尺長度是1mm。(e)由使用共聚焦顯微鏡的時間推移觀察，確認使用 Cell Tracker Red CMTMR (Molecular Probes)標記的 hiPSC-Heps 的自律的的組織化。圖像是最大強度的共聚焦Z方向的圖像的投影。(f)用轉孔培養基，96小時、hiPSC-1feps單獨或與HUVEC及hMSCs共培養時的將HNF4A、F0XA2、AFP、RBP4、TTR及ALB的表達由定量RT-PCR (qPCR)解析(結果以平均值土標準偏差表示、n=3)。(g、h)顯示肝分化標志物基因的表達解析的結果，由BMP抑制劑頭蛋白(500ng/ml)及FGF抑制劑SU-5402 (50μΜ)的添加，妨礙與HUVEC及hMSCs共培養的hiPSC-H印s的有效的肝成熟(g)。另一方面，通過添加BMP4 (20ng/ml)及FGF2 (20ng/ml)，盡管用hiPSC-H印s單獨進行培養，確認肝分化標志物的表達亢進(h)(結果以平均值土標準偏差表示、n=3)。
[0059]圖14:hiPSC-LBs的在體外的特性解析。(a)細胞角蛋白8及18 (CK8.18), AFP,PECAM-1 (CD31)、Flk-l、結蛋白、PCNA及5'-溴-2'-脫氧尿苷(BrdU)的抗體染色。標尺長度是100 μ m。(b、c、d、e)各細胞表征的比率如下:肝芽細胞、AFP陽性/CK8.18陽性；增殖細胞、(PCNA陽性或BrdU陽性)/CK8.18陽性；內皮細胞、(⑶31陽性或Flkl陽性)/DAPI陽性；間葉細胞、結蛋白陽性/DAPI陽性。hiPSC-LBs內的各細胞種的比率與E10.5小鼠LBs CmLBs)的比率大致近似。在b、C、d中，將結果作為平均值土標準偏差，e中，表示為平均值土平均值的標準誤差、n=3。(f)顯示小鼠和人的肝臟發生時、對于階段性地表達升高的83種肝臟特異性·基因，由微陣列數據取得的熱圖譜。在體外的肝芽形成之后，這些肝臟中特征性的基因組的表達顯著地升高。hiPSC-Def ;hiPSC來源的胚體內胚葉細胞、hiPSC-Hep ；hiPSC來源的肝內胚葉細胞、hiPSC-1H ；hiPSC來源的未成熟肝細胞樣細胞、hiPSC-MH ；hiPSC來源的成熟肝細胞樣細胞、hFLT ;胎兒(妊娠后期、22-40周)肝臟組織、hALT ;人成體(30歲)肝臟組織。
[0060]圖15:在體內有功能性的血管網的人肝臟組織的制成。(a)向N0D/SCID小鼠的顱窗內移植hiPSC-LBs。肉眼觀察進行移植的hiPSC-LBs的結果，從移植約48小時后，確認向人血管的血液流入。點區域顯示移植的hiPSC-LBs。標尺長度是1mm。(b)由經時的共聚焦顯微鏡的活體觀察的結果確認由hiPSC-LBs中的血管內皮細胞的血管網的形成。(c)由葡聚糖的靜脈內施用，在移植第3天確認，通過功能性的人血管網使hiPSC-LBs完全地灌流。小圖顯示人和小鼠血管的連結。虛線顯示移植片的末端。標尺長度是500 μ m。(d)將HUVECs (綠色、GFP)和宿主血管(藍色、Alexa647標記的小鼠特異性的⑶31、靜脈施用)的連結直接可視化。標尺長度是250ym。(e、f)在移植第15天觀察形成的肝臟組織內的hMSCs或hiPSC來源細胞的所在位置。標尺長度是100 (e)及250 (f)ym0 (g)體內的hiPSC-LB移植片內部的人血管網的定量解析(結果以平均值土平均值的標準誤差表示、n=3)。(h)在hiPSC-LB和HUVEC hMSC移植片(Tx)間比較功能性的血管的長度(結果以平均值土平均值的標準誤差表示、n=5、*:P<0.01)。(i)注入FITC-葡聚糖之后的活體內共聚焦觀察。hiPSC-LB來源的組織的血管新生是與正常的成體小鼠肝臟的血管新生大致相同程度(結果以平均值土平均值的標準誤差表示、n=5、*:P〈0.01)。
[0061]圖16:hiPSC來源的肝臟組織的在體內的功能解析。(a)將移植60天后的組織切片HE染色的結果，確認含血竇樣的內皮細胞的肝細胞索的形成，而在HUVEC hMSC移植片(Tx)內確認不到。虛線顯示在腦上的移植片的界限。標尺長度是200 μ m (上部)及100 μ m(下部)。(b)顯示hiPSC-LB及hFLC-LB來源的在組織內的肝臟標志物的表達的免疫染色。標尺長度是100 μ m (左、中央)及25 μ m (右)。(C、d)經時的小鼠血清中的人ALB及AAT量(結果以平均值土平均值的標準誤差表示、c是n=6、d是n=3)。AAT產生與hiPSC-LB的移植片數有比例關系。分別將2個LB移植到顱，將3或6個LB移植到腸系膜。(e)顯示由CE-TOFMS測定的hiPSC-LB移植片的代謝特征的Venn圖(圖31)。在hiPSC-LB移植片上發現的代謝物之中，78%與成體肝臟的代謝物一致。右圖顯示在hiPSC-LB移植片及健康的人成體肝臟的兩方檢測，原來的hiPSCs中檢測不到的主要的代謝物。(f)由質譜法在小鼠尿中檢測的人特異性的酮洛芬代謝物(結果以平均值土平均值的標準誤差表示、n=3、*:P〈0.05)。(g)在經口施用異喹胍的小鼠的血清代謝物中用藥物動態解析探討4-0HDB的形成。(h)在顱內移植(CW)或腸系膜移植的小鼠間比較血清4-0HDB代謝物的形成(結果以平均值土平均值的標準誤差表示、n=3、*:P<0.05)。(i) hiPSC-LB移植后的TK-NOG小鼠的Kaplan-Meier生存曲線。由Wilcoxon統計解析顯示,受模擬處置的對照組和hiPSC-LB移植組的曲線有顯著的差異(P=0.0120)。
[0062]圖17:hiPSC的向肝內胚葉的初期分化誘導。(a)，通過在第6天及第9天對F0XA2、S0X17、HNF4A及AFP分別免疫染色來監測從hiPSC的向胚體內胚葉的分化及向肝內胚葉的分化。(b)通過在誘導第6天對F0XA2及S0X17進行免疫染色來評價向胚體內胚葉的分化效率(結果以平均值土標準偏差表示；n=3)。
[0063]圖18:在體外的hiPSC來源肝芽形成條件的優化。(a)通過與各種細胞類型的共培養的肝芽(LB)的形成。標尺長度是1mm。(b)將肝內胚葉細胞，在各種基質蛋白質上，與HUVECs及hMSCs共培養。將細胞接種于`基質膠(LAM COL ENT)上，觀察hiPSC來源LB(hiPSC-LB)的形成。LAM:層粘連蛋白；ENT:巢蛋白；C0L:膠原IV。(c)給LB形成帶來的基質蛋白質濃度的效果。(d) hiPSC-LB的qPCR基因表達分析。通過與內皮及間葉系細胞共培養，顯示作為初期肝分化標志物基因的ALB，RBP4, TTR及G6PC的顯著的表達升高(結果以平均值土標準偏差表示；n=3)。
[0064]圖19:與間葉細胞的共培養物來源液性因子的鑒定。(a)與未分化hiPS細胞比較，與內皮及間葉細胞的共培養物中上調的5000種基因的基因本體論(GO)分析。條表示，對于生物學過程，60:0008083 (生長因子活性)內的特定GO分類的顯著性(P值)。在間葉細胞特異性基因之中，FGF信號途徑(紅色)及BMP信號途徑(藍色)強調。(b，c)顯示內皮及間葉細胞高表達FGF2及BMP4，(b) FGFs及(c) BMPs的qPCR分析。
[0065]圖20:由代表性的肝標志物基因的微陣列分析的表達表征。將hiPSC-LB的基因表達與人胎兒(妊娠22-40周)及成體肝組織(30歲)的基因表達比較，在適宜的階段。TAT:酪氨酸氨基轉移酶；G6PC:葡萄糖-6-磷酸酶；TD02:色氨酸-2，3-脫氧酶；GLUT2:葡萄糖轉運蛋白2 ；GYS2:糖原合酶2 ;AP0L6:載脂蛋白L ；KNG1:激肽原I ;CFB:補體B因子；CF1:補體I因子；PCK1:磷酸烯醇丙酮酸羧基激酶；LDHD:乳酸脫氫酶D ；CP:細胞纖溶酶;ACTB:肌動蛋白β。
[0066]圖21:從小鼠肝芽來源細胞的小鼠肝組織的制作。(a)EGFP標記E13.5mFLC移植片的經時的活體內熒光像。移植30天后，由尾靜脈注入四甲基若丹明葡聚糖，得知血管是有功能的。(b)制作的小鼠肝組織的HE染色。肝細胞群集含血竇內皮細胞(右、箭頭)。在群集內部形成膽管狀的結構物，由細胞角蛋白免疫染色確認(右、下部)。
[0067]圖22:制作的小鼠肝組織、E13.5胎兒肝組織及成體肝組織的組織學比較。(a)500ng/ml的HGF及200ng/ml的EGF的添加使肝組織的再構成增強。(b)制作的小鼠肝組織與E13.5胎兒肝組織比較，有與成體肝組織類似的組織學特征。標尺長度:200μπι。
[0068]圖23:hFLC-LBs的體內移植。將在體外制成的hFLC-LBs向N0D/SCID小鼠的顱窗下移植。(a)顯示血管新生的進行的經時的肉眼像。功能性的血流在第3天開始，然后經時，血管隨進一步復雜化的同時穩定化。(b) hFLC-LBs來源組織的在第3天的活體內共聚焦像。綠色:表達EGFP的hFLCs ;紅色:表達KOFP的HUVECs。標尺長度是100 μ m。
[0069]圖24:hFLC來源肝組織內的功能的血管網的體內形成。由德克薩斯紅葡聚糖的注入(第3天)顯示的持續性脈管結構。
[0070]圖25:與宿主血管連結的人血管網的形成對于hiPSC-Η印上首尾的植入不可或缺。(a)HUVECs (綠色、GFP)及宿主血管(藍色、Alexa647結合小鼠特異性⑶31 ;靜脈注射)間的連結的直接可視化。將灌流的血管由帶有熒光的葡聚糖(紅色)的靜脈注射，在第10天可視化。標尺長度是250 μ m及25 μ m。(b)外植的hiPSC-LB移植片的種特異性⑶31免疫染色顯示hiPSC來源肝組織中的人及小鼠血管之間的直接連結。標尺長度是100μπι。(c)不含內皮細胞的hiPSC/hMSC移植片的多個時間點的肉眼像。完全見不到可鑒定的血管。(d)hiPSC/hMSC移植片的HE染色，在30天后，顯示纖維性組織的形成。結果顯示hiPSC來源肝細胞的植入的失敗，提示內·皮細胞的必要性。標尺長度是100μπι。
[0071]圖26:制作的人肝臟及體內的正常的小鼠肝臟的脈管結構的活體內成像。(a)移植30天后，由FITC結合葡聚糖的注入可視化的，僅HUVEC hMSC (上段)或hiPSC-LB移植片(下段)的血管結構。(b)可視化由FITC葡聚糖的血流的正常的小鼠肝臟的活體成像。標尺長度是200 μ m。
[0072]圖27:肝組織內部的人血管網及肝細胞形態的活體內評價。(a)由FITC葡聚糖注入可視化的功能性人血管。接下來使用MetaMorph Angiogenesis Module軟件處理像投影(左側小圖)。右側小圖顯示各像的分段圖像。(b)血管直徑的定量(平均值土標準偏差；n=3)。(c) hiFLC-LB移植片內部的肝細胞形態的活體內像、及細胞圓形度(形狀因子)的推定(結果以平均值土標準誤差表示；n=3 ;對于各樣品測量100個以上的細胞；*:P<0.05 ；N.S.:不顯著)。
