涉及ns5b多肽和假結(jié)的hcv翻譯或復(fù)制的調(diào)節(jié)劑的鑒定方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及充當(dāng)丙肝病毒(HCV)翻譯和/或復(fù)制的調(diào)節(jié)劑的化合物的鑒定方法，和通過該方法鑒定的化合物，以及所述化合物在醫(yī)藥中的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及可用于鑒定HCV翻譯和/或復(fù)制的調(diào)節(jié)劑的RNA。本發(fā)明還涉及制備有復(fù)制能力的HCV病毒的方法。
【專利說明】涉及NS5B多肽和假結(jié)的HCV翻譯或復(fù)制的調(diào)節(jié)劑的鑒定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種充當(dāng)丙肝病毒(HCV)翻譯和/或復(fù)制的調(diào)節(jié)劑的化合物的鑒定方法，以及通過該方法鑒定的化合物和所述化合物在醫(yī)藥中的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及用于鑒定HCV翻譯和/或復(fù)制的調(diào)節(jié)劑的RNA。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生有復(fù)制能力的HCV病毒的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]HCV是全世界重要的病毒病原體，感染全球約I億7000萬個體。如果急性感染沒有得到清除，則病毒引起持續(xù)的肝病從而導(dǎo)致不可逆硬化，并且與每年超過100，000例肝細(xì)胞癌相關(guān)。在美國和歐洲，HCV引起的肝病是肝移植的主要適應(yīng)癥。
[0003]由于目前沒有對抗HCV的疫苗，并且病毒水平的變化使得有效候選物的前景不可靠，因此當(dāng)前的治療限于利巴韋林和PEG化的干擾素-α的組合。急需新的療法。解析HCV基因組結(jié)構(gòu)和功能的反向遺傳學(xué)方法也受到數(shù)量有限的有的體外復(fù)制系統(tǒng)的妨礙。
[0004]因此需要對HCV分子生物學(xué)進(jìn)一步了解來輔助鑒定新的治療靶標(biāo)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明目標(biāo)是涉及HCV病毒的RNA 二級結(jié)構(gòu)的分子相互作用，從而鑒定能夠調(diào)節(jié)HCV翻譯和/或復(fù)制的化合物。對HCV病毒的RNA 二級結(jié)構(gòu)的修飾還使得可以產(chǎn)生有復(fù)制能力的HCV病毒。
[0006]本發(fā)明人令人驚訝地指出，涉及SL9266/PK假結(jié)(本文中也稱為SL9266/PK)的分子相互作用對HCV翻譯有作用。此相互作用還依賴于NS`5B多肽。對于給定化合物對HCV翻譯的調(diào)節(jié)效果的鑒定也能鑒定對HCV復(fù)制的調(diào)節(jié)效果。
[0007]因此，本發(fā)明提供了調(diào)節(jié)HCV翻譯和/或復(fù)制的化合物的篩選方法。該方法利用包含SL9266/PK或其變體和NS5B多肽的RNA形式的上述分子相互作用中的組分。在這些組分的情況下確定了測試化合物對HCV翻譯的效果。這提供了可有助于開發(fā)解決HCV感染的治療策略的藥物開發(fā)新方法。
[0008]另外，本發(fā)明人還指出，對諸如SL9266/PK等HCV病毒的RNA 二級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的修飾對于產(chǎn)生有復(fù)制能力的HCV可具有有益效果。這在允許提供用于分析HCV的改善的體外系統(tǒng)方面帶來另一益處。
[0009]因此，本發(fā)明提供一種調(diào)節(jié)丙肝病毒(HCV)翻譯和/或復(fù)制的化合物的鑒定方法，所述方法包括:
[0010](a)使包含SL9266/PK假結(jié)或其變體和能夠翻譯的報告物編碼序列的RNA在NS5B多肽或其變體的存在下與所述化合物接觸；和
[0011](b)測定所述報告物編碼序列的翻譯。
[0012]根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選方面，所述方法還包括:
[0013](c)將步驟b)中測定的報告物編碼序列的翻譯與對于未與所述化合物接觸的步驟a)中的RNA所獲得的對照值進(jìn)行比較，由此確定所述化合物是否是HCV翻譯和/或復(fù)制的調(diào)節(jié)劑。
[0014]本發(fā)明的方法可用于增強(qiáng)或抑制NS5B多肽對HCV翻譯的阻遏的化合物的鑒定方法，或用于增加或減少HCV復(fù)制的化合物的鑒定方法，或用于適合于預(yù)防或治療HCV感染的化合物的鑒定方法。
[0015]在另一方面，本發(fā)明提供了一種包含SL9266/PK假結(jié)或其變體以及能夠翻譯的報告物編碼序列的RNA。在優(yōu)選實施方式中，所述RNA還包含能夠翻譯的NS5B或NS5B變體編碼序列，可選的是其中所述報告物編碼序列和NS5B或NS5B變體編碼序列位于不同的順反子。
[0016]根據(jù)本發(fā)明，通過本發(fā)明的任何方法鑒定的HCV翻譯和/或復(fù)制的調(diào)節(jié)劑可用于預(yù)防或治療受試對象的HCV感染的方法，所述方法包括對所述受試對象施用有效量的HCV翻譯和/或復(fù)制的調(diào)節(jié)劑。
[0017]在又一方面，本發(fā)明提供一種產(chǎn)生有復(fù)制能力的HCV病毒的方法，所述方法包括:
[0018](a)確定HCV病毒基因組的一個或多個部分的RNA 二級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性；
