鎘吸收控制基因、蛋白質、及鎘吸收抑制水稻的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供與根的Cd吸收的促進或抑制有關的轉運蛋白基因、其突變基因及轉運蛋白、以及抑制Cd吸收的水稻及Cd吸收抑制水稻的篩選、育成方法。是包含由序列編號2所表示的DNA堿基序列且編碼與鎘吸收的抑制相關的轉運蛋白的基因、包含由序列編號3所表示的DNA堿基序列且編碼與鎘吸收的抑制相關的轉運蛋白的基因、包含由序列編號4所表示的DNA堿基序列且編碼與鎘吸收的抑制相關的轉運蛋白的基因、及包含序列編號1所記載的氨基酸序列且與鎘吸收的抑制相關的轉運蛋白。
【專利說明】鎘吸收控制基因、蛋白質、及鎘吸收抑制水稻
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及與根的鎘(以下簡稱為Cd。)吸收的抑制相關的轉運蛋白基因及轉運蛋白、以及Cd吸收受到抑制的水稻突變體及低Cd吸收水稻品種。
【背景技術】
[0002]FA0/WH0的合同食品規(guī)格委員會為了減輕因食品中所含的Cd的攝取而導致的健康受害風險，而制定了規(guī)定食品中的Cd濃度的國際基準值。接受該基準值，日本在2011年2月修改了食品衛(wèi)生法，稻米的規(guī)定值從Imgkg4 (糙米)大幅地變更為0.4mgkg_1 (糙米和精米)。因此，當務之急是開發(fā)出使水稻的Cd吸收減少的技術。
[0003]作為水稻的Cd吸收減少技術，到目前為止，實施了利用換土而進行的土壤復原、土壤改良材料的投入、蓄水管理等務農(nóng)技術(參照例如專利文獻I及2。)。但是，就已有的方法而言，在所需年數(shù)、成本、效果方面看，還存在很多問題。
[0004]現(xiàn)有技術文獻
[0005]專利文獻
[0006]專利文獻1:日本特開2011 - 83194號公報
[0007]專利文獻2:日本特開2011 - 6529號公報

【發(fā)明內容】

[0008]發(fā)明所要解決的課題
[0009]作為替代已有的方法的技術，雖然低Cd吸收水稻品種的開發(fā)、導入在經(jīng)濟上來說環(huán)境負荷少、并且具有可持續(xù)的優(yōu)點，但是到目前為止尚無開發(fā)出低Cd吸收水稻品種的報告例。本發(fā)明的課題在于，提供與根的Cd吸收的控制相關的轉運蛋白、轉運蛋白基因及其突變基因、以及Cd吸收受到抑制的水稻及Cd吸收抑制水稻的篩選、育成方法。
[0010]用于解決課題的手段
[0011]本發(fā)明人對水稻種子照射重離子束，從所得的植物體中篩選低Cd吸收水稻突變體。進而，確定出所得的突變體的原因基因，從而完成了本發(fā)明。即，本發(fā)明如下所述。
[0012]< I >本發(fā)明為一種基因，其包含下述(A)至(C)中的任一個堿基序列且編碼與鎘吸收的控制相關的轉運蛋白:
[0013](A)由序列編號2所表示的DNA堿基序列，
[0014](B)在序列編號2中記載的堿基序列中I個或多個堿基發(fā)生了缺失、置換或添加的喊基序列，并且是編碼控制鋪吸收的蛋白質的基因的DNA喊基序列，
[0015](C)與序列編號2中記載的堿基序列在嚴格的條件下進行雜交、且編碼控制鎘吸收的蛋白質的基因的DNA喊基序列。
[0016]< 2 >進而，本發(fā)明為一種基因，其包含下述(D)至(F)中的任一個堿基序列且編碼與鎘吸收的控制相關的轉運蛋白:
[0017](D)由序列編號3所表示的DNA堿基序列，[0018](E)在序列編號3中記載的堿基序列中I個或多個堿基發(fā)生了缺失、置換或添加的喊基序列，并且是編碼控制鋪吸收的蛋白質的基因的DNA喊基序列，
[0019](F)與序列編號3中記載的堿基序列在嚴格的條件下進行雜交、且編碼控制鎘吸收的蛋白質的基因的DNA喊基序列。
[0020]< 3 >進而，本發(fā)明為一種基因，其包含下述(G)至(I)中的任一個堿基序列且編碼與鎘吸收的控制相關的轉運蛋白:
[0021 ] (G)由序列編號4所表示的DNA堿基序列，
[0022](H)在序列編號4中記載的堿基序列中I個或多個堿基發(fā)生了缺失、置換或添加的喊基序列，并且是編碼控制鋪吸收的蛋白質的基因的DNA喊基序列，
[0023](I)與序列編號4中記載的堿基序列在嚴格的條件下進行雜交、且編碼控制鎘吸收的蛋白質的基因的DNA喊基序列。