[0073]圖28:hiPSC_LB移植片的在體內的經時變化。(a) hiPSC-LB移植片的長時間HE染色。如在正常的小鼠肝臟發生中觀察到\圓形的hiPSC來源肝芽細胞大規模增殖，分化為有增大的細胞質的未成熟肝細胞。標尺長度是50 μ m。(b)在體內的hiPSC-LB移植片內的增殖性細胞數的2周后，在1、2及4個月后的由Ki67免疫染色的定量。
[0074]圖29:hiPSC_LB或hFLC_LB移植片的全標本包埋免疫染色。(a)顯示制作的肝組織內的基底膜蛋白質的再構成的膠原IV免疫染色。標尺長度是IOOym及50μπι。(b)與正常的小鼠肝組織同樣地，由成熟肝細胞及間葉細胞組成的移植片來源人肝組織。標尺長 50 u nio
[0075]圖30:hFLC-LB來源人肝組織的免疫染色及透過型電子顯微鏡分析。(a)hFLC_LB移植片來源的肝組織表達肝細胞特異性抗原(HSA)，但不表達AFP (左側小圖)。對人⑶31及α平滑肌肌動蛋白(SMA)的免疫染色顯示肝組織內部中的主要血管的形成(右側小圖)。標尺長度是100μπι。(b，c，d，e)hFLC-LB來源肝組織的電子顯微鏡圖像。顯示有緊密連接(b，C)、毛細膽管、豐富的線粒體、以及有糖原及脂質的蓄積(d，e)的肝細胞。
[0076]圖31:hiPSC_LB移植片的表達基因的表征。由移植60天后的多數的肝成熟標志物基因的(a)微陣列表征及(b) qPCR驗證的結果得知，hiPSC-LB向由移植的成熟肝細胞成熟。
[0077]圖32:60天hiPSC-LB移植片(藍色)、人成體肝臟(紅色)及未分化hiPSCs (綠色)的代謝途徑圖譜。將在途徑圖譜中鑒定的代謝物用不同的顏色著色的四角顯示。N.D.:未檢測到。
[0078]圖33:向治療用途的腸系膜移植模型的確立。(a)將在體外增殖的hiPSC或FLC來源LB移植到用纖維蛋白糊覆蓋的腸系膜。(b)移植60天后的hiPSC來源肝組織的肉眼觀察。用點圍起來的區域顯示移植片。(c)hiPSC-LB移植30天后，的2/3PH而人白蛋白的產生增大。(n=3) (d) DT注入Alb-TRECK/SCID小鼠的，hFLC-LB移植的(n=8)或偽手術的(n=7)組中的Kaplan-Meier生存曲線。
[0079]實施方式
[0080]以下，詳細地說明本發明。
[0081]本發明的器官芽的制作方法的特征在于，將器官細胞與選自由血管內皮細胞、間葉系細胞、血管內皮細胞分泌的因子，由間葉系細`胞分泌的因子，由于血管內皮細胞和間葉系細胞這二者存在而分泌的因子的至少I種細胞及/或因子一同培養器官細胞。
[0082]本發明中“器官芽”是指通過成熟可分化為器官的結構體，即器官細胞、血管內皮細胞、及未分化間葉系細胞或含從其分化的細胞的三種細胞的結構體。何種結構體是器官芽可通過下述方法確認，例如，研究將該結構體向活體移植是否可分化為目的器官(向目的器官分化，則可判斷為器官芽。)、及/或研究是否結構體含全部上述的三種細胞(含全部三種細胞，則可判斷為器官芽。)。器官芽可為分化為例如，腎臟、心臟、肺臟、脾臟、食道、胃、甲狀腺、副甲狀腺、胸腺、生殖腺、腦、脊髓等的器官的器官芽等，但優選為分化為肝臟的器官芽(肝芽)、分化為胰腺的器官芽(胰腺芽)、分化為腸道的器官芽等分化為內胚葉性器官的器官芽。何種結構體是分化為內胚葉性器官的器官芽可通過研究成為標志物的蛋白質的表達來確認(表達后述的標志物蛋白質之任何一種或多種，則可判斷為器官芽。)。例如，在肝芽中，HHEX、S0X2、HNF4A、AFP、ALB等成為標志物，胰腺芽中，PDXl、SOXl7、S0X9等成為標志物，分化為腸道的器官芽中，CDX2、S0X9等成為標志物。本領域技術人員使用的用語之中，肝芽、肝盲囊、肝類器官、胰腺(背側或腹側)芽、胰腺原基、胰腺類器官、腸芽、腸憩室、腸類器官(K.Matsumoto，et al.Science.19 ；294 (5542):559-63.(2001))等包括在本發明中的器官芽中。
[0083]本發明中“器官細胞”是指，構成器官的功能細胞、或者向功能細胞分化的未分化細胞。作為“未分化的器官細胞”，可舉出例如，可分化為腎臟、心臟、肺臟、脾臟、食道、胃、甲狀腺、副甲狀腺、胸腺、生殖腺、腦、脊髓等的器官的細胞等，可分化為腦、脊髓、腎上腺髓質、表皮、毛發一爪.皮膚腺、感覺器、末梢神經、水晶體等之外胚葉性器官的細胞、可分化為腎臟、尿管、心臟、血液、生殖腺、腎上腺皮質、肌肉、骨架、真皮、結締組織、中皮等中胚葉性器官的細胞、可分化為肝臟、胰腺、腸道、肺、甲狀腺、副甲狀腺、尿路等之內胚葉性器官的細胞等。何種細胞是可分化為外胚葉性器官、中胚葉性器官或內胚葉性器官的細胞可通過研究成為標志物的蛋白質的表達來確認(表達標志物蛋白質中的任何一種或多種，則可判斷為可分化為內胚葉性器官的細胞。)。例如，可分化為肝臟的細胞中，HHEX、S0X2、HNF4A、AFP、ALB等成為標志物，可分化為胰腺的細胞中，PDXl、S0X17、S0X9等成為標志物，可分化為腸道的細胞中，⑶X2、S0X9等成為標志物，可分化為腎臟的細胞中，SIX2、SALL1、可分化為心臟的細胞中，NKX2-5MYH6、ACTN2、MYL7、HPPA、可分化為血液的細胞中，C-KIT、SCAU TER119、H0XB4、可分化為腦或脊髓的細胞中，HNKU AP2、NESTIN等成為標志物。本領域技術人員間使用的用語之中，成肝細胞、肝祖細胞、成胰腺細胞、肝前體細胞、成胰腺細胞、胰腺祖細胞、胰腺祖細胞、胰腺前體細胞、內分泌前體細胞、腸祖細胞、腸前體細胞、中胚層、后腎間葉前體細胞、多能性腎單位祖細胞、腎祖細胞、心臟中胚層、心血管祖細胞、心臟祖細胞、(JR.Spence，et al.Nature.；470 (7332):105-9.(2011)、Self，et al.EMBOJ.；25 (21):5214-5228.(2006)、J.Zhang, et al.Circulation Research.;104:e30_e41(2009)、G.Lee，et al.Nature Biotechnology25,1468-1475 (2007))等包括在本發明中的未分化的器官細胞中。未分化的器官細胞可從人工多能性干細胞(iPS細胞)、胚性干細胞(ES細胞)等的多能性干細胞根據公知的方法制作。例如，可分化為肝臟的器官細胞可根據K.S1-Taiyeb,et al.Hepatology,51(1):297-305(2010)>T.Touboul，et al.Hepatology.51
(5):1754-65.(2010)制作，可分化為胰腺的器官細胞可根據D.Zhang，et al.Cell Res.；19 (4):429-38.(2009)制作，可分化為腸道的器官細胞可根據J.Cai，et al.J Mol CellBiol.；2 (1):50-60 (2010)、R.Spence，et al.Nature.；470 (7332):105-9.(2011)制作，可分化為心臟的器官細胞可根據 J.Zhang, et al.Circulation Research.；104:e30-e41(2009)制作，可分化為腦或脊髓的細胞可根據G.Lee, et al.Nature Biotechnology25,1468-1475 (2007)制作。作為“分化的器官細胞”，可例示胰腺的內分泌細胞、胰腺的胰腺管上皮細胞、肝臟的肝細胞、腸·道之上皮細胞、腎臟的尿細管上皮細胞、腎臟的腎小球上皮細胞、心臟的心肌細胞、血液的淋巴細胞或粒細胞、紅細胞、腦的神經細胞或神經膠質細胞、脊髓的神經細胞或許旺細胞等。器官細胞主要使用人來源的，但也可使用人以外的動物、例如，小鼠、大鼠、狗、豬、猴等的動物來源的器官細胞。
[0084]本發明中，“血管內皮細胞”是指構成血管內皮的細胞、或者可分化為那樣的細胞的細胞。何種細胞是血管內皮細胞可通過研究是否表達標志物蛋白質、例如，TIE2、VEGFR-U VEGFR-2、VEGFR-3、CD41來確認(表達上述標志物蛋白質中的任何一種或多種，則可判斷為血管內皮細胞。)。本發明中，使用的血管內皮細胞可為分化的，也可為未分化的。血管內皮細胞是否為分化的細胞可由CD31、CD 144確認。本領域技術人員使用的用語之中，內皮細胞、臍靜脈內皮細胞、內皮祖細胞、內皮前體細胞、血管性祖細胞、成血管細胞(HJ.joo，et al.Blood.25 ；118 (8):2094-104.(2011))等包括在本發明中的血管內皮細胞中。血管內皮細胞主要使用人來源的，但也可使用人以外的動物、例如，小鼠、大鼠、狗、豬、猴等的動物來源的血管內皮細胞。[0085]本發明中，“間葉系細胞”的概念是指，主要存在于從中胚葉來源的結締組織中，形成以組織發揮功能的細胞的支持結構的結締組織細胞，也包括被決定向間葉系細胞的分化運命，但尚未向間葉系細胞分化的細胞。本發明中，使用的間葉系細胞可為分化的，也可為未分化的。何種細胞是未分化間葉系細胞可通過研究是否表達標志物蛋白質、例如，Stro-1、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD133、CD271、Nestin 來確認(表達上述標志物蛋白質中的任何一種或多種，則可判斷為未分化間葉系細胞。)。另外，可判斷不表達前項的標志物中的任何一種的間葉系細胞為分化間葉系細胞。本領域技術人員使用的用語之中，間葉干細胞、間葉祖細胞、間葉細胞(R.Peters，et al.PLoS One.30 ；5 (12):el5689.(2010))等包括在本發明中之間葉系細胞中。間葉系細胞主要使用人來源的，但也可使用人以外的動物、例如，小鼠、大鼠、狗、豬、猴等的動物來源的未分化間葉系細胞。
[0086]共培養中的三種細胞的培養比只要在可形成器官芽的范圍內，就不特別限定，適宜的細胞數比是器官細胞:血管內皮細胞:未分化間葉系細胞=10:10~5:2~I。
[0087]另外，血管內皮細胞和間葉系細胞中的任何一方或兩方可用由血管內皮細胞分泌的因子，由間葉系細胞分泌的因子，由于血管內皮細胞和間葉系細胞這二者存在而分泌的因子等的物質代替。
[0088]作為由血管內皮細胞分泌的因子、由間葉系細胞分泌的因子、及由于血管內皮細胞和間葉系細胞這二者存在而分泌的因子等的物質的例，可例示FGF2、FGF5、BMF4、BMP6、CTGF等，但不限于這些。
[0089]作為這些物質的添加量，對于FGF2，每I X 10~6個細胞，10~100ng/ml是適當的，20ng/ml左右是優選的，對于BMF4而言，每I X 10~6個細胞，10~100ng/ml是適當的，20ng/ml左右是優選的。