[0019](b)將所述RNA 二級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性與JFH-1HCV病毒的對應(yīng)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性進(jìn)行比較；和
[0020](c)按照與JFH-1HCV病毒的對應(yīng)結(jié)構(gòu)相似的方式在所述HCV病毒基因組中引入穩(wěn)定所述RNA 二級結(jié)構(gòu)的突變 ，由此產(chǎn)生有復(fù)制能力的HCV病毒。
[0021]在另一方面，本發(fā)明提供一種包含8至48個核苷酸長度的寡核苷酸，其中，所述寡核苷酸與HCV的9266至9314中的部分或全部區(qū)域基本上互補(bǔ)。此類寡核苷酸可用于預(yù)防或治療HCV感染。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1顯示了在兩種不同的體外HCV復(fù)制系統(tǒng)中對SL9266/PK結(jié)構(gòu)的分析。(A)Conlb0 (B)JFH-10關(guān)鍵位置以~為前綴來指示特定核苷酸，并且相鄰的莖環(huán)以反向圖像顯示，上游和“吻合環(huán)”相互作用以灰色陰影菱形標(biāo)出。
[0023]圖2顯示了 SL9266/PK和NS5B介導(dǎo)的翻譯反饋的體外分析。(A)雙順反子報告物系統(tǒng)和帶帽NS5BmRNA。星號表示工程化到雙順反子報告物版本中的終止密碼子，稱為NS5B-停止。(B)在左手側(cè)列出的報告物存在下確定的相對于親本雙順反子報告物標(biāo)準(zhǔn)化的熒光素酶活性。C9302A是SL9266/PK中的點突變。帶帽NS5B mRNA以1:1至1:10摩爾過量反式補(bǔ)充。
[0024]圖3顯示了對不同體外復(fù)制系統(tǒng)中SL9571的結(jié)構(gòu)的分析。各條表示9566-9602區(qū)域中各核苷酸與顯示出更大反應(yīng)性的未配對核苷酸的化學(xué)反應(yīng)性。反向箭頭表示SL9571的推斷的雙鏈區(qū)域,虛線表示與SL9266形成‘吻合環(huán)’時涉及的頂環(huán)(apical loop)。(A)Conlb, (B)JFH-1和(C)具有破壞“吻合環(huán)”相互作用的G9583A突變的JFH-1。
[0025]圖4顯示了在J6/JFH-1和Conlb中的長范圍RNA序列與SL9266的相互作用的示意圖和比較，以及標(biāo)出了特定突變的影響。
[0026]圖5 和 6 分別顯示了 Conlb 的 SL9266 和 SL9571 以及 JFH-1 的 SL9266 和 SL9571的結(jié)構(gòu)和針對它們的寡核苷酸的另外的示意性分析。與實施例所用的寡核苷酸互補(bǔ)的HCV序列以粗體表示。
[0027]圖7顯示了利用雙順反子報告物評價針對SL9266的寡核苷酸對翻譯的效果的測試結(jié)果。1-5道利用了合成NS5B的報告物，6-10道利用了不合成NS5B的報告物。
[0028]圖8顯示了評價針對SL9266和SL9571的寡核苷酸對亞基因組復(fù)制子復(fù)制的效果的測試結(jié)果。
[0029]圖9顯示了在病毒復(fù)制測試中利用針對SL9571和SL9266的寡核苷酸的測試結(jié)
果O
[0030]序列說明
[0031]SEQ ID NO:1是NS5B聚合酶的核酸序列。
[0032]SEQ ID NO: 2是NS5B聚合酶的氨基酸序列。
[0033]SEQ ID NO:3是雙順反子報告物構(gòu)建體的核酸序列。
[0034]SEQ ID N0:4是含有5’ HCV IRES的一部分的HCV核心蛋白編碼序列區(qū)域的核酸序列。
[0035]SEQ ID NO:5是與SL9571莖環(huán)互補(bǔ)的寡核苷酸的核酸序列。
[0036]SEQ ID NO:6是Conlb抗-SL9266LNA寡核苷酸的核酸序列。.[0037]SEQ ID NO:7是隨機(jī)化(randomised)LNA寡核苷酸的核酸序列。
[0038]SEQ ID NO:8是JFH-1抗-SL9266LNA寡核苷酸的核酸序列。
[0039]SEQ ID NO:9 是 Conlb/J`FH-Ι 抗-SL9571LNA 寡核苷酸的核酸序列。
[0040]SEQ ID NO: 10 是 Conlb 核酸序列。
[0041]SEQ ID NO: 11是SL9266_C寡核苷酸的核酸序列。
[0042]SEQ ID NO: 12是SL9266_J寡核苷酸的核酸序列。
[0043]SEQ ID NO: 13 是 Conlb SL9571 核酸序列。
[0044]SEQ ID NO: 14 是 JFH-1SL9266 核酸序列。
[0045]SEQ ID NO: 15 是 JFH-1SL9266 核酸序列。
【具體實施方式】
[0046]應(yīng)當(dāng)理解的是，所公開的方法的不同應(yīng)用可以根據(jù)本領(lǐng)域中的特殊需要而定制。還應(yīng)當(dāng)理解的是，本文所使用的術(shù)語是僅僅用于描述發(fā)明本的具體實施例的目的，而不是意圖限制。此外，除非內(nèi)容另外明確指出，否則在本說明書中和在所附權(quán)利要求中使用的單數(shù)形式“一”、“一個”和“該”包括復(fù)數(shù)對象。因此，例如，述及“化合物”包含“多個化合物”，述及“多肽”包括兩個或多個這樣的多肽等。不論上文還是下文，本文引用的所有出版物、專利和專利申請在此通過引用整體并入本文。
[0047]調(diào)節(jié)HCV翻譯和/或復(fù)制的化合物的鑒定
[0048]本發(fā)明提供了充當(dāng)HCV翻譯和/或復(fù)制的調(diào)節(jié)劑的化合物的鑒定方法。該方法涉及使含有SL9266/PK假結(jié)或其變體和能夠翻譯的報告物編碼序列的RNA在NS5B多肽的存在下與化合物接觸。該方法還涉及測定報告物編碼序列的翻譯。