[0024]< 4 >進而，本發(fā)明為一種轉運蛋白，其包含下述(J)至(L)中的任一個氨基酸序列且與鎘吸收的控制相關:
[0025](J)序列編號I中記載的氨基酸序列，
[0026](K)在序列編號I中記載的氨基酸序列中I個或多個氨基酸發(fā)生了缺失、置換或添加的氨基酸序列，并且是控制鎘吸收的蛋白質的氨基酸序列，
[0027](L)與序列編號I中記載的氨基酸序列具有至少90%以上的同源性的氨基酸序列，并且是控制鎘吸收的蛋白質的氨基酸序列。
[0028]< 5 >進而，本發(fā)明為一種轉運蛋白，其包含下述(M)至(O)中的任一個氨基酸序列且與鎘吸收的控制相關:
[0029](M)序列編號5中記載的氨基酸序列，
[0030](N)在序列編號5中記載的氨基酸序列中I個或多個氨基酸發(fā)生了缺失、置換或添加的氨基酸序列，并且是控制鎘吸收的蛋白質的氨基酸序列，
[0031](O)與序列編號5中記載的氨基酸序列具有至少90%以上的同源性的氨基酸序列，并且是控制鎘吸收的蛋白質的氨基酸序列。
[0032]< 6 >進而，本發(fā)明為一種轉運蛋白，其包含下述(P)至(R)中的任一個氨基酸序列且與控制鎘吸收相關:
[0033](P)序列編號6中記載的氨基酸序列，
[0034](Q)在序列編號6中記載的氨基酸序列中I個或多個氨基酸發(fā)生了缺失、置換或添加的氨基酸序列，并且是控制鎘吸收的蛋白質的氨基酸序列，
[0035](R)與序列編號6中記載的氨基酸序列具有至少90%以上的同源性的氨基酸序列，并且是控制鎘吸收的蛋白質的氨基酸序列。
[0036]< 7 >進而，本發(fā)明是一種包含上述< I >至< 3 >中任一項所述的DNA的重組載體。
[0037]< 8 >進而，本發(fā)明是一種包含上述< 2 >或< 3 >所述的DNA的轉化體、或是缺失了上述< I >所述的DNA的轉化體。
[0038]< 9 >進而，本發(fā)明是一種通過使用上述< 7 >所述的重組載體而得的轉化體。
[0039]< 10 >進而，本發(fā)明是一種能夠識別上述< I >至< 3 >中任一項所述的DNA堿基序列的基因標記。[0040]< 11 >進而，本發(fā)明是一種將上述< 4 >所述的蛋白質的功能加以抑制的鎘吸收抑制水稻。
[0041]< 12 >進而，本發(fā)明是一種上述< 2 >或< 3 >所述的基因編碼的蛋白質進行表達的鎘吸收抑制水稻。
[0042]< 13 >進而，本發(fā)明是上述< 11 >或< 12 >所述的鎘吸收抑制水稻，其出穗、收獲量、味道與水稻品種越光為相同程度。
[0043]< 14 >進而，本發(fā)明是上述< 11 >或< 12 >所述的鎘吸收抑制水稻，其中，所述鎘吸收抑制水稻的出穗比水稻品種越光早約2周左右。
[0044]< 15 >進而，本發(fā)明是一種上述< 11 >至< 14 >中任一項所述的鎘吸收抑制水稻突變體的篩選方法，其包括下述(A)的步驟和(B)的步驟、或者包括(A)的步驟和(C)的步驟，
[0045](A)將照射重離子束后的第I代種子栽培在田地中并收集第2代種子的步驟，
[0046](B)將在所述(A)的步驟中得到的第2代種子栽培在含有Cd的水培液中，收集切除莖葉而分泌出的導管液，根據(jù)該導管液中所含的Cd濃度來篩選Cd吸收抑制水稻突變體，并且收集第3代種子的步驟。
[0047](C)將在所 述(A)的步驟中得到的第2代種子的幼苗個體栽培在Cd污染土壤中，根據(jù)第3代種子的Cd濃度來篩選鎘吸收抑制水稻突變體的步驟。
[0048]< 16 >進而，本發(fā)明是一種鎘吸收抑制水稻，其是通過上述< 11 >至< 14 >中任一項所述的鎘吸收抑制水稻突變體與已有的水稻品種的雜交而得的。
[0049]發(fā)明效果
[0050]本發(fā)明提供實用性高的低Cd吸收水稻品種。進而，通過將本發(fā)明的低Cd吸收水稻品種作為母本，從而能夠在不進行基因重組操作的情況下育成新型的低Cd吸收水稻品種，另外，通過使用本發(fā)明的DNA標記，從而能夠高效地篩選出低Cd吸收水稻品種。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0051]圖1是表示在Cd污染田地中栽培時的糙米(brown rice)的鎘濃度。
