天山雪蓮sikCSD1基因在培育抗逆植物中的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種天山雪蓮sikCSD1基因在培育抗逆植物中的應用，本發(fā)明從天山雪蓮中克隆sikCSD1基因，利用上述基因構建植物表達載體，遺傳轉化獲得抗逆轉基因植物。本發(fā)明從天山雪蓮中克隆sikCSD1基因，并在轉基因植物中得到表達，提高轉基因植物的抗寒、抗旱性，通過該基因的過量表達，使植物的抗低溫、干旱脅迫性能得到提高，最終獲得抗逆能力明顯增強的植物。從天山雪蓮中篩選、克隆出與抗寒、抗旱直接相關的基因，將其用于農(nóng)作物品種改良，具有巨大的學術和經(jīng)濟價值。
【專利說明】天山雪蓮sikCSDl基因在培育抗逆植物中的應用
【技術領域】:
[0001]本發(fā)明涉及一種從菊科鳳毛菊屬植物天山雪蓮(Saussurea involucrata Kar.etKir)中克隆得到sikCSDl基因，構建組成型植物表達載體，轉化植物，并對抗寒、抗旱和抗氧化效果進行評價，增加植物的抗寒、抗旱和抗氧化性能。
【背景技術】:
[0002]植物在生長發(fā)育過程中，時常會遭受干旱、冷害、高溫、鹽堿、病原菌侵染等逆境脅迫，這些逆境將導致植物細胞內(nèi)產(chǎn)生大量有害的活性氧(ROS)。SOD是第一個在活性氧清除反應過程中發(fā)揮作用的抗氧化酶，能將超氧化物陰離子自由基((V)快速歧化為過氧化氫(H2O2)和分子氧；然后H2O2在抗壞血酸過氧化物酶(APX)、過氧化氫酶(CAT)和抗壞血酸谷胱甘肽循環(huán)(AsA-GSH circulation)系統(tǒng)的作用下轉變?yōu)樗头肿友?馬旭俊，朱大海(2003)植物超氧化物歧化酶(SOD)的研究進展.遺傳，25 (2):225-231)。SOD對于清除氧自由基，防止氧自由基增加細胞膜通透性、膜脂過氧化加快、破壞細胞的結構和功能具有非常重要的作用。根據(jù)金屬輔因子的不同，SOD可以分為CuZnSOD、FeSOD、MnSOD和 NiSOD(McCord JM, Fridovich I(1969)Superoxide dismutase:an enzymic functionfor erythrocuprein (hemocuprein).J Biol Chem 244:6049-6055 ;Alscher RG, ErturkN, Heath LS (2002)Role of superoxide dismutases(SODs) in controlling oxidativestress in plants.J Exp Bot 53:1331-1341 ;Zelko IN, Mariani TJ, Folz RJ(2002)Superoxide dismutase multigene family:a comparison of the CuZn-SOD(S0D1),Mn-SOD(S0D2), and EC-S0D(S0D3)gene structures, evolution, and expression.FreeRadic Biol Med 33:337-349)。植物Cu/Zn-S0D主要定位在細胞質和葉綠體中(Baum JA,Scahdalios JG(1979)Developmental expression and intracellular localization ofsuperoxide dismutases in maize.Differentiation 13:133-140 ;Sunkar R, Kapoor A,Zhu JK(2006)Posttranscriptional induction of two Cu/Zn superoxide dismutasegenes in Arabidopsis is mediated by downregulation of miR398 and importantfor oxidative stress tolerance.Plant Cell 18(8):2051-2065)。其中細胞質 Cu/Zn-SOD主要位于靠近液泡、細胞核、質外體的細胞質區(qū)，葉綠體Cu/Zn-S0D由核基因編碼，在細胞質中合成后由葉綠體前導肽引導進入葉綠體內(nèi)(Ogawa K, Kanematsu S, AdadaK(1996)Intra-and extra-cellular localization of〃 cytosolic" CuZn-super oxidedismutase in spinach leaf and hypocotyls.Plant Cell Physiol 37(6):790-799)。
[0003]作為新疆的特色植物，新疆雪蓮(Saussurea involucrata Kar.et Kir),又名天山雪蓮、雪蓮花等。屬菊科鳳毛菊屬，主要生長于海拔2400~4100m的高山草甸、高山冰磧石和流石灘石隙、懸崖峭壁石縫等處。那里氣候多變，冷熱無常，雨雪交替，最高月平均溫3~5°C，最低月平均溫-19~-21 °C，年降水量約800毫米，無霜期僅有50天左右。
[0004]天山雪蓮經(jīng)過長期的自然選擇，形成了穩(wěn)定的特殊結構、功能和遺傳基因，產(chǎn)生了適應極端環(huán)境條件下的生理和生化機制，這種與環(huán)境相適應的機制，與一般的耐冷、抗寒應答性的適應機制不同，主要表現(xiàn)在其低溫條件下能夠正常的生長發(fā)育，而一般的抗寒性植物在相應的低溫條件下，生長發(fā)育受到抑制。