[0049]該方法也可以用于鑒定增強(qiáng)或抑制NS5B多肽對HCV翻譯的阻遏的化合物。該方法還可用于鑒定增強(qiáng)或抑制的NS5B多肽的RNA聚合酶活性的化合物，或鑒定減小或增大HCV復(fù)制的化合物。該方法也優(yōu)選用于鑒定適于治療或預(yù)防HCV感染的化合物。[0050] RNA
[0051 ] 所述RNA包括SL9266/PK假結(jié)或其變體和可翻譯的報告物編碼序列。RNA可以從如下面所描述的DNA分子轉(zhuǎn)錄。RNA優(yōu)選為單鏈RNA。
[0052]典型的是，該RNA在尺寸上小于天然丙型肝炎病毒基因組，并且不包括HCV基因組的編碼區(qū)或基本上不包括所有的編碼區(qū)。該RNA可以缺乏HCV基因組的E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B和NS5A編碼序列中的一個或多個，例如2個以上、3個以上或所有。RNA可以如下面所描述缺乏核心HCV蛋白的編碼序列，或僅包括其片段。RNA可以缺乏全長NS5B編碼序列，其中NS5B以反式提供。然而，RNA保持足夠的NS5B編碼序列從而允許形成SL9266/PK0
[0053]所述RNA可缺乏5 ’非編碼HCV區(qū)，或可以僅包括足以提供HCV翻譯和/或復(fù)制的其片段。相似的是，所述RNA可缺乏3’非編碼HCV區(qū)，或可以僅包括足以提供HCV翻譯和/或復(fù)制的其片段。然而，所述RNA保留了足夠的3’HCV非編碼區(qū)序列從而允許形成SL9266/PK0
[0054]因此SL9266/PK可以只是包括在RNA中的HCV衍生序列。然而，所述RNA優(yōu)選包括全長的NS5B編碼序列。更優(yōu)選地，所述RNA還包含全長HCV3’非編碼區(qū)和/或全長HCV5’非編碼區(qū)。可使用能夠提供HCV翻譯和/或復(fù)制的HCV3’非編碼區(qū)和/或HCV5’非編碼區(qū)的片段來代替全長非編碼區(qū)。
[0055]優(yōu)選地，所述5’HCV IRES或其片段包含在所述的RNA中。5’HCV IRES包括位于5’非編碼區(qū)并且共約340個核苷酸長度的4個莖環(huán)結(jié)構(gòu)(域1-1V)，并延伸到所述多蛋白編碼序列。將核心編碼區(qū)中的保守結(jié)構(gòu)命名為域V和VI。
[0056]特別優(yōu)選的是所述RNA包括核心蛋白編碼序列或其片段，所述片段包括存在于HCV IRES的3’端的RNA的二級結(jié)構(gòu)區(qū)。此片段下文中進(jìn)一步描述。公開的每一個如上所述的HCV序列可以在所述RNA中以所有可能的排列相互組合。
[0057]所述RNA可以為任何尺寸。通常，所述RNA尺寸為約15kb以下。所述RNA尺寸可以為約12kb以下、約IOkb以下、約9kb以下、約8kb以下、約7kb以下、約6kb以下、約5kb以下、約4kb以下、約3kb以下、約2.5kb以下、約2kb以下、約1.5kb以下、或約Ikb以下。例如，所述RNA尺寸可以為約Ikb至約10kb、約2kb至約10kb、約2kb至約5kb、或約5kb至約 IOkb。
[0058]尺寸較大的RNA，如尺寸約IOkb至約15KB的RNA，通常在提供全長或基本上全長HCV基因組的情況下使用。較小的RNA包括監(jiān)視對HCV翻譯的效果必要的最少元件，即，SL9266/PK或其變體、報告物編碼序列和可選的NS5B編碼序列。例如，SL9266/PK尺寸是約600個核苷酸(nt)，GFP報告物編碼序列尺寸可以為約600nt ;因此這些元件可在約1.2kb尺寸的RNA中提供。優(yōu)選的是，可包括HCV5’NCR (347nt)和第二 IRES (也許另一 350nt)，從而提供約1.9kb尺寸的RNA。
[0059]與SEQ ID NO: 3的雙順反子報告物構(gòu)建體等效的RNA尺寸約4.7kb，并包含HCV5’非編碼區(qū)(7-347nt)、HCV核心蛋白編碼區(qū)的小區(qū)域(348_395nt)、熒光素酶報告物基因(395-2057nt)、源自腦心肌炎病毒的第二內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(2076_2676nt)、V5標(biāo)簽(2677-2721nt.)、NS5B 蛋白(2722_4497nt.)和 HCV 的 3，非編碼區(qū)(4498_4728nt)。
[0060]在所述RNA利用的SL9266 /PK包括核心RNA莖環(huán)序列和莖-環(huán)的5’和3’側(cè)的序列，他們形成擴(kuò)展的RNA 二級結(jié)構(gòu)的區(qū)域，也被描述為假結(jié)。SL9266/PK的序列源自NS5B編碼序列的3’部分，并延伸到丙型肝炎病毒基因組的3’非編碼區(qū)。
[0061]HCV3’非編碼區(qū)的長度為約200個核苷酸，并且包括三個離散的莖環(huán)，被稱為SL1-1II (從3 ‘端編號)，形成已知為X尾部的結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)通過超變結(jié)構(gòu)域和長度與序列可變的嘧啶富集束(pyrmidine-rich tract)與HCV編碼區(qū)隔開。編碼NS5B多肽的3’NCR的5’近端的序列包含5個另外的系統(tǒng)發(fā)生的保守RNA莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，這些根據(jù)本文中所述規(guī)定被指定為 SL9033、SL9132、SL9217、SL9266 和 SL9324。SL9266 預(yù)計占據(jù)包含鄰近的 SL9217(5BSL3.1)和SL9324 (5BSL3.3)莖環(huán)的十字結(jié)構(gòu)中的中心位置。