[0052]圖2是表示越光(Koshihikari)與低Cd突變系統(tǒng)的生育狀態(tài)的說明圖。
[0053]圖3是表示將#3-6-4與力寸5 ^ (Kasalath)雜交而得的F2個體(92個體)的莖葉Cd濃度的頻度分布的圖。
[0054]圖4是表示通過基因作圖來推定的低Cd基因的存在位置的圖。
[0055]圖5是表示在#7-3-6和#3_6_4的基因組DNA上的堿基的缺失和插入位置的圖。
[0056]圖6是表示越光(Koshihikari)與突變體的通過PCR而得到的DNA擴增片段長度的差異的電泳結果圖。
[0057]圖7是表示對導入了 TRECA基因和treca_l基因的各酵母突變株在SD瓊脂培養(yǎng)基中分別進行處理時的酵母的增殖程度的結果圖。
[0058]圖8是表示TRECA蛋白與treca_l蛋白的局部存在性的熒光觀察圖。
[0059]圖9是使用基因標記來表示越光(Koshihikari)與突變體(#3_6_4，#3-5-20)的DNA擴增片段長度的差異的電泳結果圖。
[0060]圖10是使用基因標記來表示越光(Koshihikari)與突變體(#7-3-6)的DNA擴增片段長度的差異的電泳圖。
【具體實施方式】
[0061]本發(fā)明是通過對將在花的育種等中經(jīng)常使用的重離子束照射于水稻而得的低Cd吸收水稻品種的基因進行分析而得的、與CM吸收的控制有關的轉運(Transporterregulating cadmium absorption,調控鎘吸收的轉運蛋白、以下簡稱為TRECA。)蛋白、TRECA基因及該TRECA基因的突變基因(以下簡稱為treca。)，進而是包含該突變基因的低Cd吸收水稻品種及使用該低Cd吸收水稻品種而得的新的低Cd吸收水稻品種。需要說明的是，在本發(fā)明中“控制鎘吸收”是指，與鎘吸收的促進、抑制相關的情況。以下，對于本發(fā)明詳細進行說明。
[0062]<關于 TRECA 基因>
[0063]本發(fā)明的TRECA基因是編碼序列編號I所示的與鎘吸收的控制相關的轉運蛋白的、序列編號2所示的基因。序列編號2所示的堿基序列是通過對照射上述重離子束而得的Cd吸收抑制水稻的基因進行分析而確定出的堿基序列。本發(fā)明是來自TRECA基因的重金屬轉運蛋白基因的起始密碼子至終止密碼子為止的、所謂的開放閱讀框(以下稱作0RF。)。
[0064]上述TRECA 基因是在 RAP-DB(The Rice Annotation Project Database)、NCBI (The National Center for Biotechnology Information)等記載了遺傳信息的數(shù)據(jù)庫中，根據(jù)與功能已知的擬南芥的堿基序列的同源性等注視為具有重金屬輸送功能的基因的Nramp基因的一種。在RAP-DB中，記載為“similar to OsNrampl”,在NCBI中記載為“0sNramp5”，但對于其功能來說，尤其是對于具有控制水稻的鎘吸收的功能而言，是以往完全不知道的。
[0065]本發(fā)明所述的TRECA基因優(yōu)選為包含由序列編號2所示的堿基序列構成的多核苷酸的0RF，只要包含相當于該部分的部分，就可以為任意基因。例如，在該ORF上加入5’以及3’ UTR后的基因也包含在本發(fā)明中。
[0066]對于本發(fā)明的TRECA基因來說，包括例如編碼包含在序列編號I中記載的氨基酸序列中I個或數(shù)個氨基酸發(fā)生了置換、缺失、添加和/或插入后的氨基酸序列的蛋白質的突變體、誘導體。
[0067]另外，即使在堿基序列發(fā)生了突變的情況下，也存在其不伴隨蛋白質中的氨基酸突變的情況(簡并突變)，這樣的簡并突變體也包括在本發(fā)明的基因中。
[0068]獲得上述基因的方法并沒有特別限定，可采用一般的方法。例如，從具有該基因的生物的基因組DNA、基因組DNA文庫等中利用適當?shù)南拗菩詢惹忻笇⒃摶蚯谐霾⑦M行純化即可。即，本發(fā)明的重金屬轉運蛋白基因中包括基因組DNA以及化學合成DNA。基因組DNA的制備可以利用對于本領域技術人員而言常規(guī)的手段來進行。基因組DNA例如能夠通過如下方式加以制備:從對象生物中提取基因組DNA，制成基因組文庫(作為載體，可利用質粒、噬菌體、黏粒、BAC、PAC等)，將其展開，使用以編碼本發(fā)明的蛋白質的DNA(序列編號2)作為基礎而制備出的探針，進行菌落雜交或噬菌斑雜交，由此來進行制備。