[0090]培養時使用的培養基只要是形成器官芽的就可，但優選使用血管內皮細胞培養用的培養基、器官細胞培養用的培養基、將上述2種培養基`混合的等。血管內皮細胞培養用的培養基可使用任何培養基，優選使用含hEGF (重組人上皮細胞生長因子)、VEGF (血管內皮細胞生長因子)、氫化可的松、bFGF、抗壞血酸、IGF1、FBS、抗生素(例如，慶大霉素、兩性霉素B等)、肝素、L-谷氨酰胺、酚紅、BBE的至少I種的培養基。作為血管內皮細胞培養用的培養基，可使用 EGM_2BulIetKit (Lonza 公司制)、EGM BulletKit (Lonza 公司制)、VascuLifeEnGS Comp Kit(LCT公司制)、人內皮-SFM基礎生長培養基(Invitrogen公司制)、人微小血管內皮細胞增殖培養基(TOYOBO公司制)等。器官細胞培養用的培養基可使用任何培養基，但當器官細胞是肝細胞時，優選使用含抗壞血酸、BSA-FAF、胰島素、氫化可的松、GA-1OOO的至少I種的培養基。作為肝細胞培養用的培養基，從HCM BulletKit (Lonza公司制)除去hEGF (重組人上皮細胞生長因子)的培養基，可向RPMI1640 (Sigma-Aldrich公司制)使用1%B27補充物(GIBC0公司制)和10ng/mL hHGF (Sigma-Aldrich公司制)等。關于人肝芽的形成，向將GM BulletKit (Lonza公司制)和從HCM BulletKit (Lonza公司制)除去hEGF(重組人上皮細胞生長因子)的培養基以1:1混合的培養基，添加地塞米松、抑瘤素M、HGF,確證對肝芽的成熟有效果。
[0091]器官細胞優選接種于凝膠上進行培養。此時、使用的凝膠不特別限定，可使用BDMatrigel (BD pharmingen 公司制)等。
[0092]培養時的溫度不特別限定，優選30~40°C，再優選37°C。[0093]培養期間不特別限定，優選3~10天，再優選6天。
[0094]將如上所述制作的器官芽移植到非人動物，通過使其在非人動物內成熟，可制作組織或器官。作為使用的非人動物，可舉出小鼠、兔、豬、狗、猴等。另外，使用的非人動物，為了回避免疫排斥反應，優選免疫缺陷動物。
[0095]從而，本發明提供包括將由上述的方法制作的器官芽移植進人或非人動物的器官芽的移植方法。器官芽的移植部位是只要可移植，任何部位都可，可例示顱內、腸系膜、肝臟、脾臟、腎臟、腎被膜下、門靜脈上等。在移植到顱內時，移植在體外制作的I~3個左右的5mm大的器官芽就可,在移植到腸系膜時，移植在體外制作的I~6個左右的5mm大的器官芽就可，在移植到門靜脈上時，移植在體外制作的I~20個左右的5mm大的器官芽就可。在移植到腎皮膜時，移植在體外制作的I~5個左右的5mm大的器官芽就可，在移植到肝臟一脾臟一腎臟時，移植在體外制作的100~200個左右的100μπι大的器官芽就可。
[0096]如上所述制作的組織及器官可在創藥篩選或再生醫療等中使用。
[0097]從而，本發明提供組織或器官的再生或功能恢復方法，包括將由上述的方法制作的器官芽移植到人或非人動物，分化為組織或器官。作為非人動物，可舉出小鼠、兔、豬、狗、猴等。
[0098]另外，本發明提供非人嵌合體動物的制作方法，包括將由上述的方法制作的器官芽移植到非人動物，分化為組織或器官。移植器官芽的非人動物(例如，小鼠)可模仿器官芽的制作中使用的器官細胞的來源生物種(例如，人)的生理功能。在后述的實施例中，移植從人來源的iPS細胞制作的器官芽的小鼠確認模仿人的肝功能，所以認為，使用此小鼠可預測人的藥物代謝表征。
[0099]再者，本發明提供評價藥劑的方法，其使用選自由上述的方法制作的器官芽、組織及器官、及非人嵌合體動物的·至少一種。作為藥劑的評價，可舉出例如，藥的候選化合物的藥物代謝表征的預測、藥效評價、毒性評價、藥物相互作用評價等。
[0100]另外，從由本發明的方法制作的組織及器官制造組織干細胞也可能，本發明在人組織細胞或器官細胞的大量制造的向細胞操作技術的應用是可能的。
[0101]【實施例】
[0102]以下，通過實施例再詳細地說明本發明。
[0103]〔實施例1〕使用未分化的器官細胞的器官的制作
[0104]〔實驗方法〕
[0105]【(I)人肝臟內胚葉細胞的制作】
[0106]通過將人iPS細胞(人皮膚來源TkDA3hiPSC克隆(由Koji Eto氏及HiromitsuNakauchi氏獲贈))向無血清培養基添加激活素來培養，誘導CXCR4及E-鈣粘素兩陽性的內胚葉系細胞。通過將得到的內胚葉系細胞添加BMP4、FGF2培養2天，得到CXCR4陰性HNF4 α陽性的肝臟內胚葉集團。CXCR4及HNF4a的表達，根據H印atology，51 (I )，297-305，2010的記載，由免疫染色及基因表達解析確認。
[0107]【(2)人肝芽的制作】
[0108]將得到的肝臟內胚葉細胞，與血管內皮細胞(人臍帶血來源靜脈內皮細胞)(Lonza、Basel、Switzerland)及未分化間葉系細胞(人間葉系干細胞)(Lonza、Basel、Switzerland)以各10:5-10:2的比例混合，進行共培養。血管內皮細胞及未分化間葉系細胞使用進行各熒光標記的細胞。共培養時，向進行原液至2倍稀釋的基質膠(BDpharmingen)的固相化的培養皿之上接種細胞懸浮液。培養液使用內皮細胞培養基試劑盒-2:EGM-2BulIetKit (制品編碼 CC-3162:Lonza)。
[0109]進行短期間(3-10天)培養，制作人三維結構體(肝芽)。另外，進行形成過程、及由形成的結構體的共聚焦顯微鏡的觀察，實施細胞的形態、所在位置等的動態/靜態解析。再者，進行形成的人三維結構體的基因表達解析。
[0110]【(3)人肝組織的制作】
[0111]將形成的人三維結構體，向免疫缺陷小鼠(N0D/SCID小鼠(Sankyo Lab.C0.，Tsukuba, Japan))活體內移植。實施由肉眼及共聚焦顯微鏡的活體觀察，確認人細胞的植入一增殖的同時，解析移植后的血管成熟化過程。回收移植早期的樣品(2周)，進行其組織學解析。
[0112]〔實驗結果〕
[0113](I)從僅人細胞自律地進行組織化，形成可肉眼觀察的立體的結構體(圖1)。
[0114](2)在培養第4天，確認血管樣的管腔結構(圖1右上圖的擴大像)。
[0115](3)形成的三維結構體減弱作為未分化細胞的標志物的NANOG或CXCR4等的表達(圖 2)。
[0116](4)與由以往技術進行終末分化誘導的細胞比較，顯示使作為肝細胞的分化標志物的白蛋白(ALB)的表達增強100倍以上(圖2)、使其他分化標志物(F0XA2、TAT、PCK2)的表達也達到數十倍程度的表達增強(圖3)。
[0117](5)由移植，人血管與小鼠血管`連接，從早期(移植第2天)開始血液灌流(圖4)。
[0118](6)確認人iPS細胞來源肝臟細胞的增殖(圖5)。
[0119](7)由移植早期(2周)的樣品的組織學解析，確認白蛋白陽性的索狀結構的形成。另外，也確認血竇樣結構的形成(圖5)。
[0120](8)共培養時、不將細胞懸浮液接種于基質膠固相化培養皿上，將細胞懸浮液包埋于基質膠中時，向非包被的培養皿接種時，或者向將培養皿用I型膠原包被的培養皿接種時不形成立體結構。
[0121](9)共培養時、在作為培養液不使用內皮細胞培養基，而使用添加IfepatocyteMedium (XenoTech),或者 BMP4 及 FGF2 的肝細胞誘導培養基(!fepatology，51 (I),297-305，2010)時，在肝芽確認不到特征性的表達基因的增強(Alb、TTR等)。
[0122]〔實施例2〕使用分化的器官細胞的器官的制作
[0123]〔實驗方法〕
[0124]將胰腺β細胞株(ΜΙΝ6)與血管內皮細胞(人臍帶血來源靜脈內皮細胞)及未分化間葉系細胞(人間葉系干細胞)以各5:5-10:2的比例混合，進行共培養。胰腺β細胞株(KO)及血管內皮細胞(EGFP)使用進行各熒光標記的細胞。共培養時，向進行原液至2倍稀釋的基質膠(BD pharmingen)的固相化的培養皿之上接種細胞懸浮液。再有，向基質膠內部包埋時，或者，在非包被、I型膠原包被的培養皿中，不形成立體結構。培養液使用內皮細胞培養基試劑盒-2:EGM-2BulIetKit (制品編碼CC-3162:Lonza)。
[0125]進行短期間(3-10天)培養，制作三維結構體。進行形成過程、及由形成的結構體的共聚焦顯微鏡的觀察，實施細胞的形態、所在位置等的動態/靜態解析。[0126]將形成的三維結構體向免疫缺陷小鼠(N0D/SCID小鼠(Sankyo Lab.C0.，Tsukuba，Japan))活體內移植。實施由肉眼及共聚焦顯微鏡的活體觀察，確認細胞的植入一增殖的同時，解析移植后的成熟化過程。回收移植樣品(4周)，進行其組織學解析。
[0127]〔實驗結果〕
[0128](I)從僅細胞自律地進行組織化，在次日形成可肉眼觀察的立體的結構體(圖6)。
[0129](2)在培養第2天，胰腺β細胞株形成集塊，確認人血管樣的管腔結構包圍其周圍(圖 7)。
[0130](3)由移植，人血管與小鼠血管連接，從移植早期開始血液灌流(圖8)。
[0131](4)胰腺β細胞株形成集塊地增殖，形成胰島樣的結構體(圖9)。
[0132](5)在形成的胰島樣結構體之中確認包含人細胞的血管結構的形成(圖10)。
[0133](6)由血流的可視化確認，胰腺島樣結構體之內部再開始充分地血液灌流(圖11)。
[0134](7)由移植樣品的組織學解析，確認胰島素陽性的島狀結構的形成。形成的結構體內部有復雜的血管結構，有與正常小鼠胰腺島類似的結構(圖12)。
[0135]〔實施例3〕由人工多能性干細胞來源的器官芽移植的功能性的血管化人肝臟的制造
[0136]用于治療末期器官功能衰竭的供體器官顯著地不足，使用患者來源的人工多能性干細胞(hiPSCs) u制成器官的必要性越發升高。盡管多個論文報告了功能性的細胞分化”，尚無在肝臟這樣的有3維的血管網的器官的制成中成功的例。我們通過在體外制備的hiPSC來源的肝芽(hiPSC·-LBs)的移植，在有血管結構的功能性的人肝臟組織的制成中成功。除了內皮細胞和間葉細胞8之外，當促進器官形成時，iPS細胞來源肝內胚葉細胞與3維的hiPSC-LBs發生自身組織化。免疫染色及表達基因的解析的結果，在體外生長的hiPSC-LBs和體內的肝芽間確認類似性。hiPSC-LBs移植片內的人血管網在48小時以內與宿主血管連結，開始血液灌流。通過形成功能性的血管結構,得知hiPSC-LBs向與成體肝臟類似的組織成熟。再者，有高的代謝能力的hiPSC來源的移植組織不要求受者的肝臟的取代9’1(1，發揮人型的蛋白質產生或人特異性的藥物代謝這樣的肝臟特異性的功能。再者，當將hiPSC-LBs移植到腸系膜時，使藥物誘導的致死的肝功能衰竭模型的生存率升高。據我們所知，本報告是從多能性干細胞制成功能性的人器官的最初的例。雖然想將本方法臨床應用，進一步的探討是必要的，我們實驗證實的器官芽移植提供在再生醫療中有可能性的新的方法。
[0137]自1981年發現胚胎干細胞以來，數次嘗試了從多能性干細胞制成具有如肝臟一樣的復雜的結構的器官，但尚無成功的例。這被認為是因為在體外再現器官形成過程中發生的在細胞或組織間的復雜的相互作用是困難的2’n。我們關注于器官形成中的最初的過程、即，器官芽發生時的細胞間相互作用，研究了本課題。