[0062]稱為SL9266的核心RNA莖環(huán)在本領(lǐng)域中還稱為5BSL3.2或SL_V。SL9266結(jié)構(gòu)包括頂環(huán)和由3’近末端凸起隔開的兩個短堿基配對螺旋(參見圖1)。頂環(huán)和3’近末端凸環(huán)參與了上游和下游遠(yuǎn)程RNA-RNA相互作用，所述相互作用產(chǎn)生了擴(kuò)展RNA 二級結(jié)構(gòu)的區(qū)域。該遠(yuǎn)程相互作用與在SL9266莖環(huán)的上游和下游的約200個核苷酸的序列一起出現(xiàn)。SL9266/PK 的結(jié)構(gòu)在 Diviney 等(J.Virol (2008)82, pp9008_9022)中更詳細(xì)綜述。
[0063]提供SL9266/PK需要提供足夠的HCV基因組序列，以包含SL9266莖環(huán)和參與與莖環(huán)遠(yuǎn)程相互作用、并且可使RNA 二級結(jié)構(gòu)的擴(kuò)展區(qū)域折疊和穩(wěn)定的的上游和下游序列。
[0064]所述RNA使用的天然SL9266/PK通常包括HCV基因組的約9000位核苷酸至約9650位核苷酸的序列、由所述序列組成或基本由所述序列組成。SL9266/PK的變體包括其保留天然SL9266/PK的功能的截短和修飾版本(如下所述)。
[0065]SL9266命名法參考HCV基因型Ia原型株H7722,，其中SL9266核心RNA莖環(huán)的5’核苷酸處于第9266位。HCV基因組的命名法Kuiken，C等(Hepato I οgy(2006) 44，pp1355-1 36 I)和 Lemon 等(Fields virology5thEd.(2007), Hepatitis C virus pl253_1304)綜述。
[0066]通過限定，Kuiken的文章描述`了對所有HCV基因型通用的編號系統(tǒng)。所比對的序列在相同的位置始終具有相同的結(jié)構(gòu)(假設(shè)它們在系統(tǒng)發(fā)生學(xué)上是保守的)。SL9266/PK對于所有HCV基因型而言在系統(tǒng)發(fā)生學(xué)上是保守的。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以參照與本文所述序列給出的核苷酸位置相關(guān)的上述參比序列并外推至其他基因組和基因型中的相似位置。
[0067]本發(fā)明RNA中所用的SL9266/PK可源自任何天然來源的HCV基因型、血清型或分離株或進(jìn)化枝。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，天然存在的HCV病毒可根據(jù)各種生物學(xué)體系分類。本領(lǐng)域技術(shù)人員可基于其常識提供任何天然來源的HCV基因型、血清型或分離株或進(jìn)化枝的SL9266/PK所對應(yīng)的序列。
[0068]HCV基因型通常根據(jù)它們的基因型而指代。HCV基因型編號為I至11，每一種具有多種亞型(a、b、c等)。代表性基因型和登錄號包括:基因型lb(Conl分離株)AJ238799和基因型2a(JFH-l分離株)AB047639。
[0069]HCV病毒可以根據(jù)它們的血清型而指代。血清型對應(yīng)于HCV變體亞種，所述變體亞種由于其衣殼表面抗原的表達(dá)情況而具有獨特的反應(yīng)性，可用于將其與其它變體亞種區(qū)分開。通常，具有特定HCV血清型的病毒不能有效與對任何其他HCV血清型具有特異性的中和抗體發(fā)生交叉反應(yīng)。
[0070]HCV病毒還可以根據(jù)進(jìn)化枝或或克隆來指代。這是指天然來源的HCV病毒的系統(tǒng)發(fā)生學(xué)關(guān)系，通常指可以回溯至共同祖先的HCV病毒的系統(tǒng)發(fā)生學(xué)組，并且包括其所有后裔。另外，HCV病毒可以根據(jù)特定分離株來指代，即，自然中發(fā)現(xiàn)的特定HCV病毒的遺傳分離株。術(shù)語遺傳分離株描述了與其他天然存在的HCV病毒進(jìn)行了有限的遺傳混合的HCV病毒群，從而限定了在遺傳水平可鑒定的獨立群。
[0071]本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)其公知常識可選擇HCV合適的基因型、血清型、進(jìn)化枝、克隆或分離株，來用于提供SL9266/PK和本發(fā)明中所用的RNA的任何其他HCV序列。應(yīng)當(dāng)理解的是，本發(fā)明還包括可能尚未被鑒定或表征的HCV基因型、血清型、進(jìn)化枝、克隆或分離株的HCV基因組的SL9266/PK和任何其他序列的應(yīng)用。
[0072]另外，本發(fā)明包括來自任何已知體外HCV復(fù)制系統(tǒng)的SL9266/PK的應(yīng)用。這些包括由HCV基因型Ib共有序列Conlb產(chǎn)生的亞基因組復(fù)制子(SGR) (Lohmann等，(1999)Science285，ppll0-113)。另一合適的系統(tǒng)是記載為JFH-1/HCVcc的全長基因型2aHCV(Wakita 等，Nat Med(2005) 11，pp791_796)。
[0073]本發(fā)明還包括SL9266/PK變體的應(yīng)用。SL9266/PK的變體是源自SL9266/PK的任何序列，該序列包含SL9266莖環(huán)或其變體以及可使RNA 二級結(jié)構(gòu)的擴(kuò)展區(qū)域折疊和穩(wěn)定的其上游序列和下游的序列。
[0074]如Diviney等(同上)所述，SL9266/PK具有作為HCV的順式作用復(fù)制元件的功能。令人驚訝的是，本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)SL9266/PK對于控制HCV翻譯是必須的。特別是，SL9266/PK連同NS5B的表達(dá)一起控制了翻譯的終止，從而使復(fù)制可以開始。