[0069]另外，還能夠如下地加以制備:制成對編碼本發(fā)明的重金屬轉運蛋白的DNA(序列編號2)特異的引物，進行利用該引物的PCR。
[0070]具體來說，為了制備編碼與序列編號I中記載的重金屬轉運蛋白在功能上同等的蛋白質的基因，作為本領域技術人員熟知的方法，可舉出利用“Southern，E.M.Journal of Molecular Biology, 98，503 (1975) ” 所記載的雜交技術、“Saiki, R.K.等Science, 230，1350-1354 (1985)、Saiki, R.K.等 Science, 239，487-491 (1988) ” 所記載的聚合酶鏈式反應(PCR)技術的方法。能夠這樣地通過雜交技術或PCR技術而分離出的編碼與本發(fā)明的重金屬轉運蛋白具有同等的功能的蛋白質的基因也包括在本發(fā)明的基因中。
[0071]對于通過上述而分離出的基因來說，可認為在其編碼的氨基酸水平上與本發(fā)明的蛋白質的氨基酸序列(序列編號I)具有高同源性。高同源性是指，在氨基酸序列全體中為80%以上、進一步優(yōu)選為90%以上、特別優(yōu)選為95%以上的序列的相同性。序列的相同性可通過 FASTA 檢索(Pearson ff.R.D.J.Lipman (1988)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA.85:2444-2448)或 BLASTP 檢索來確定。
[0072]< 關于 TRECA 蛋白 >
[0073]本發(fā)明所述的TRECA蛋白是由TRECA基因來編碼、存在于細胞膜上、控制鎘及錳的吸收的蛋白質。在后述的全部缺失了編碼本發(fā)明的TRECA蛋白的基因的系統(tǒng)(#7-2-13)或一部分發(fā)生了突變的系統(tǒng)(#3-6-4或#7-3-6等)中，鎘及錳的吸收被大幅地抑制，由此可知，該蛋白質控制鎘及錳的吸收。另外，在酵母中導入有TRECA基因的系統(tǒng)中，TRECA蛋白顯示出鐵的輸送活性，而在帶有突變型的treca蛋白的酵母中未顯示出鐵的輸送活性，因此，TRECA蛋白還涉及鐵的吸收。但是，上述的缺失系統(tǒng)或突變系統(tǒng)在鐵的濃度上并沒有變化(表2)，由此可預測出:與目前為止所報告的作為鐵吸收相關蛋白質的IRT或ZIP家族(Bughio N.等(2002) Journal of Experimental Botany.53:1677-1682)相比，鐵吸收能力低。
[0074]本發(fā)明所述的TRECA蛋白是包含以序列編號I所表示的氨基酸序列的蛋白質；或者是包含在以序列編號I所表示的氨基酸序列中I個或數(shù)個氨基酸發(fā)生了缺失、置換或添加的氨基酸序列、且具有TRECA蛋白的重金屬輸送功能的蛋白質；或者與包含以序列編號I所表示的氨基酸序列的蛋白質在氨基酸水平上顯示出80%以上、更優(yōu)選90%以上、進一步優(yōu)選95%以上的同源性、且具有TRECA蛋白的重金屬輸送功能的蛋白質。
[0075]<關于TRECA基因的突變型treca-Ι基因及treca-Ι蛋白>
[0076]本發(fā)明是序列編號3所示的TRECA基因的突變基因(以下稱作treca_l基因。)。序列編號3所示的堿基序列是來自上述照射重離子束而得的Cd吸收抑制水稻#3-6-4的基因，是在上述序列編號2所示的TRECA基因中對cDNA的第10外顯子的末端部位、堿基編號第1025至第1056的32bp加以置換而成為50bp后的基因。
[0077]本發(fā)明是上述序列編號3所示的treca-Ι基因的起始密碼子至終止密碼子為止的0RF，但只要含有相當于該部分的部分，就可以為任意基因。例如，在該ORF中加入5’和3’UTR而得的基因也包含在本發(fā)明中。
[0078]另外，本發(fā)明的treca-Ι基因包括例如編碼包含在序列編號5中記載的氨基酸序列中I個或數(shù)個氨基酸發(fā)生了置換、缺失、添加和/或插入后的氨基酸序列的蛋白質的突變體、誘導體。