[0138]在肝臟形成初期，由片狀的前腸內胚葉層釋放細胞，形成三維的肝芽(LB)12。這樣的形態學的大的變化依賴于血液灌流前發生的在內胚葉細胞、間葉系及內皮系前體細胞間的精密編成的信號8。基于這些見解，我們假定，將肝內胚葉細胞與內皮系及間葉系細胞一同培養，可在體外再現3維的(3D)的LB形成(圖13a)。為了證實本假說，首先最初，通過階段性的誘導因子的添加將人iPSCs向肝內胚葉細胞(hiPSC-Hep)分化誘導。結果，所述細胞的約80%中確認與細胞運命決定相關的肝性標志物HNF4A的表達(圖17及13b)。[0139]接下來，以再現初期肝臟形成作為目的，將hiPSC-Η印細胞與間葉細胞組共培養。對于內皮及間葉細胞而言，只要無特別說明，使用有未分化性的人臍帶靜脈內皮細胞(HUVECs)及人間葉干細胞(hMSCs)。需要特別說明的是，僅管在2D培養的條件下培養，在特定的基質蛋白質上生長的hiPSC-Hep細胞由于內在性的組織化能力而在培養后24小時以內形成可肉眼確認的程度的大小的3D細胞群集(圖13c、d、e)。被推定為hiPSC-Hep來源的肝芽(hiPSC-LBs)的群集有適度的力學強度，可耐受隨后的移植操作等。使用用熒光蛋白質標記的細胞將在hiPSC-LBs內的伴隨精密的內皮細胞的發芽的血管網的發達可視化(圖13c)。另外，通過使用從相同的供體得到的臍帶來源的MSCs及HUVECs，hiPSC-LB的形成均一地保持(圖18a、右)。qPCR解析的結果，hiPSC-LBs內的細胞以高的水平轉錄作為肝臟的初期分化標志物的α胎蛋白(AFP)、視黃醇結合蛋白(RBP4)、轉甲狀腺素蛋白(TTR)及白蛋白(ALB)5 (圖18d)。令人感興趣的是，間葉細胞依賴性的hiPSC-Η印細胞的肝成熟在使用轉孔的共培養系統中也以一定程度維持(圖13f)。以研究誘導肝成熟的介導因子作為目的，進行微陣列及qPCR解析。在間葉細胞特異性的基因組之中，BMP4及FGF2在與內皮及間葉細胞的共培養系統中顯著地升高(圖19)。作為BMP-及FGF-特異性的信號傳導的抑制劑的頭蛋白及SU-5402抑制由與間葉細胞的共培養的分化促進效果。另一方面，將BMP4及FGF2添加于hiPSC-Η印培養基，則觀察到同樣的肝分化誘導效果(圖13g、h)。這些結果提示，如在動物實驗13中也確認，除了直接的細胞間的相互作用之外，經BMP及FGF途徑的活化，通過由間葉細胞的液性因子的旁分泌支持支持一部分肝臟初期成熟。
[0140]hiPSC-LB與如在妊娠后期及生產后小鼠的發達的肝臟不同，與E10.5小鼠的LBs(mLBs)非常類似(圖14a)。hiPSC-LB及E10.5mLBs與間葉系及內皮系前體細胞同樣地表達AFP14’15，由有二分化能力的增殖性肝芽細胞構建。在hiPSC-LB及E10.5mLBs中，90%以上的推定肝細胞表達AFP，但在E15.5及E17.5mLBs中確認不到(圖14b)。hiPSC-LB內的肝細胞與E10.5mLBs有同程度的增殖能力(圖14c)。再者，hiPSC-LB由與E10.5mLBs同樣的比例的間葉系及內皮系前體細胞構成(圖14d、e)。為了研究表達基因的特征，選擇肝臟發生時連續地表達升高的83種基因，將其表達用微陣列RNA表征探討。由先前研究確認，E10.5mLBs顯示與妊娠3-4周(3-4GW)的·人胎兒肝臟對應16’17、與這一致的是，與妊娠22-40GW的胎兒及成體來源的發達的肝臟組織比較，hiPSC-LB中的83種基因表達模式處于適宜的分化階段(圖14f及圖20)。
[0141]血流動力學的促進在LB成熟中是必須的18。為了探討hiPSC-LBs是否重構有完全的功能的肝臟組織，進行可經長期進行重復成像19的向顱觀察窗的移植。首先，通過在移植實驗中使用小鼠肝芽來源的細胞(mLB)，確認本模型可再現LB的成熟過程(補充考察、圖21及22)。再者，以同樣地有LB (hFLC-LBs)形成能力的胎兒肝細胞作為對照，在培養時使用(圖18a)。為了觀察移植的人細胞的在體內的經過，將在體內的hiPSC-LBs來源的組織在各種各樣的時間點重復成像。需要特別說明的是，體外來源的hiPSC-LBs在移植后48小時以內與宿主的血管結構快速連結(圖15a、b及圖23)。注入熒光素一葡聚糖接合體及或Alexa647標記的小鼠特異性⑶31抗體的結果，得知移植的hiPSC-LBs內的人血管在移植片的末端與宿主血管連結。結果也在將摘出組織片由全標本包埋的免疫染色中確認(圖15c、d及圖24、25a、b)。再者顯示，不含內皮細胞而進行移植的hiPSC-Η印s不發生血管形成，由于無法植入，功能性的血管形成對于hiPSC-LB的移植及增大是必要不可或缺的(圖15f及圖25)。由hMSC來源的血管周圍細胞穩定化的人血管殘留至少180天(圖15e及g)。令人感興趣的是，hiPSC-LB移植片的血管網有與具有類似的形態的成體肝臟同程度的密度。另一方面，僅由HUVECs及hMSCs構建的移植片內的血管結構與hiPSC-LB移植片比較，雖然血管徑是相同程度(約12 μ m)，但密度更低(圖15h、i及圖26、27)。另外發現，由活體內成像，基于肝細胞的形態可推定分化狀態(圖27c及補充考察)。近年，從以基因改變動物作為對象的詳細的研究的結果推測，內皮細胞不僅形成輸送營養素或氧的途徑，還由旁分泌TROPHOGEN(卜口 7 * y >)產生確立促進肝臟的器官形成及再生8’2°’21的血管微小環境。通過使用這樣的移植模型，以人組織作為對象，確立了可評價器官形成時的成熟及分化過程的獨特的活體內監測系統。由進一步研究得知，期待被知更精密再現生理性的肝形成的人間葉細胞株的器官發生時的作用。
[0142]將LB移植片在60天后，組織學地進行解析。與hFLC-LB同樣地，hiPSC-LB移植片也有在成體肝臟中特征性的肝細胞索樣的結構(圖16a及圖28a)、本結構由表達緊密連接蛋白一閉鎖小帶I (Z0-1)、ALB、細胞角蛋白8及18 (CK8.18)(圖16b)的細胞、及通常含沿洞樣血管22的全長發現的膠原IV的基底膜(圖29a)構成。再者顯示，表達作為成熟肝細胞標志物的無唾液酸糖蛋白受體I (ASGR1)，不表達未成熟肝細胞標志物AFP (圖29b、14a)。移植4個月后，在形成肝組織的幾乎全部細胞中，由作為增殖標志物的K1-67的表達確認與通常的肝臟內的肝細胞同樣地增殖停止(圖28b)。移植片來源的細胞有:良好發達的卵形的線粒體、緊密連接的形成、糖原及脂肪的細胞質內蓄積、毛細膽管這樣的成熟肝細胞中特征性的超微細結構(圖30b、c、d、e)。
[0143]解析進行hiPSC-LB移植的小鼠的血清的結果確認作為人蛋白質的人型ALB及Al抗胰蛋白酶(AAT)的生產及分泌(圖16e)。移植60天后，將外植的hiPSC-LBs用qPCR解析的結果確認，與體外來源的hiPSC-LBs比較，有明顯的肝成熟(圖31)。為了研究糖質、氨基酸及核苷酸代謝這樣的低分子量代謝物的表征，將hiPSC-LB移植片代謝產物組解析時，檢測到含牛磺膽酸這樣的肝臟特異性的物質的222種代謝物(圖16f)。這些代謝性高的表征，相比原來的hiPSCs更近似于人成體肝臟的表征(圖32)。再者，為了研究作為肝臟的重要的功能之一的藥物代謝活性，將已知在人和小鼠以不同的樣式代謝的酮洛芬23或異喹胍24’25施用于小鼠。藥物施用之后，由`移植hiPSC-LB的小鼠的尿及血清樣品確認人中特異性的代謝物的形成(圖16f、g、h及補充考察)。這顯示，通過使用本小鼠模仿人的在體內的生理功能，可預測人的藥物代謝表征。特別是，以往方法有以具有重度受損傷的肝臟的小鼠26'27作為宿主，移植高品質的成體肝細胞的必要，在今后可使用人iPS細胞精密驗證人型的藥物應答的點上意義深遠。
[0144]以將來的向臨床的應用作為目的，對于作為相比顱更現實的目標部位，侵襲性極其低的腸系膜移植模型進行探討。將hiPSC-LB向用纖維蛋白糊密封的腸系膜移植的結果，在第I個月人血管與宿主血管連結，由肉眼確認移植LB的植入(圖33a、b)。進行向腸系膜移植的hiPSC-LB與顱移植的情況比較，在蛋白質產生及藥物代謝的方面有更高的功能，如在先的研究28也顯示，證實門靜脈循環的重要性。再者，與模擬處置小鼠比較，由hiPSC-LB的移植，用更昔洛韋引起肝功能衰竭的TK-NOG小鼠29的生存率升高(圖16i及補充考察)。從以上事實可說，通過移植體外hiPSCs來源的LB，我們在誘導有血管網的功能性的人肝臟組織中成功。[0145]使用自身的多能性干細胞的再生醫療集合了極其大的期待。但是，作為使用干細胞的方法，使用作為現在主要的課題的細胞移植的臨床試驗至今尚無令人滿足的結果3°'31。作為在體內制成3維血管新生的器官的新的方法，由本研究證明器官芽的移植是有效的。這些結果強調，作為器官功能衰竭的治療，在體外生長的器官芽的移植具有大的治療的有效性。
[0146]【方法摘要】
[0147]hiPSCs的肝初期分化誘導根據前述的方法5進行。將HUVECs和hMSCs (Lonza、Basel、Switzerland),使用內皮增殖培養基(EGM) (Lonza)或MSC增殖培養基(Lonza),在加濕溫育器內，于37度、5%的CO2存在下維持。在體外制成人LB時，向EGM和肝細胞用培養基(HCM) (Cambrex、Baltimore、MD)(含地塞米松(0.1 μ M、Sigma-Aldrich、St Louis、MO)、抑瘤素 M (10ng/ml、R&D System、Minneapolis、MN)、HGF (20ng/ml、PromoKine)及SingleQuots (Lonza))懸浮 IXlO6 的 hiPSC 來源肝細胞、0.8-1 X IO6 的 HUVECs、及 2X IO5的hMSCs,涂布于基質膠(BD Biosciences、Bedford、MA、USA)上。培養4-6天后，剝下生成的hiPSC-LBs，采集之后，移植到免疫缺陷小鼠的顱窗19。
[0148]【方法】