[0075]因此，SL9266/PK的變體通常包含使得可以從HCV IRES進(jìn)行翻譯的來自HCV基因組的NS5B編碼序列和3’非編碼區(qū)的必要序列。優(yōu)選的是，變體可以包含使得可以從全長天然5’和/或3’非編碼HCV區(qū)的HCV IRES翻譯全長HCV編碼區(qū)的必要序列。變體還可以包含使得HCV基因組體外復(fù)制的來自HCV基因組的NS5`B編碼序列和3’非編碼區(qū)的必要序列。
[0076]另外并且出乎預(yù)料的是，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在SL9266/PK的情況下NS5B HCV RNA聚合酶可以抑制HCV翻譯。
[0077]因此，SL9266/PK的變體在本文中也稱為源自HCV基因組的NS5B編碼區(qū)和3’非編碼區(qū)的、可以使NS5B多肽抑制報告物編碼序列從所述RNA上翻譯的任何序列。
[0078]應(yīng)當(dāng)理解的是，變體SL9266/PK不需要以與野生型天然SL9266/PK相同的程度使NS5B多肽抑制翻譯。SL9266/PK的變體是使得可測定NS5B對翻譯的效果的任何變體，所述翻譯進(jìn)而使得可鑒定測試化合物對HCV翻譯和/或復(fù)制的效果。SL9266/PK的變體可以以利用天然SL9266/PK觀察到的水平的40%以上，通常50%、60%、70%、更優(yōu)選80%、85%、90%、95%以上的水平來翻譯報告物編碼序列。該翻譯效率可以在與HCV IRES可操作地連接的報告物編碼序列的情況下觀察。
[0079]變體SL9266/PK可以包含從HCV基因組的至少約9000位以上的核苷酸例如9010、9020、9030、9040、9050、9060、9070、9080、9090、9100、9110 以上開始并在至少約 9585、9590、9595或9600位核苷酸終止的HCV基因組序列，可以由其組成，或者基本由其組成。公開以上起點位置中的每一個可以與上述終點位置中的每一個組合。
[0080]應(yīng)當(dāng)理解的是，與天然SL9266/PK相比變體SL9266/PK還可以包含內(nèi)部序列的缺失、取代或添加，條件是這些修飾仍然能夠使NS5B多肽抑制報告物編碼序列從所述RNA的翻譯。修飾優(yōu)選不改變SL9266/PK的結(jié)構(gòu)的折疊或穩(wěn)定。優(yōu)選的是，當(dāng)NS5B編碼序列與SL9266/PK組合在所述RNA上提供時，任何所述修飾不削弱編碼的NS5B的功能。
[0081]還優(yōu)選的是，不對存在于SL9266/PK中的介導(dǎo)RNA-RNA相互作用的序列區(qū)中進(jìn)行任何所述修飾。因此，優(yōu)選不對莖環(huán)SL9266的序列進(jìn)行缺失、取代或添加，或不對與莖環(huán)相互作用的該莖環(huán)的上游或下游序列進(jìn)行缺失、取代或添加。“上游”表示序列位于另一序列的5’，例如HCV基因組中莖環(huán)SL9266的5’。“下游”表示序列位于另一序列的3’，例如HCV基因組中莖環(huán)SL9266的3’。
[0082]通常不被修飾的序列包括HCV基因組的核苷酸9110附近的SL9266莖環(huán)上游序列和HCV基因組的核苷酸9580附近的SL9266莖環(huán)下游序列，特別是這些上游和下游序列內(nèi)與例如圖1所示的SL9266莖環(huán)相互作用和/或與例如圖1所示的SL9266莖環(huán)至少部分互補(bǔ)的區(qū)域。
[0083]本文將這些相互作用序列也稱為“上游SL9266-相互作用序列”和“下游SL9266-相互作用序列”。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以選擇適當(dāng)?shù)暮塑账釁^(qū)域，所述核苷酸區(qū)域包含能夠與SL9266莖環(huán)相互作用并穩(wěn)定SL9266莖環(huán)的此類序列。
[0084]通常，不對HCV基因組的從至少約9266位核苷酸至至少約9314位核苷酸的核苷酸區(qū)域，更優(yōu)選從至少約9250位核苷酸至至少約9330位核苷酸的核苷酸區(qū)域進(jìn)行修飾。通常也不對HCV基因組的從至少約9108位核苷酸至至少約9112位核苷酸的核苷酸區(qū)域、更優(yōu)選從至少約9090位核苷酸至至少約9130位核苷酸的核苷酸區(qū)域進(jìn)行修飾。通常也不對HCV基因組的從至少約9571位核苷酸至至少約9586位核苷酸的核苷酸區(qū)域、更優(yōu)選從至少約9550位核苷酸至至少約9590位核苷酸的核苷酸區(qū)域進(jìn)行修飾。
[0085]然而，可以在這 些區(qū)域中引入一個或多個缺失、取代或添加，條件是NS5B多肽保持能夠抑制報告物編碼序列從所述RNA的翻譯即可。下面進(jìn)一步描述對諸如SL9266莖環(huán)等區(qū)域的適合的修飾的選擇。
[0086]變體SL9266/PK還可以只保留等同于上述介導(dǎo)天然SL9266/PK的特異性RNA-RNA相互作用的序列的那些序列區(qū)域，條件是這些區(qū)域以與天然結(jié)構(gòu)相對應(yīng)的距離相互間隔即可。進(jìn)行間隔的選擇從而使得變體SL9266/PK的折疊和構(gòu)象與天然折疊和構(gòu)象相似。插入序列可以隨機(jī)選擇為任何能夠提供NS5B多肽對報告物編碼序列從所述RNA上翻譯的阻遏的序列。
[0087]變體SL9266/PK可包含SL9266或其變體的序列，例如，HCV基因組的從至少約9266位核苷酸至至少約9314位核苷酸的核苷酸序列或其變體，位于本文所述的上游SL9266-相互作用序列3’的約150至約600個核苷酸處。上游-相互作用序列可以是HCV基因組的從至少約9108位核苷酸至至少約9112位核苷酸的序列或其變體。更優(yōu)選的是，SL9266或其變體位于上游SL9266-相互作用序列3’的約200至約500、例如約200至約300個核苷酸處。SL9266序列或其變體可以位于上游SL9266-相互作用序列3’的約150、約170、約180、約190、約200、約210、約220、約230、約240、或約250個核苷酸處。