[0079] 本發(fā)明所述的由treca-Ι基因編碼的treca_l蛋白是氨基酸序列如序列編號5所示地從上述TRECA蛋白發(fā)生了突變且抑制了 Cd吸收功能的蛋白質。treca-Ι蛋白是包含以序列編號5所表的氣基酸序列的蛋白質；或者是包含在以序列編號5所表的氣基酸序列中I個或數(shù)個氨基酸發(fā)生了缺失、置換或添加后的氨基酸序列、并且喪失了 TRECA蛋白的重金屬輸送功能的蛋白質；或是與包含以序列編號5所表示的氨基酸序列的蛋白質在氨基酸水平上顯示出80%以上、優(yōu)選90%以上、進一步優(yōu)選95%以上的同源性、且喪失了 TRECA蛋白的重金屬輸送功能的蛋白質。
[0080]<關于TRECA基因的突變型treca-2基因及treca-2蛋白>
[0081]本發(fā)明是序列編號4所示的TRECA基因的突變基因(以下稱作treca-2基因。)。序列編號4所示的堿基序列是來自照射上述重離子束而得的Cd吸收抑制水稻#7-3-6的基因，在上述序列編號2所示的TRECA基因(cDNA)中的堿基編號第915處發(fā)生了一個堿基缺失(胞嘧啶的缺失)。
[0082]本發(fā)明所述的treca-2基因優(yōu)選為包含由序列編號4所示的堿基序列構成的多核苷酸的0RF，但是只要包含相當于該部分的部分，就可以為任意基因。例如，在該ORF中加入5’和3’UTR而得的基因也包含在本發(fā)明中。
[0083]本發(fā)明的treca-2基因包括例如編碼包含在序列編號6中記載的氨基酸序列中I個或數(shù)個氨基酸發(fā)生了置換、缺失、添加和/或插入后的氨基酸序列的蛋白質的突變體、誘導體。
[0084]由本發(fā)明所述的treca-2基因編碼的treca-2蛋白是氨基酸序列如序列編號6所示地由上述TRECA蛋白發(fā)生了突變且抑制了 Cd吸收功能的蛋白質。treca-2蛋白是包含以序列編號6所表示的氨基酸序列的蛋白質；或者是包含在以序列編號6所表示的氨基酸序列中I個或數(shù)個氨基酸發(fā)生了缺失、置換或添加后的氨基酸序列、且喪失了 TRECA蛋白的重金屬輸送功能的蛋白質；或是與包含以序列編號6所表示的氨基酸序列的蛋白質在氨基酸水平上顯示出80%以上、更優(yōu)選90%以上、進一步優(yōu)選95%以上的同源性、且喪失了 TRECA蛋白的重金屬輸送功能的蛋白質。
[0085]<關于TRECA基因以及其突變型treca基因的重組載體>
[0086]基于本發(fā)明的重組載體是編入有上述TRECA基因、突變型的treca_l基因或treca-2基因中的任一種基因的重組載體。上述載體通過公知的轉化方法被以能夠表達的方式導入到目標植物中，由此使被編入到該植物中的基因或基因片段進行表達，從而能夠獲得本發(fā)明所述的蛋白質。
[0087]基于本發(fā)明的重組載體優(yōu)選為雙元載體(binary vector),其中,特別優(yōu)選日本特開平10-155485號公報中記載的“大容量雙元穿梭載體(binary shuttle vector)”。
[0088]<關于轉化體>
[0089]在制作本發(fā)明的表達基因的轉化體的情況下，將插入有上述基因的上述載體導入到目標植物細胞中。向該植物細胞中導入載體可使用公知的方法，例如可使用土壤農(nóng)桿菌法、電穿孔法、基因槍法、顯微注射法等，其中，最優(yōu)選土壤農(nóng)桿菌法。
[0090]上述本發(fā)明的表達基因的轉化體并不限定為水稻，只要是具有控制根的Cd吸收的蛋白質、基因的植物，就沒有限制。
[0091]〈關于基因標記>
[0092]本發(fā)明中的基因標記是根據(jù)上述TRECA基因與突變型treca基因的堿基序列的不同來識別個體的標記。
[0093]上述基因標記是根據(jù)堿基序列的不同來判斷本發(fā)明的基因是否通過雜交或轉化而被導入到另一水稻品種中的記號。以從水稻中提取出的基因組DNA為模版，使用具有根據(jù)基因組DNA的堿基序列而適當?shù)剡x擇的堿基序列的合成寡核苷酸作為引物，在使其混合后的反應液中進行PCR擴增反應,將包含其產(chǎn)物的反應液加入到例如瓊脂糖電泳中后，可將擴增后的各種DNA片段區(qū)分，從而能夠確認出該DNA片段對應于本發(fā)明的基因組DNA。