[0149]細胞培養及分化TkDA3hiPSC克隆購自Koji Eto氏及Hiromitsu Nakauchi氏。對于未分化hiPSC細胞，將小鼠胚成纖維細胞作為飼養細胞使用，在其上生長。內胚葉性分化時，將hiPSCs接種于用基質膠包被的皿上之后，移到含1%的B27 (不含胰島素)和(IOOng/ml)的RPMI1640培養基，培養5~6天。通過將hiPSC來源的內胚葉細胞用含hbFGF( IOng/ml)、hBMP4 (20ng/ml)及1%B27的PRMI1640再處理3_4天來進行向肝臟的特化。人重組體激活素 A/EDF 購自 Yuzuru Eto 氏(Ajinomoto C0.1nc.)。將 hFLCs(CS_ABI_3716 ；AppliedCell Biology Research Institute)接種于用膠原 IV 包被的 6_ 孔板(BD Biosciences)上之后，使用該研究室的標準培養基[含10%FBS (Lot.7219F ；ICN Biochemical、USA)、50mmoI / I HEPES (ffa·ko Pure Chemical Industries、Japan)、2mmol/L L-谷氨酉先胺(LifeTechnologies Corporation、USA)、50mmol/L2_ 疏基乙醇(Sigma)、I X 青霉素 / 鏈霉素(Life Technologies)、lOmmol/L 煙酰胺(Sigma)、I X ICT4M 地塞米松(Sigma)及 I μ g/ml 胰島素(Wako)的F-12 (Sigma Aldrich、Japan)和DMEM的1:1混液]維持。在培養前添加人重組體HGF (50ng/ml)及EGF (20ng/ml) (Sigma)0使用上皮增殖培養基或MSC增殖培養基(Lonza)，在加濕溫育器內，于37度、5%的CO2存在下維持HUVECs及hMSCs (Lonza)。
[0150]為了由反轉錄病毒的轉導活體成像，用表達EGFP或kusabira orange (KOFP)的反轉錄病毒，如文獻記載19感染細胞。即，將反轉錄病毒載體PG⑶Nsam IRES-EGFP或KOFP轉染到293gp及293gpg包裝細胞(由Masafumi Onodera氏提供)中，使用四環素誘導性的系統誘導病毒粒子產生。將感染反轉錄病毒的細胞的培養上清用0.45-μ m濾器(Whatman，GE Healthcare, Japan)過濾,立即用于感染。KOFP是將在515nm處有小的峰的主要吸收極大波長在548nm處顯示，然后發在561nm處有峰的亮橙色熒光32。
[0151]【移植】
[0152]剝離在體外生成的LB，采集之后，移植到實施重度免疫缺陷的N0D/SCID小鼠(Sankyo Lab.C0., Tsukuba, Japan)的盧頁窗內。移植的細胞的在體內的經過通過使用突光顯微鏡(model BZ-9000 ;Keyence、Osaka、Japan)或 Leica TCS SP5 共聚焦顯微鏡(LeicaMicrosystems、Germany)的活體內成像觀察。對于生存曲線而言，使用TK-NOG小鼠(體重<20-30g)(提供方 Central Institute for Experimental Animals、Kanagawa> Japan) 29進行解析。將I打的hiPSC-LBs移植到腸系膜后，在第7及10天，在人及小鼠組織中，通過向小鼠施用無毒的更昔洛韋(GCV、50mg/kg、腹腔內注入)，組織特異性地消去基因導入的肝臟的實質細胞。小鼠根據關于動物實驗利用的當研究設施指南進行交配及維持。
[0153]由植入血管的灌流的數量化，由1%四甲基若丹明結合葡聚糖(麗2，000，000)、異硫氰酸熒光素結合葡聚糖(MW2，000，000)及德克薩斯紅結合葡聚糖(70，000MW,中性)的尾靜脈注入鑒定血管腔(全部Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)。對于移植的血管及葡聚糖得到多個共聚焦像。使用 MetaMorph Angiogenesis Module 軟件(Molecular Devices, UnionCity, CA, USA),處理像的投影。接下來，向Excel電子數據表自動地記錄全細管長、每視場細管％及管直徑。
[0154]如前所述33實施表達基因的分析qPCR分析。人胎兒肝臟(Lot N0.:A601605)及人成體肝臟(Lot N0.:B308121)的全 RNA 從 Biochain Institute (Hayward, CA, USA)得到。
[0155]【表達基因的微陣列及數據分析】
[0156]使用RNeasy Mini Kit(Qiagen, Valencia, CA),由 hiPSC 來源細胞 / 組織(hiPSC,hiPSC-Def, hiPSC-Hep, hiPSC-1H，hiPSC-MH，hiPSC-LB，hiPSC-LB-Tx)制備全 RNA。人胎兒肝臟(Lot N0.:A601605)及人成體肝臟(Lot N0.:B308121)的全 RNA 從 BiochainInstitute (Hayward, CA, USA)得到。擴增 cRNA,使用 Low Input Quick Amp Labeling Kit(Agilent Technologies, Palo Alto, CA)標記，與 44K 的 60 寡聚體微陣列(Human GeneExpression4X44K v2Microarray Kit ；Agilent Technologies),根據生產商的指不雜交。將雜交的微陣列載玻片使用Agilent高解析度微陣列掃描儀掃描。使用特征提取軟件版本10.7.3.1 (Agilent Technologies),計算相對雜交強度及背景雜交值。根據AgilentTechnologies推薦的順序,使用GeneSpringll.5.1軟件中的標志基準，由雜交強度及斑信息計算原始信號強度及各探針的標志。再者，對樣品的原始信號強度進行log2變換，由變位值算法標準化。我們對全部的樣品，除“`妥協的”(compromised)標志之外,選擇探針,作為檢測的基因得到34，183個的探針。再者，我們把焦點放在基因水平中的26，153個的表達數據。由GeneSpring制作熱圖譜。加載標準化的強度值，由從各探針的中位值的距離進行標度調節。我們由使用歐幾里得測定基準的序列的聚類法將樣品及基因分類。為了評價各階段的hiPSCs中的基因表達模式的差異，我們分析選擇的83種基因的表達變化。這些基因在由在各不同的發生階段的小鼠肝細胞及2個在不同階段的人肝組織的微陣列分析的我們的以前的研究中鑒定。從全部的基因將83種基因作為肝臟特性基因選擇。這是因為，它們的基因在人及小鼠兩者的肝臟發生時繼續增加。
[0157]使ELISA血液樣品于室溫在離心管內凝固(約5分鐘)、從管的側面分離，保持于40C (熔化中的冰)20分鐘。將凝固的血液以10-15分鐘400g，于4°C離心，一邊注意排除紅細胞或凝固的物質，一邊除去血清級分。將小鼠血清樣品中的人ALB及AAT，使用人白蛋白ELISA 定量試劑盒(Bethyl Laboratories Inc., Montgomery, TX, USA)及人 α 1-抗膜蛋白酶ELISA定量試劑盒(GenWay Biotech, Inc., San Diego, CA, USA),根據生產商的說明書測定。[0158]使用溶解于全標本包埋免疫染色PBS的4%多聚甲醛(PFA)由心穿刺給小鼠灌流。除去形成顱窗的蓋玻片，摘出移植片(厚度約300 μ m)，在溶解于PBS的4%PFA中在冰上放置1.5小時。為了免疫染色，將固定膠原凝膠用PBS清洗3次(各10分鐘)、使用3%BSA/0.l%Triton X-1OO阻斷I小時，與第一抗體一同于4°C溫育一晚。接下來，實施3次使用PBS/0.l%Triton X-100的10分鐘清洗。與第二抗體一同將樣品于4°C溫育一晚，接下來，實施3次使用PBS/0.l%Triton X-100的10分鐘清洗。使用DAPI對組織樣品進行對比染色，包埋于封入劑(Vector Laboratories，USA)中的玻璃載玻片上，加蓋蓋玻片。使用以下的第一抗體:小鼠抗人Z01、小鼠抗人⑶31、及大鼠抗小鼠⑶31 (BD Biosciences)、兔抗小鼠膠原 IV (Millipore, USA)及結蛋白(Dako Corporation, Carpinteria, CA)。免疫染色使用Leica TCS SP5共聚焦顯微鏡進行分析。
[0159]將組織處理及免疫染色組織在4%PFA中于4°C固定一晚，處理，然后在石蠟中包埋。為了使用蘇木精/伊紅(HE)的免疫染色或標準的組織學染色，將橫斷切片(4μπι)加載到MAS包被載玻片(Matsunami, Osaka, Japan)上。免疫染色之前,實施使用檸檬酸緩沖液(pH6.0)的滅菌鍋抗原回收。使用的第一抗體是，抗人:⑶31 ;平滑肌肌動蛋白；AFP ；CK8.18(全部 Dako Corporation)及 ALB(BD Biosciences)。將組織切片與第二抗體 Alexa Fluor(Life Technologies) —同于室溫溫育I小時,接下來進行DAPI (Sigma)核染色。使用LSM510激光掃描顯微鏡(Carl Zeiss C0., Germany)得到像。
[0160]統計學分析數據表示從3或6次獨立的實驗得到的平均值土標準偏差。將3或4組間的比較，依次(依順序)使用Kruskal-Wallis檢驗進行分析,然后將Mann-Whitney的U檢驗與邦弗朗尼補正一同使用而進行事后比較。作為〈0.05的兩側P值被認為是顯著的。
[0161]參考文獻
[0162]1.Klein, A.S.et al.0rgan donation and utilization in the UnitedStates, 1999-2008.Am J TransplantlO, 973-986, (2010).[0163]2.Sanal,M.G.Future of liver transplantation:non-hu·man primates forpatient-specific organs from induced pluripotent stem cells.World J Gastroenteroll7, 3684-3690, (2011).[0164]3.Kriks, S.et al.Dopamine neurons derived from human EScells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease.Nature480, 547-551，(2011).[0165]4.Kroon, E.et al.Pancreatic endoderm derived from human embryonicstem cells generates glucose-responsive insulin-secreting cells in viv0.NatBiotechnol26, 443-452，(2008).[0166]5.S1-Tayeb, K.et a 1.Highly efficient generation of humanhepatocyte-1ike cells from induced pluripotent stem cells.Hepatology51, 297-305, (2010).