[0088]變體SL9266/PK可包含SL9266序列或其變體，例如，HCV基因組的從至少約9266位核苷酸至至少約9314位核苷酸的核苷酸序列或其變體，位于本文所述的下游SL9266-相互作用序列5’的約150至約300個核苷酸處。下游-相互作用序列可以是HCV基因組的從至少約9571位核苷酸至至少約9586位核苷酸的序列或其變體。更優(yōu)選的是，SL9266或其變體位于下游SL9266-相互作用序列5’的約200至約250個核苷酸處。SL9266序列或其變體可以位于下游SL9266-相互作用序列5’的約150、約170、約180、約190、約200、約210、約220、約230、約240、或約250個核苷酸處。
[0089]報告物和NS5B編碼序列
[0090]報告物編碼序列編碼為了作為翻譯活性度量而檢測其存在的任何多肽。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠根據(jù)其公知常識來選擇適當(dāng)?shù)膱蟾嫖锞幋a序列，并且作為所用來監(jiān)測HCV翻譯的檢測方法的類型的函數(shù)。
[0091]如下所述，對于報告物編碼序列翻譯檢測翻譯的優(yōu)選方法包括發(fā)光、熒光或免疫測試。因此，報告物編碼序列可以編碼發(fā)光或熒光蛋白，從而可通過測定發(fā)光或熒光信號來檢測翻譯水平。發(fā)光報告物編碼序列的適當(dāng)實例是熒光素酶。作為選擇，報告物編碼序列可編碼其存在能夠利用適當(dāng)抗體進(jìn)行免疫學(xué)檢測的任何多肽。
[0092]報告物編碼序列必須可從所述RNA翻譯。當(dāng)NS5B多肽也在同一 RNA上編碼時，NS5B編碼序列也必須能夠翻譯。因此，報告物編碼序列和NS5B編碼序列位于所述RNA上能夠獲取翻譯所需成分和活性的適當(dāng)位置。報告物或NS5B編碼序列可以位于所述RNA的5’端并包括5’帽。報告物或NS5B編碼序列可以位于所述RNA序列的內(nèi)部位點。在此情形中，報告物編碼序列通常與內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(IRES)可操作地連接。報告物編碼序列的IRES可以具有任何起點和具有任何序列，只要在SL9266/PK的情況下提供所述RNA翻譯即可。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠根據(jù)其常識選擇適當(dāng)?shù)腎RES。
[0093]優(yōu)選的是，報告物編碼序列的IRES源自HCV，即，是HCV IRES。HCV IRES可以源自任何天然來源的HCV基因型、血清型、或進(jìn)化枝，包括上文具體描述的那些。天然HCV IRES位于HCV基因組的5’非編碼區(qū)并`延伸到核心蛋白編碼區(qū)。
[0094]還可以使用變體HCV IRES。變體HCV IRES是可允許報告物從本發(fā)明RNA上翻譯的源自HCV IRES的任何序列。變體包括具有核苷酸取代和/或內(nèi)部缺失或添加的截短形式和序列。本文所述的具體截短HCV IRES如SEQ ID N0:4所示，并僅包含源自核心蛋白編碼序列的HCV IRES的一部分。該區(qū)域包含多種明確確定的RNA 二級結(jié)構(gòu)。上述截短HCVIRES不具有可以使其自己翻譯的功能，但可以與可進(jìn)行報告物編碼序列的翻譯的另一要素(即，另外的IRES或5’帽)組合提供。上述截短HCV IRES優(yōu)選包含在本發(fā)明的RNA中。
[0095]NS5B編碼序列的IRES也可以從任何來源提供，但優(yōu)選不源自HCV。適當(dāng)?shù)腎RES的實例是來自EMCV IRES的IRES，不過也可以替代性使用另一來源(病毒或細(xì)胞)的IRES。
[0096]當(dāng)所述RNA包含報告物編碼序列和NS5B編碼序列時，這些序列通常在所述RNA的不同順反子上提供。這兩種順反子可以在任何適當(dāng)?shù)臉?gòu)造提供，所述構(gòu)造使的兩種編碼序列在SL9266/PK的情況下翻譯。優(yōu)選的是報告物編碼序列在NS5B編碼序列的5’。然而，NS5B編碼序列可以在報告物編碼序列的5’。
[0097]SL9266/PK或其變體優(yōu)選位于報告物編碼序列的3’。然而，SL9266/PK還可以位于報告物編碼序列的5’，條件是NS5B多肽能夠阻遏報告物編碼序列從所述RNA上的翻譯即可。
[0098]除了 SL9266/PK或其變體、報告物編碼序列和可選的是NS5B編碼序列以外，所述RNA還可以包含輔助翻譯的任何其他調(diào)節(jié)序列。例如，所述RNA可包含與報告物編碼序列相鄰的5’ UTR或3’ UTR，提供增強(qiáng)翻譯的序列。[0099]NS5B多肽及其變體
[0100]所述方法在NS5B多肽或其變體的存在下進(jìn)行。NS5B RNA聚合酶的cDNA序列如SEQ ID NO:1所示，編碼如SEQ ID NO: 2所示的蛋白。
[0101]NS5B多肽或其變體是任何阻遏報告物編碼序列從本發(fā)明的RNA上翻譯的多肽。NS5B多肽或其變體還可以進(jìn)行HCV基因組的復(fù)制，但這不是必要的。如下所述，NS5B多肽或其變體阻遏報告物編碼序列翻譯的能力可由本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)確定。優(yōu)選的是，與SEQID NO:2的多肽相比，NS5B多肽或變體對報告物編碼序列的翻譯提供相似或更高的阻遏。
[0102]SEQ ID N0:1或2的變體可包括其截短體、突變體或同源物。SEQ ID NO:1的變體可以是其任何編碼功能性NS5B多肽的轉(zhuǎn)錄變體。
[0103]本文提及的任何同源物通常與SEQ ID N0:1或2的相關(guān)區(qū)域有至少70%的同源性。