[0094]根據(jù)本方法，例如從越光(Koshihikari)等水稻品種和#3_6_4突變體中提取基因組DNA，根據(jù)能夠將目標堿基部分(插入了堿基的部分)擴增的引物組的種類，將提取物的基于PCR的DNA擴增片段加入到電泳中后可分別區(qū)分為200~500bp和600~800bp，從而能夠用于各個體的識別。在為#7-2-13突變體的情況下，通過不顯現(xiàn)出DNA的擴增片段而能夠與其他品種進行識別。需要說明的是，引物只要是能夠將突變區(qū)域擴增的堿基序列，就沒有限制。
[0095]在為#7-3-6突變體的情況下，利用能夠將包含一個堿基缺失(一塩基欠損)區(qū)域的堿基部分擴增的引物組[例如[0s7g2572_F2976g(5’-TATATTCAGCCTGGGCAGATCGAG-3’:序列編號 7)、0s7g2572_R3815g(5’ -TGATGTACTGTCCAGCGTATGTGC-3’:序列編號 8)]等，通過PCR反應使DNA片段擴增，將帶有因一個堿基缺失而新產(chǎn)生的限制性內切酶位點的DNA擴增片段利用特定的限制性內切酶(例如FspI)等加以切斷處理，從而能夠與其他品種進行。需要說明的是，引物只要是能夠將突變區(qū)域擴增的堿基序列，則沒有限制。另外，限制性內切酶只要能夠將突變區(qū)域切斷，就沒有限制。
[0096]另外，在為#7-3-6突變體的情況下,將DNA擴增片段通過離心柱(spin column)法、玻璃珠吸附法等加以純化，通過序列分析儀來讀取擴增部分的DNA堿基序列，由此對本發(fā)明的DNA堿基序列中包含的一個堿基缺失進行檢測，以該信息為基礎開發(fā)SNP (單核苷酸多態(tài)性)標記，由此能夠進行個體的識別。
[0097]<利用了重離子束的鎘吸收抑制水稻突變體的制作>
[0098]對水稻種子照射重離子束。作為用于制作出鎘吸收抑制水稻突變體的重離子束的輻射劑量，只要在不對水稻種子造成損傷且能夠誘發(fā)突變的范圍內，就沒有特別限定，如果為能夠高頻度地誘發(fā)的碳離子束，則優(yōu)選為20~60Gray的范圍。
[0099]上述照射重離子束后的種子(第I代種子、以下簡稱為Ml。第2代以后也同樣。)可供于通常的栽培，所得的M2種子可供于低Cd突變體的篩選。使用M2種子來篩選低Cd突變體的方法有下述的兩種方法。
[0100]在M2的篩選中，將播種后經(jīng)過10天的幼苗利用加入有Cd的水培液加以處理后，將幼苗的莖部切斷，將從切斷面流出的導管液利用原子吸光光度計等測定Cd濃度，篩選低Cd的突變體，此種方法在不僅為培養(yǎng)室等節(jié)省空間，而且在無法獲得Cd污染土壤的情況下特別優(yōu)選。另外，下一代種子(M3種子)可通過使從切斷后的殘株中長出的新芽(蘗)生長而加以確保。進而，通過使該種子(M3種子)自我繁殖，從而能夠獲得M4、M5等代發(fā)展了的低Cd吸收水稻。
[0101]在能夠利用Cd污染土壤的情況下，將M2種子播種在培養(yǎng)土中后，將經(jīng)過I個月的幼苗移植到Cd污染土壤中，經(jīng)過收獲、干燥、脫殼、磨皮的步驟而得到糙米，對于該糙米分析Cd濃度，篩選出糙米Cd濃度低的個體，從而能夠得到低Cd吸收水稻(M3種子)。進而，通過使該種子進行自我繁殖，從而能夠獲得M4、M5等代發(fā)展了的低Cd吸收水稻，在這方面與上述水培栽培相同。[0102]<由低Cd吸收水稻的重金屬轉運蛋白基因的獲得>
[0103]作為獲得本發(fā)明所涉及的基因的方法，可舉出雜交技術、聚合酶鏈式反應(PCR)技術。前者例如制備與本發(fā)明的基因的堿基序列或其一部分特異地進行雜交的探針，篩選基因組DNA文庫、cDNA文庫。后者例如使用公知的日本晴的序列信息，設計通過PCR法使本發(fā)明的基因發(fā)生擴增的引物組(5，側和3’側)，將cDNA作為模版進行PCR，使兩引物所夾持的DNA區(qū)域擴增，從而能夠獲得發(fā)明所涉及的基因。
[0104]<重金屬轉運蛋白的鑒定>
[0105]對于本發(fā)明所涉及的蛋白質來說，通過循環(huán)測序法來確定上述分離出的基因的堿基序列，從而能夠根據(jù)密碼子而將堿基序列轉換成氨基酸序列。將該氨基酸序列對照水稻基因組數(shù)據(jù)庫(RAP-DB)，從而能夠鑒定出蛋白質。
[0106]<將低Cd吸收水稻突變體作為母本的新的低Cd吸收水稻的育種方法>
[0107]將具有根據(jù)本發(fā)明所得的DNA的低Cd吸收水稻突變體與已有的品種進行雜交，利用基于本發(fā)明的基因標記，由此能夠效率良好地制作出新的低Cd吸收水稻品種。