[0167]6.Jiang, H.et al.Parkin controls dopamine utilization in humanmidbrain dopaminergic neurons derived from induced pluripotent stem cells.NatCommun3, 668, (2012).[0168]7.Cai, J.et al.Directed differentiation of human embryonic stem cellsinto functional hepatic cells.Hepatology45，1229-1239，(2007).[0169]8.Matsumoto，K.，Yoshitomi，H.，Rossant，J.&Zaret，K.S.Liverorganogenesis promoted by endothelial cells prior to vascular function.Science294，559-563， (2001).[0170]9.Espejelj S.et al.1nduced pluripotent stem cell-derived hepatocyteshave the functional and proliferative capabilities needed for liverregeneration in mice.J Clin Investl20，3120-3126，(2010).[0171]10.Sekiyaj S.&Suzuki,A.Direct conversion of mouse fibroblasts tohepatocyte-like cells by defined factors.Nature475，390-393，(2011).[0172]11.Kobayashij T.et al.Generation of rat pancreas in mouseby interspecific blastocyst injection of pluripotent stem cel Is.Celll42，787-799，(2010).[0173]12.Zhao, R.&Duncan, S.A.Embryonic development of the liver.Hepatology41, 956-967, (2005).[0174]13.S1-Tayebj K.，Lemaigrej F.P.&Duncan，S.A.0rganogenesis and developmentof the liver.Dev Celll8， 175-189， (2010).[0175]14.Lee, C.S.，Friedman, J.R.，Fulmer, J.T.&Kaestner，Κ.H.The initiationof liver development is dependent on Foxa transcription factors.Nature435，944-947， (2005).[0176]15.Jung, J., Zheng, M., Goldfarbj M.&Zaret, K.S.1nitiation ofmammalian liver development from endoderm by fibroblast growth factors.Science284， 1998-2003， (1999).[0177]16.GouyssejG.et al.Relationship between vascular developmentand vascular differentiation during liver organogenesis in humans.JHepatol37, 730-740，(2002).[0178]17.Collardeau-Frachonj S.&Scoazec, J.Y.Vascular developmentand differentiation during human liver organogenesis.AnatRec(Hoboken)291，614-627， (2008).[0179]18.Korzhj S.et al.Requirement of vasculogenesis and blood circulation inlate stages of liver growth in zebrafish.BMC Dev Biol8，84，(2008).[0180]19.Koike, N.et al.Tissue engineering: creation of long-lasting bloodvessels.Nature428, 138-139，(2004).[0181]20.Ding, B.S.et al.1nductive angiocrine signals from sinusoidalendothelium are required for liver regeneration.Nature468，310-315，(2010).[0182]21.Ding, B.S.et al.Endothelial-derived a`ngiocrine signals induce andsustain regenerative lung alveolarization.Celll47, 539-553, (2011).[0183]22.Martinez-Hernandezj A.The hepatic extracellular matrix.1.Electronimmunohistochemical studies in normal rat liver.Lab Invest51，57-74， (1984).[0184]23.1shizakij T.et al.Pharmacokinetics of ketoprofen following singleoral, intramuscular and rectal doses and after repeated oral administration.EurJ Clin Pharmacol18，407-414， (1980).[0185]24.Yu，A.M.，Idle, J.R.&Gonzalez, F.J.Polymorphic cytochromeP4502D6: humanized mouse model and endogenous substrates.Drug MetabRev36, 243-277，(2004).[0186]25.Rautioj A.，Kraulj H.，Kojoj A.，Salmelaj E.&Pelkonen，0.1nterindividualvariability of coumarin7-hydroxylation in healthy volunteers.Pharmacogenetics2，227-233，(1992).[0187]26.Katohj M.et al.1n vivo drug metabolism model for humancytochrome P450enzyme using chimeric mice with humanized liver.J PharmSci96，428-437， (2007).[0188]27.Kamimuraj H.et al.Assessment of chimeric mice with humanizedliver as a tool for predicting circulating human metabolites.Drug MetabPharmacokinet25, 223-235，(2010).[0189]28.Chen,A.A.et al.Humanized mice with ectopic artificial livertissues.Proc Natl Acad Sci U S A108， 11842-11847， (2011).[0190]29.Hasegawaj M.et al.The reconstituted’humanized liver’in TK-NOG miceis mature and functional.Biochem Biophys Res Commun 405，405-410，(2011).[0191]30.Mizuguchij T.，Mitakaj T.，Katsuramakij T.&Hirata，K.Hepatocytetransplantation for total liver repopulation.J Hepatobiliary PancreatSurgl2, 378-385，(2005).[0192]31.Dudley, S.C., Jr.Beware of cells bearing gifts: cell replacementtherapy and arrhythmic risk.Circ Res97，99-101，(2005).[0193]32.Sanukij S.et al.A new red fluorescent protein that allows efficientmarking of murine hematopoietic stem cells.J Gene MedlOj 965-971, (2008).[0194]33.Kobayashij S.et al.Reconstruction of human elastic cartilageby a CD44+CD90+stem cell in the ear perichondrium.Proc Natl Acad Sci U SA108， 14479-14484， (2011).[0195]【補充方法】
[0196]【HUVECMSC `分離】
[0197]我們根據由橫浜市立大學倫理委員會制定，承認的指南得到臍帶樣品(承認編號:13120510008)。HUVECs及MSCs，如文獻中記述2、從臍帶同時分離。
[0198]【mFLC分離】
[0199]將從C57BL/6-Tg CAG::EGFP (SLC,日本)分離的 E13.5mFLCs，在 Dulbecco 改良的Eagle培養基(DMEM ;含10%牛胎兒血清(FBS)) (JRH Bioscience，USA)中通過移液器吸吐機械分離。通過實施數次低速離心分離(690rpm/于4°C I分鐘)，將肝細胞與非實質細胞分離。使分離的細胞2次通過70 μ m細胞濾器(Falcon，USA)，得到單細胞。
[0200]【植入的肝細胞形態的定量】
[0201]使用IN Cell Investigator 軟件(GE Healthcare,Fairfield,CT,USA)處理活體內共聚焦像，使用“形狀因子”(將周長與面積關聯的，圓形度的標準的推定)對肝細胞分化的狀態進行分類。此測定值是，以I作為完全的圓，在O~I之間變動。
[0202]【代謝產物組表征的獲得】