[0104]同源性可利用已知方法測定。例如UWGCG軟件包提供可用于計算同源性的BESTFIT程序(例如以其默認(rèn)設(shè)置來使用)(Devereux等(1984) Nucleic AcidsResearchl2, 387-395)。PILEUP和BLAST算法可用于計算同源性或?qū)R序列(通常為其默認(rèn)設(shè)置)，例如如 Altschul S.F.(1993) J Mol Evol36:290-300;Altschul，S，F(xiàn) 等(1990)J Mol Biol215:403-10 中所述。進(jìn)行 BLAST 分析的軟件可通過 National Center forBiotechnology Information (http: //www.ncb1.nlm.nih.gov/)公開獲得。
[0105]在優(yōu)選實施方式中，變體序列可編碼與SEQ ID NO: 2的相關(guān)區(qū)域在至少20、優(yōu)選至少30、如至少40、60、100、200、300、400以上個連續(xù)氨基酸或者甚至在變體整個序列上有至少55%、65%、70%、75%、80%、85%、90%并且更優(yōu)選至少95%、97%或99%同源性的多肽。相關(guān)區(qū)域是在阻遏報告物編碼序列從本發(fā)明的RNA上翻譯中提供NS5B功能活性的區(qū)域。所述區(qū)域可以是與核仁、p68(螺旋酶)、heIF4All、hPLICl (泛素樣)或親環(huán)素B相互作用的NS5B區(qū)域。
[0106]作為選擇并且優(yōu)選的是，變體序列可編碼在其整個序列上與全長SEQ ID N0:2有至少70%、75%、80%、85%、90%并且更優(yōu)選至少95%、97%或99%同源性的多肽。通常，變體序列與SEQ ID N0:2的相關(guān)區(qū)域相差至少或小于2、5、10、20、40、50或60個突變(其中每一個可以是取代、插入或缺失)。
[0107]變體NS5B多肽在上述序列的任何長度上可以與SEQ ID N0:2的特定區(qū)域具有與任何特定百分比同源性值相同的百分比同一性(即，其可以具有至少70%、80%或90%并且更優(yōu)選至少95%、97%或99%同一性)。
[0108]SEQ ID NO:2的變體也包括截短體。可以使用任何截短體，只要所述變體仍然能夠阻遏報告物編碼序列從本發(fā)明的RNA上翻譯。通常制備截短體以去除對阻遏翻譯的活性不必要的和/或不影響折疊蛋白構(gòu)象或與相關(guān)的相互作用蛋白的蛋白-蛋白相互作用的序列。合適的截短體通常通過從N末端或C末端系統(tǒng)性截短不同長度序列來鑒定。優(yōu)選的截短體是N末端截短體并且可去掉除催化域之外的所有其他序列。
[0109]SEQ ID NO:2的變體還包括相對于SEQ ID NO:2的特定區(qū)域具有I個以上，例如2、3、4、5至10、10至20、20至40以上氨基酸插入、取代或缺失的突變體。缺失和插入和取代通常在對遏制翻譯的活性非必須的和/或不影響折疊蛋白構(gòu)象的區(qū)域中進(jìn)行。
[0110]取代優(yōu)選引入一個或多個保守變化，其將氨基酸替換為具有相似化學(xué)結(jié)構(gòu)、相似化學(xué)性質(zhì)或相似側(cè)鏈體積的其他氨基酸替換。所引入的氨基酸可與其所替代的氨基酸具有相似極性、親水性、疏水性、堿性、酸性、中性或電荷。作為選擇，保守變化可引入芳香性或脂肪性氨基酸替換原有的芳香性或脂肪性氨基酸。
[0111]保守氨基酸變化是本領(lǐng)域公知的，并且可以根據(jù)下表A限定的20種主要氨基酸的性質(zhì)選擇。典型的取代的實例是SEQ ID N0:2的甲硫氨酸殘基的突變，例如位于序列中2位的甲硫氨酸殘基突變?yōu)楸彼幔瑥亩乐共黄谕膬?nèi)部翻譯開始。
[0112]相似的是，可用于提供NS5B多肽或其變體的SEQ ID NO:1的多核苷酸序列的優(yōu)選的變體包括與SEQ ID NO:1的相關(guān)區(qū)域具有至少70%、75%、80%、85%、90%并且更優(yōu)選至少95%、97%或99%同源性的多核苷酸。優(yōu)選所述變體顯示出與全長SEQ ID NO:1其整個序列的這些水平的同源性。
[0113]表A-氨基酸的化學(xué)性質(zhì)
【權(quán)利要求】
1.一種調(diào)節(jié)丙肝病毒(HCV)翻譯和/或復(fù)制的化合物的鑒定方法，所述方法包括: (a)使包含SL9266/PK假結(jié)或其變體和能夠翻譯的報告物編碼序列的RNA在NS5B多肽或其變體的存在下與所述化合物接觸；和 (b)測定所述報告物編碼序列的翻譯。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，所述方法還包括: (c)將步驟b)中測定的報告物編碼序列的翻譯與對于未與所述化合物接觸的步驟a)中的RNA所獲得的對照值進(jìn)行比較，由此確定所述化合物是否是HCV翻譯和/或復(fù)制的調(diào)節(jié)劑。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述NS5B多肽或其變體反式表達(dá)。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述RNA還包含能夠翻譯的NS5B或NS5B變體編碼序列。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述報告物編碼序列和NS5B或NS5B變體編碼序列從所述RNA的不同順反子翻譯。
6.如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中，所述報告物編碼序列和/或所述NS5B或NS5B變體編碼序列與內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(IRES)可操作地連接。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中，與所述報告物編碼序列可操作地連接的所述IRES是 HCV IRES0