[0108]作為該制作方法，具有以下的步驟。
[0109]1)將低Cd吸收水稻(A植物)與已有的水稻品種(B植物)進行雜交而作出Fl。
[0110]2)使上述Fl與上述B植物雜交。
[0111]3)從雜交后的植物中利用基因標記篩選出具有低Cd基因的個體。
[0112]4)通過與B植物重復地雜交的“回交”，而有目的地將A植物所具有的低Cd基因(例如treca-Ι基因或treca-2基因)導入到B植物中。
[0113]5)此時，為了從多數(shù)回交個體中僅篩選出具有低Cd基因的個體，能夠活用基因標記。本發(fā)明的基因標記能夠識別具有低Cd基因的個體及其以外的個體。
[0114]6)在篩選上述個體時，使用從幼苗階段的莖葉、根中提取出的基因組DNA即可。
[0115]7)反復與B植物進行雜交，用標記篩選出進入有低Cd基因的個體，由此能夠制作出基因組結構的大部分為B植物，僅Cd吸收為A植物的遺傳性狀的新品種(例如低Cd的Akitakomachi (?>吞亡二 t 怒))。
[0116]8)B植物可以為粳稻(Japonica)種，也可以為秈稻(Indica)種。
[0117]實施例
[0118]以下，通過實施例對本發(fā)明的內容進一步具體地示出，本發(fā)明并不限于本實施例的記載。
[0119]<實施例1 一 Cd吸收少的水稻突變體的篩選>
[0120](重離子束照射)
[0121]使用獨立行政法人日本原子力研究研發(fā)機構高崎量子應用研究所的TIARA，將經(jīng)重離子束照射(碳離子、320MeV，40Gy)后的水稻(品種越光(Koshihikari))種子(該種子為第I代種子，以下簡稱為M1，而將第2、第3代等稱作M2、M3等。)3500粒播種在培養(yǎng)土(住友化學公司制、商品名> Y > I號)中，將所得的幼苗逐個地移植到(獨)農(nóng)業(yè)環(huán)境技術研究所所有的水田田地中，通過(獨)農(nóng)業(yè)環(huán)境技術研究所的例行的栽培管理而由各個體獲得M2種子。將所得的M2種子約100，000粒全部混合，供試于以下的低Cd突變體的篩選步驟。
[0122](低Cd突變體的篩選方法以其I一導管Cd濃度為指標的簡易篩選法)[0123]將M2的催芽種子播種在底面開孔為3mm 口徑的孔的96孔的PCR板中，使板載于由聚苯乙烯泡沫塑料制成的漂浮臺上，置于加入了木村B水培液(1/2濃度)的20L容量的盛裝容器中。
[0124]將播種后經(jīng)過10天的幼苗在加入了 0.1ppm的Cd濃度后的水培液中處理4天。處理后，將各個體的莖部在距離板2cm上部切斷，使從切斷面流出的導管液吸入到脫脂棉中，通過離心分離(2，OOOrpm, I分鐘)，僅回收導管液。對于所選取使用的板，在96孔PCR板的底部開出2mm 口徑的孔，填充脫脂棉后，與未開孔的板二板相重疊。使導管液吸入到脫脂棉中,通過離心分離(2，000rpm、l分鐘)，回收到下方的板處。
[0125]通過上述回收的導管液在用0.1M硝酸稀釋50~200倍后，利用原子吸光光度計(安捷倫科技公司制、商品名；speCtrAA220Z)測定Cd濃度。需要說明的是，與從越光(Koshihikari)收集的導管液的Cd濃度相比，僅回收顯示為其1/5以下的Cd濃度的個體，為了易于產(chǎn)生蘗(從茬中長出的新芽)而確保下一代種子(M3)，移植到培養(yǎng)土中后進行收集。
[0126]通過上述方法，對約3，000個體進行Cd處理，從其中篩選生育與越光同等、且導管 Cd 濃度為越光的 1/5 ~1/20 的 4 種突變體(#3-5-20, #6-4-10, #11-6-12，#12-3-5)，另外，通過上述方法收集M3種子。將該突變體的導管Cd濃度示于表1。需要說明的是，在表I中，在同一板上分別對所栽培的越光與突變體進行比較。
[0127]【表1】
【權利要求】
1.一種基因，其包含下述(A)至(C)中的任一個堿基序列且編碼與鎘吸收的控制相關的轉運蛋白: (A)由序列編號2所表示的DNA堿基序列， (B)在序列編號2中記載的堿基序列中1個或多個堿基發(fā)生了缺失、置換或添加的堿基序列，并且是編碼控制鋪吸收的蛋白質的基因的DNA喊基序列， (C)與序列編號2中記載的堿基序列在嚴格的條件下進行雜交、且編碼控制鎘吸收的蛋白質的基因的DNA喊基序列。