[0203]移植60天后，回收hiPSC-LB移植片(n=3)，分析。使用具備Agilent6210小時飛行型質譜分析計，AgilentllOO均一濃度HPLC泵，Agilent G1603A CE-MS適配體試劑盒及Agilent G1607A CE-ES1-MS噴霧器套件的Agilent CE毛細管電泳系統(AgilentTechnologies, ffaldbronn, Germany),實施 CE-TOFMS? 此系統由 CE 用 Agilent G2201AAChemStation 軟件版本 B.03.01 (Agilent Technologies, Waldbronn, Germany)控制。陽離子性代謝物使用作為電解質使用陽離子緩沖溶液(Human Metabolome Technologies)的融合氧化娃毛細管(內徑50 μ m X全長80cm)進行分析。用50mbar的壓力注入樣品10秒鐘(約10nl)。將施加電壓設定為27kV。以陽性離子模式實施電子噴霧離子化質譜分析(ES1-MS)，將毛細管電壓設定為4，000V。從m/z50至1，000掃描質譜分析計。其他條件與在陽離子分析3中同樣。
[0204]陰離子性代謝物使用作為電解質使用陰離子緩沖溶液(Human MetabolomeTechnologies)的融合氧化娃毛細管(內徑50 μ m x全長80cm)進行分析。用50mbar的壓力注入樣品25秒鐘(約25nl)。將施加電壓設定為30kV。以陰性離子模式實施ES1-MS，將毛細管電壓設定為3，500V。從m/z50至1，000掃描質譜分析計。其他條件與在陰離子分析4中同樣。
[0205]將從CE-TOFMS得到的原始數據由作為自動積分軟件的MasterHands5處理。得到含m/z、移動時間(MT)及面積的峰信息。峰面積根據下述的等式變換為相對峰面積。各峰根據CE中的類似的移動時間及由TOFMS確定的m/z值合并。
[0206]相對峰面積=代謝物峰面積/ (內部標準峰面積X樣品量)`[0207]代謝途徑圖譜使用作為公有的軟件的VANTED !Visualisation and Analysis ofNetworks containing Experimental Data6 提供。
[0208]【藥物代謝活性】
[0209]向在顱窗內移植hiPSC-LB的N0D/SCID小鼠(n=3)靜脈內施用酮洛芬(15mg/kg)。作為對照，使用偽手術的N0D/SCID小鼠。將尿(0-2小時)在0.5M醋酸緩沖液(pH5.0)中集合。向尿樣品添加IN Κ0Η，于80°C溫育3小時，其后，使用等容量的IN HCL進行中和。添加含1%醋酸的乙腈，經離心(15000rpm,4°C,5分鐘)。使上清經歷液相層析-串聯質譜分析(LC/MS/MS)。在液相層析實驗中，使用具備Intersil 0DS-3柱(GL Science株式會社、東京、日本)的LC-20A系列(島津、京都、日本)。由層析的分離使用Intersil 0DS-3柱(5μπι，4.6x150mm 1.D.；GL Science株式會社、東京、日本)實現。柱溫度維持在40°C。將包含含有0.1%醋酸(溶劑A)及0.1%醋酸的乙腈(溶劑B)的移動相，根據以下的梯度進度表，以流速0.5mL/分注入:25-80%溶劑B的直線梯度(0-15分鐘)、80%溶劑B( 15-25分鐘)、80_25%溶劑B的直線梯度(25-26分鐘)、及25%溶劑B (26-35分鐘)。將液相層析與4000Q Trap系統(AB SCIEX, Foster City，CA)連結，以陰性電子噴霧離子化模式操作。渦輪氣體維持在600°C。親及/或片段離子用第一四極子過濾，然后作為沖突氣體使用氮而在沖突池內解離。離子噴霧電壓是-4500V，酮洛芬及1-羥基酮洛芬分析的m/z遷移(Q1/Q3)分別是253.1/209.3 及 269.1/209.3。[0210]向在顱窗內(n=3)及腸系膜內(n=3)移植hiPSC-LB的N0D/SCID小鼠經口施用異喹胍(2mg/kg)。作為對照，使用偽手術的N0D/SCID小鼠。施用的0.5、1，2及8小時后，將血液樣品集合，添加肝素鈉。從血液由離心分離血漿。將內部標準(尼氟酸I μ m)及甲醇溶液(100 μ L)添加到5μ L的血漿，經離心(15000rpm，4°C，5分鐘)。使上清經歷LC/MS/MS。在 LC 實驗中，使用具備 Aquity UPLC BEH C18 柱(Waters, Milford, MA, USA)的 AcquityUltraPerformance LC 系統(Waters, Milford, MA, USA)。由層析的分離使用 Acquity UPLCBEH C18 (1.7μπι,2.1x50mm 1.D.;Waters，Milford，MA，USA)實現。柱溫度維持在 40°C。將含有IOmM醋酸銨(溶劑A)及乙腈(溶劑B)的移動相，根據％以下的梯度進度表，以流速0.8mL/分注入:0%溶劑B (0-0.2分鐘)、0_30%溶劑B的直線梯度(0.2-0.3分鐘)、30_60%溶劑B的直線梯度(0.3-0.85分鐘)、60%溶劑B (0.85-1.15分鐘)、60_100%溶劑B的直線梯度(1.15-1.16分鐘)、及100%溶劑B (1.16-1.5分鐘)。將液相層析與API4000系統(ABSCIEX，Foster City, CA)連結，以陽性電子噴霧離子化模式操作。渦輪氣體維持在450°C。親及/或片段離子用第一四極子過濾，然后作為沖突氣體使用氮在沖突池內解離。離子噴霧電壓是5000V，4-羥基異喹胍及內部標準分析的m/z遷移(Q1/Q3)分別是192.6/132.1及283.2/245.4。
[0211]【肝損傷模型】
[0212]為了評價我們的移植戰略的治療的可能性，使用Alb-TRECK/SCID小鼠進行肝損傷研究。Alb-TRECK/SCID 小鼠由 Hiromichi Yonekawa 及 Kunie Matsuoka (東京都臨床醫學綜合研究所)提供。此轉基因系統從ALB增強子/啟動子表達HBEGF，然后施用少量的白喉毒素(DT)的則引發劇癥肝炎7。向用纖維蛋白糊覆蓋的腸系膜中移植hFLCs-LBs。LB移植后，在第2天由尾靜脈注入1.5 μ g/kg DT，引起重度的肝損傷。比較受移植的小鼠和未受移植的小鼠之間的生存。
[0213]補充考察
[0214]功能性肝臟組織制·造中的顱窗模型的可能性
[0215]用于顱窗制備的詳細的順序如前所述8。我們評價了在使用表達EGFP的E13.5小鼠胎兒肝細胞(mFLCs)的移植片來研究肝細胞的成熟上的顱窗的可能性。切出包埋于膠原/纖連蛋白凝膠的mFLCs的一片，置于顱窗之中心部。接下來，使用組織適合性的氰基丙烯酸酯糊使8_的蓋玻片粘接于骨，將此窗密封。活體內熒光顯微鏡成像顯示移植的mFLCs良好地植入，及在移植片內形成功能性血管網(圖21a)。移植的組織廣范分化為類似于肝細胞索、血竇及膽管的組織。這些組織是成體肝臟中特征性的，不是供體E13.5LBs中特征性的(圖21b)。由mFLCs的肝組織再構成隨HGF及EGF (這些已知刺激肝干細胞/前體細胞的增殖)的添加增強(圖22) 9’1(1。從而提示，此移植方法是對于評價LB細胞的成熟及分化有益的活體內監測系統。
[0216]人肝細胞成熟的活體內評價
[0217]在正常肝發生過程中，肝細胞的形態從圓形變化為鋪路石狀的細胞n。此變化可由細胞角蛋白免疫染色容易地可視化(圖16a、左)。使用IN Cell Investigator軟件,我們發現小鼠肝細胞的圓形度(形狀因子)從E13.5時的0.833±0.18降低至生產后8周的
0.568±0.16。同樣地，單細胞形態的活體內成像顯示，移植的EGFP標記hFLCs的圓形度從第O天的0.93±0.07變化為30天后的0.512±0.13 (圖27c、右)。與這些考察一致，酶聯免疫測定法(ELISA)顯示從移植30天后起的人白蛋白產生的出現(圖16c及d)。從而，細胞形態的活體內監測可成為用于預測在體內的肝細胞分化的狀態的一種指標。
[0218]人特異性藥物代謝的檢測
[0219]我們使用酮洛芬(KTP)評價了人特異性藥物代謝功能。KTP在小鼠中被細胞染料P450第一代謝，形成1-羥基酮洛芬(OH-KTP) 12。另一方面，在人中，KTP主要被UDP-葡萄糖醛酰基轉移酶(UGT)代謝，形成酮洛芬葡萄糖醛酸苷(KTP-G) 13。
[0220]肝臟人化小鼠是在研究人特異性藥物代謝上有用的工具。使用高品質的成體肝細胞及有嚴重損傷的肝臟的免疫缺陷小鼠，以前報告了肝臟人化小鼠中的人特異性藥物代謝功能。KTP的施用后觀察到，UGT使KTP葡萄糖醛酸苷化變得容易14、及由水解而KTP代謝為KTP-G。計算ΚΤΡ/0Η-ΚΤΡ峰面積比，在水解樣品和非水解樣品之間比較此面積比。KTP/OH-KTP峰面積比的倍增提示樣品中的KTP-G的形成。有移植的hiPSC-LBs的N0D/SCID小鼠及對照小鼠中的尿中的倍增分別是11.8±5.2及2.3±0.7，提示在移植hiPSC-LBs的NOD/SCID小鼠中觀察到KTP葡萄糖醛酸苷化(人特異性藥物代謝功能)。
[0221]作為對人CYP2D6的一般表現型檢查劑發揮作用的異喹胍在人中被代謝為4_羥基異喹胍(4-0HDB)，但在小鼠中可忽略。重要的是，人CYP2D6與公知藥物的25%的代謝相關，由此，通過多型多數存在，恭獻于顯著的個體差異。異喹胍的經口施用后，在腸系膜或顱接受移植的組中的4-0HDB的血漿濃度相比偽手術組中的濃度更高，這反映人特異性藥物代謝物的產生。
[0222]面向臨床應用的hFLC-或hiPSC-LB的腸系膜移植模型的確立
[0223]由于顱窗模型是高度侵襲性的，對于器官芽移植而言說不上是非常地有效的方法。從而，在推定臨床應用時，更低侵襲性的移植法的開發是必要的。再者，移植可能的量對于逆轉肝功能衰竭而言是不足·夠的。從而，我們試著探討了侵襲性最少、有臨床適宜性的、腸系膜移植模型的可能性。這是因為，對于肝功能的改善而言，門靜脈血流被認為是重要的。與我們的期待一致，最近的報告顯示，恐怕由來自腸系膜血流的宿主血管補充而腹腔部位可支持人成體肝細胞的植入及肝功能的維持15。將在體外增殖的hFLC-LBs或hiPSC-LBs移植到腸系膜上(圖33a)。
[0224]【由2/3份分肝切除的刺激】
[0225]為了確定hiPSC-LB移植片中的肝細胞成熟是否可被HGF等的再生因子促進，在腸系膜移植后第7天實施2/3部分肝切除(PH)。2/3PH實施后，在第30天，人白蛋白的產生從偽手術組的82.lng/ml升高至2/3PH組的121ng/ml (圖33c)。這些的結果提示，恐怕由于hiPSC-LB移植片內的廣范的肝細胞增殖及成熟，hiPSC-Heps可應答于2/3PH后的再生刺激。
[0226]【使用hFLC-LB腸系膜移植的肝功能衰竭的逆轉】