8.如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中，所述SL9266/PK假結(jié)包含在源自HCV的3’非編碼區(qū)中，和/或所述RNA包含源自HCV的5’非編碼區(qū)。`
9.一種增強(qiáng)或抑制NS5B多肽對HCV翻譯的阻遏的化合物的鑒定方法，所述方法包括進(jìn)行前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，由此鑒定增強(qiáng)或抑制所述NS5B多肽對HCV翻譯的阻遏的化合物。
10.一種增加或減少HCV復(fù)制的化合物的鑒定方法，所述方法包括進(jìn)行權(quán)利要求1至8中任一項所述的方法，從而鑒定增加或減少HCV復(fù)制的化合物。
11.一種適合于預(yù)防或治療HCV感染的化合物的鑒定方法，所述方法包括進(jìn)行前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，由此鑒定適合于預(yù)防或治療與HCV感染相關(guān)的疾病的化合物。
12.—種RNA，所述RNA包含SL9266/PK假結(jié)或其變體以及能夠翻譯的報告物編碼序列。
13.如權(quán)利要求12所述的RNA，所述RNA還包含能夠翻譯的NS5B或NS5B變體編碼序列。
14.如權(quán)利要求13所述的RNA，其中，所述報告物編碼序列和NS5B或NS5B變體編碼序列位于不同的順反子。
15.如權(quán)利要求11至14中任一項所述的RNA，其中，所述報告物編碼序列和/或所述NS5B或NS5B變體編碼序列可操控地連接至內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(IRES)。
16.如權(quán)利要求15所述的RNA，其中，與所述報告物編碼序列可操作地連接的所述IRES是 HCV IRES0
17.如權(quán)利要求12至16中任一項所述的RNA，其中，所述SL9266/PK假結(jié)包含在源自HCV的3’非編碼區(qū)中，和/或所述RNA包含源自HCV的5’非編碼區(qū)。
18.一種通過權(quán)利要求1至11中任一項所述的方法鑒定的HCV翻譯和/或復(fù)制的調(diào)節(jié)劑。
19.權(quán)利要求18所述的HCV翻譯和/或復(fù)制的調(diào)節(jié)劑在制備用于預(yù)防或治療HCV感染的藥物中的應(yīng)用。
20.一種預(yù)防或治療受試對象中HCV感染的方法，所述方法包括對所述受試對象施用有效量的權(quán)利要求18所述的HCV翻譯和/或復(fù)制的調(diào)節(jié)劑。
21.一種權(quán)利要求18所述的HCV翻譯的調(diào)節(jié)劑，所述調(diào)節(jié)劑用于預(yù)防或治療HCV感染的方法。
22.—種產(chǎn)生有復(fù)制能力的HCV病毒的方法，所述方法包括: (a)確定HCV病毒基因組的一個或多個部分的RNA二級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性；(b)將所述RNA二級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性與JFH-1HCV病毒的對應(yīng)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性進(jìn)行比較；和 (c)按照與JFH-1HCV病毒的對應(yīng)結(jié)構(gòu)相似的方式在所述HCV病毒基因組中引入穩(wěn)定所述RNA 二級結(jié)構(gòu)的突變，由此產(chǎn)生有復(fù)制能力的HCV病毒。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中，所述RNA二級結(jié)構(gòu)包含來自所述HCV病毒基因組的編碼區(qū)和/或3’非編碼區(qū)的RNA 二級結(jié)構(gòu)。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其中，所述RNA二級結(jié)構(gòu)包含SL9266/PK假結(jié)。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其中，在所述HCV病毒中所述突變增強(qiáng)SL9266/PK的頂環(huán)相互作用的穩(wěn)定性和/或降低SL9266/PK的凸環(huán)相互作用的穩(wěn)定性。
26.如權(quán)利要求22至25中任一項所述的方法，其中，所述突變改變所述RNA二級結(jié)構(gòu)之中或之間的氫鍵合。
27.如權(quán)利要求22至26中任一項所述的方法，其中，當(dāng)將所述突變引入到所述HCV病毒基因組的編碼區(qū)中時，它們不損害所編碼蛋白的功能。
28.—種長度為包含8至48個核苷酸的寡核苷酸，其中，所述寡核苷酸與HCV的9266至9314中的部分或全部區(qū)域基本上互補(bǔ)。
29.如權(quán)利要求28所述的寡核苷酸，其中，所述寡核苷酸長度為8至30個核苷酸。
30.如權(quán)利要求28或29所述的寡核苷酸，其中，所述寡核苷酸與HCV的9266至9314中的部分或全部區(qū)域100%互補(bǔ)；或者其中，所述寡核苷酸包含1、2、3或4個錯配。
31.如權(quán)利要求28至30中任一項所述的寡核苷酸,其中,所述寡核苷酸包含一個或多個鎖核酸。
32.如權(quán)利要求28至31中任一項所 述的寡核苷酸，所述寡核苷酸用于預(yù)防或治療HCV感染。
【文檔編號】C12Q1/70GK103827323SQ201280047148
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2012年8月17日 優(yōu)先權(quán)日:2011年8月19日
【發(fā)明者】D·J·埃文斯, P·西蒙茲 申請人:華威大學(xué), 愛丁堡大學(xué)評議會