2.一種基因，其包含下述(D)至(F)中的任一個堿基序列且編碼與鎘吸收的控制相關的轉運蛋白: (D)由序列編號3所表示的DNA堿基序列， (E)在序列編號3中記載的堿基序列中I個或多個堿基發(fā)生了缺失、置換或添加的堿基序列，并且是編碼控制鋪吸收的蛋白質的基因的DNA喊基序列， (F)與序列編號3中記載的堿基序列在嚴格的條件下進行雜交、且編碼控制鎘吸收的蛋白質的基因的DNA喊基序列。
3.一種基因，其包含下述(G)至(I)中的任一個堿基序列且編碼與鎘吸收的控制相關的轉運蛋白: (G)由序列編號4所表示的DNA堿基序列， (H)在序列編號4中記載的堿基序列中I個或多個堿基發(fā)生了缺失、置換或添加的堿基序列，并且是編碼控制鋪吸收的蛋白質的基因的DNA喊基序列， (I)與序列編號4中記載的堿基序列在嚴格的條件下進行雜交、且編碼控制鎘吸收的蛋白質的基因的DNA喊基序列。
4.一種轉運蛋白，其包含下述(J)至(L)中的任一個氨基酸序列且與鎘吸收的控制相關: (J)序列編號I中記載的氨基酸序列， (K)在序列編號I中記載的氨基酸序列中I個或多個氨基酸發(fā)生了缺失、置換或添加的氨基酸序列，并且是控制鎘吸收的蛋白質的氨基酸序列， (L)與序列編號I中記載的氨基酸序列具有至少90%以上的同源性的氨基酸序列，并且是控制鎘吸收的蛋白質的氨基酸序列。
5.一種轉運蛋白，其包含下述(M)至(O)中的任一個氨基酸序列且與鎘吸收的控制相關: (M)序列編號5中記載的氨基酸序列， (N)在序列編號5中記載的氨基酸序列中I個或多個氨基酸發(fā)生了缺失、置換或添加的氨基酸序列，并且是控制鎘吸收的蛋白質的氨基酸序列， (O)與序列編號5中記載的氨基酸序列具有至少90%以上的同源性的氨基酸序列，并且是控制鎘吸收的蛋白質的氨基酸序列。
6.一種轉運蛋白，其包含下述(P)至(R)中的任一個氨基酸序列且與控制鎘吸收相關: (P)序列編號6中記載的氨基酸序列， (Q)在序列編號6中記載的氨基酸序列中1個或多個氨基酸發(fā)生了缺失、置換或添加的氨基酸序列，并且是控制鎘吸收的蛋白質的氨基酸序列， (R)與序列編號6中記載的氨基酸序列具有至少90%以上的同源性的氨基酸序列，并且是控制鎘吸收的蛋白質的氨基酸序列。
7.—種重組載體，其包含所述權利要求1至3中任一項所述的DNA。
8.一種轉化體，其是包含權利要求2或3所述的DNA的轉化體、或者是缺失了權利要求1所述的DNA的轉化體。
9.一種轉化體，其通過使用所述權利要求7所述的重組載體而得。
10.一種基因標記，其包含所述權利要求1至3中任一項所述的DNA。
11.一種鎘吸收抑制水稻，其中，所述權利要求4所述的蛋白質的表達受到抑制。
12.—種鎘吸收抑制水稻，其中，所述權利要求2或3所述的基因編碼的蛋白質進行表達。
13.根據(jù)權利要求11或12所述的鎘吸收抑制水稻，其出穗、收獲量、味道與水稻品種越光為相同程度。
14.根據(jù)權利要求11或12所述的鎘吸收抑制水稻，其中，所述鎘吸收抑制水稻的出穗比水稻品種越光早約2周左右。
15.權利要求11至14中任一項所述的鎘吸收抑制水稻突變體的篩選方法，其包括下述(A)的步驟和(B)的步驟、或者包括(A)的步驟和(C)的步驟， (A)將照射重離子束后的第I代種子栽培在田地中并收集第2代種子的步驟， (B)將在所述(A)的步驟中得到的第2代種子栽培在含有Cd的水培液中，收集切除莖葉而分泌出的導管液，根據(jù)該導管液中所含的Cd濃度來篩選Cd吸收抑制水稻突變體，并且收集第3代種子的步驟。 (C)將在所述(A)的步驟中得到的第2代種子的幼苗個體栽培在Cd污染土壤中，根據(jù)第3代種子的Cd濃度來篩選鎘吸收抑制水稻突變體的步驟。
16.—種鎘吸收抑制水稻,其是通過所述權利要求11至14中任一項所述的鎘吸收抑制水稻突變體與已有的水稻品種的雜交而得的。
【文檔編號】C12N5/10GK103917646SQ201280054062
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2012年10月23日 優(yōu)先權日:2011年11月4日
【發(fā)明者】石川覺, 倉俁正人, 安部匡, 井倉將人, 中西啟仁, 西澤直子 申請人:獨立行政法人農(nóng)業(yè)環(huán)境技術研究所