[0227]為了評價使用我們的移植法的治療可能性，將在體外增殖的hFLC-LBs移植到用纖維蛋白糊密封的腸系膜上。作為肝損傷模型，使用在肝細胞特異性白蛋白啟動子的控制下表達人HB-EGF前體的轉基因免疫缺陷小鼠。一旦向被稱為毒素受體媒介細胞敲除/重癥復合免疫缺陷(TRECK/SCID)小鼠的這些小鼠施用少量的白喉毒素(DT)，則會引發劇癥肝炎7。在移植后第2天，以1.5 μ g/kg的用量由尾靜脈注入DT劑。生存曲線顯示，未受移植的TRECK/SCID小鼠的全部在10天以內死亡。作為對照，移植hFLC-LB的TRECK/SCID小鼠的28%生存經40天以上，顯示我們的概念證實的治療上的可能性(圖32d)。但是，此移植模型雖在某種程度良好，但救助率卻不高。這是因為，DT對人細胞有毒性。從而，我們采用免疫缺陷肝損傷模型作為TK-NOG小鼠。這是因為，GCV (對人組織是非毒性的)的施用在適宜的時機誘導轉基因肝實質細胞的組織特異性除去。使用此模型，我們在經功能性人血管網的形成而移植片被預測良好地植入的移植后第7天及第10天除去宿主肝細胞。
[0228]補充參考文獻
[0229]1.Crawford, L.W., Foley, J.F.&Elmore, S.A.Histology atlas of thedeveloping mouse hepatobiliary system with emphasis on embryonicdays9.5-18.5.Toxicol Pathol38，872-906，(2010).[0230]2.Can, A.&Balci，D.1solation, culture, and characterization ofhuman umbilical cord stroma-derived mesenchymal stem cells.Methods MolBiol698，51-62，(2011).[0231]3.Sogaj T.&Heiger, D.N.Amino acid analysis by capillary electrophoresiselectrospray ionization mass spectrometry.Anal Chem72，1236-1241，(2000).[0232]4.Sogaj T.et al.Analysis of nucleotides by pressure-assisted capillaryelectrophoresis-mass spectrometry using silanol mask technique.J ChromatogrA1159， 125-133， (2007).[0233]5.Sugimoto，M.，Wong, D.T.，Hirayama，A.，Soga，T.&T omi t a, M.CapiIIary electrophoresis mass spectrometry-based saliva metabolomicsidentified oral, breast and pancreatic cancer-specific profiles.Metabolomics6，78-95， (2010).[0234]6.Junker, B.H.，Klukasj C.&Schreiber, F.VANTED: a system for advanceddata analysis and visualization in the context of biological networks.BMCBioinformatics7, 109，(2006).[0235]7.Saitoj M.et al.Diphtheria toxin receptor-mediated conditional andtargeted cell ablation in transgeni`c mice.Nat Biotechnoll9，746-750，(2001).[0236]8.Yuan,F.et al.Vascular permeability and microcirculation of gliomasand mammary carcinomas transplanted in rat and mouse cranial windows.CancerRes54，4564-4568， (1994).[0237]9.Suzuki, A.，Iwamaj A.，Miyashitaj H.，Nakauchij H.&Taniguchi，H.Role forgrowth factors and extracellular matrix in controlling differentiation ofprospectively isolated hepatic stem cells.Development 130，2513-2524，(2003).[0238]10.Suzuki,A.et al.Clonal identification and characterization ofself-renewing pluripotent stem cells in the developing liver.J Cell Biol156， 173-184， (2002).[0239]11.Shiojiri, N.et al.Quantitative analysis of cell allocationduring liver development, using the spf(ash)-heterozygous female mouse.Am JPatholl56，65-75， (2000).[0240]12.Populairej P.et al.[Biological behavior:serum levels,excretionand biotransformation of(3-benzoylphenyl)-2-propionic acid, or ketoprofen,inanimals and men].Ann Pharm Fr31，735-749，(1973).[0241]13.1shizakij T.et al.Pharmacokinetics of ketoprofen following singleoral, intramuscular and rectal doses and after repeated oral administration.EurJ Clin Pharmacol18，407-414， (1980).[0242]14.Yamasaki, C.et al.1n vitro evaluation of cytochrome P450andglucuronidation activities in hepatocytes isolated from liver-humanized mice.Drug Metab Pharmacokinet25，539-550， (2010).[0243]15.Chen,A.A.et al.Humanized mice with ectopic artificial livertissues.Proc Natl Acad Sci U S A108， 11842-11847， (2011).[0244]將本說明書中引用的全部的刊物、專利及專利申請直接作為參考并入本說明書中。
[0245]工業實用性
[0246]由本發明的方法制作的組織及器官可在藥物開發篩選等中使用，從而本發明可在制藥產業等利用。·
【權利要求】
1.器官芽的制作方法，其包括將器官細胞和選自下述的至少I種細胞和/或因子一起培養，所述細胞和/或因子為:由血管內皮細胞、間葉系細胞、血管內皮細胞分泌的因子；由間葉系細胞分泌的因子；由于血管內皮細胞和間葉系細胞這二者的存在而分泌的因子。
2.權利要求1所述的器官芽的制作方法，其中器官細胞是分化的細胞。
3.權利要求1所述的器官芽的制作方法，其中器官細胞是未分化的細胞。
4.權利要求1~3中任一項所述的器官芽的制作方法，其中器官細胞是:內胚葉性器官的細胞或可能分化為內胚葉性器官的細胞的細胞、中胚葉性器官的細胞或可能分化為中胚葉性器官的細胞的細胞、或者外胚葉性器官的細胞或可能分化為外胚葉性器官的細胞的細胞。
5.權利要求4所述的器官芽的制作方法，其中器官細胞是內胚葉性器官的細胞或可能分化為內胚葉性器官的細胞的細胞。
6.權利要求5所述的器官芽的制作方法，其中內胚葉性器官是肝臟或胰腺。
7.權利要求1~6中任一項所述的器官芽的制作方法，其中器官細胞是人工多能性干細胞來源的細胞。
8.權利要求7所述的器官芽的制作方法，其中人工多能性干細胞是人來源的。
9.權利要求1~8中任一項所述的器官芽的制作方法，其將器官細胞和選自下述的至少I種細胞和/或因子一起在血管內皮細胞培養用培養基中培養，所述細胞和/或因子為:由血管內皮細胞、間葉系細胞、血管內皮細胞分泌的因子；由間葉系細胞分泌的因子；由于血管內皮細胞和間葉系細胞這二者存在而分泌的因子。
10.權利要求1~9中·任一項所述的器官芽的制作方法，其將器官細胞和選自下述的至少I種細胞和/或因子一起接種于凝膠上進行培養，所述的細胞和/或因子選自由血管內皮細胞、間葉系細胞、血管內皮細胞分泌的因子；由間葉系細胞分泌的因子；由于血管內皮細胞和間葉系細胞這二者存在而分泌的因子。
11.權利要求1~10中任一項所述的器官芽的制作方法，其中血管內皮細胞是分化的細胞。
12.權利要求1~10中任一項所述的器官芽的制作方法，其中血管內皮細胞是未分化的細胞。
13.權利要求1~12中任一項所述的器官芽的制作方法，其中間葉系細胞是分化的細胞。
14.權利要求1~12中任一項所述的器官芽的制作方法，其中間葉系細胞是未分化的細胞。
15.組織或器官的制作方法，其包括將由權利要求1~14中任一項所述的方法制作的器官芽移植進非人動物而分化為組織或器官。
16.器官芽的移植方法,其包括將由權利要求1~14中任一項所述的方法制作的器官芽移植進人或非人動物。
17.權利要求16所述的器官芽的移植方法，其中器官芽的移植部位選自:顱內、腸系膜、肝臟、脾臟、腎臟、腎被膜下、門靜脈上。
18.組織或器官的再生或功能恢復方法，其包括將由權利要求1~14中任一項所述的方法制作的器官芽移植到人或非人動物，分化為組織或器官。
19.非人嵌合體動物的制作方法，其包括將由權利要求1~14中任一項所述的方法制作的器官芽移植進非人動物而分化為組織或器官。
20.評價藥劑的方法，其使用選自由權利要求1~14中任一項所述的方法制作的器官芽、由權利要求15所述的方法制作的組織及器官、以及由權利要求19所述的方法制作的非人嵌合體動物 的至少一種。
【文檔編號】C12N5/10GK103857787SQ201280047078
【公開日】2014年6月11日 申請日期:2012年9月27日 優先權日:2011年9月27日
【發明者】谷口英樹, 武部貴則 申請人:公立大學法人橫濱市立大學