[0005]近年來植物抗逆基因工程得到迅速發(fā)展，并研究出了多種轉基因抗逆植物，為培育抗逆植物開辟了新途徑。利用GateWay技術構建的低溫脅迫下天山雪蓮葉片組織的cDNA文庫，從天山雪蓮文庫中克隆了天山雪蓮銅鋅超氧化物歧化酶基因sikCSD 1，為了研究該基因的功能，我們構建了該基因的植物表達載體，并將此基因導入煙草中，以提高植物的抗逆性。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0006]本發(fā)明的一個目的是為植物抗逆育種提供有價值的銅鋅超氧化物歧化酶基因sikCSD 1，其發(fā)明的目還在于構建植物表達載體:PBI121-sikCSDl，在轉基因植物中得到表達，提高轉基因植物的抗逆性，通過該基因的過量表達，使植物的抗低溫、干旱和抗氧化脅迫性能得到提高，最終獲得抗(耐)低溫、干旱和抗氧化能力明顯增強的植物。[0007]本發(fā)明的目的是通過以下過程和方法實現(xiàn)的:
[0008]本發(fā)明所述的從天山雪蓮中克隆sikCSDl基因，其序列為〈210>1。
[0009]本發(fā)明的從天山雪蓮中克隆sikCSDl基因的過程如下:
[0010]利用Primer5.0設計分別帶有BamH I和Sac I的PCR引物Pl和P2。提取經(jīng)低溫處理的天山雪蓮RNA，并以RNA反轉錄成的cDNA為模板，用引物Pl和P2進行擴增，得到目的基因；
[0011]SikCSDl基因植物表達載體構建:構建植物表達載體pBI121_sikCSDl ；
[0012]利用上述基因構建植物表達載體，通過農(nóng)桿菌介導法遺傳轉化獲得抗寒、抗旱和抗氧化轉基因植物:
[0013]將大小、長勢一致的對照植株和2個不同株系的轉基因植株，經(jīng)低溫、干旱脅迫處理，分別剪取葉片進行相關生理指標的測定，所有實驗每個指標重復測定3次。
[0014]低溫脅迫試驗中，隨著溫度的下降，轉sikCSDl基因煙草的相對電導率、MDA含量始終低于對照組煙草，且上升趨勢小于對照組煙草，傷害率較對照低。轉sikCSDl基因煙草在低溫脅迫下表現(xiàn)出較強的抗寒性。
[0015]干旱脅迫試驗中，轉sikCSDl基因煙草的相對電導率、MDA含量始終低于對照組煙草，且上升趨勢小于對照組煙草，傷害率較對照低。轉sikCSDl基因煙草在干旱脅迫下表現(xiàn)出較強的抗旱性。
[0016]抗氧化試驗中，轉sikCSDl基因煙草的APX酶的活性提高了 2.5倍左右，CAT活性提高了 3倍。在逆境脅迫下，轉基因植株的APX、CAT酶活性進一步提高，能分別達到對照株的25、10倍左右。轉基因煙草具有較高的APX和CAT活性。轉sikCSDl基因煙草在干旱脅迫下表現(xiàn)出較強的抗氧化性。
[0017]轉天山雪蓮銅鋅超氧化物歧化酶基因sikCSDl煙草的抗逆性分析表明，轉基因煙草對低溫、干旱和氧化劑都表現(xiàn)出了較強的抗性水平。
[0018]本發(fā)明不僅得到天山雪蓮抗逆相關的銅鋅超氧化物歧化酶基因sikCSDl，而且將其構建成的植物表達載體，在轉基因植物中研究了該基因在提高植物耐低溫、干旱性和抗氧化性能中的重要功能。這對于揭示雪蓮的抗逆機理，提高植物的抗逆能力，具有重要的意義。
[0019]轉天山雪蓮銅鋅超氧化物歧化酶基因sikCSDl煙草的抗寒、抗旱和抗氧化功能分析表明，轉基因煙草的抗寒性、抗旱性和抗氧化性得到明顯提高。
【專利附圖】

【附圖說明】:
[0020]圖1 是天山雪蓮 sikCSDl 基因 PCR 擴增圖 Figl:sikCSDlgene PCR amplified
[0021]圖 2 是 pGM-sikCSDl PCR 鑒定圖 Fig2:PCR identification of pGM-sikCSDl
[0022]圖 3 是pBI121-sikCSD IPCR鑒定 Fig3:PCR identification of pBI121_sikCSDl
[0023]圖 4 是 pBI121_sikCSDl 酶切鑒定 Fig4 !Restriction enzyme digestionidentification of pBI121_sikCSDl
[0024]圖 5 是轉化 GV3101PCR 鑒定 Fig5:PCR identification ofpBI121-sikCSDl-GV3101
[0025]圖6 是轉化煙草 PCR 檢測 Fig6:PCR identification of transformed tobacco
[0026]圖7 是轉基因煙草 RT-PCR分析 Fig7:RT-PCR analysis on transgenic tobacco
[0027]圖8是低溫脅迫下煙草電導率測定Fig8:The measurement of relativeconductivity of tobacco under low tempreture
[0028]圖9是不同溫度處理對煙草MDA含量的影響Fig.9:Effect of temperaturetreatment on the content of MDA in tobacco
[0029]圖10是干旱脅迫下煙草電導率測定FiglO:The measurement of relativeconductivity of tobacco under drought stress
[0030]圖11是干旱脅迫下煙草葉片MDA含量Figll:Change of MDA content intobacco leaves under drought stress
[0031]圖12 是噴施 paraquat 溶液后煙草葉片 APX 含量 Figl2:Change of APX contentin tobacco leaves under treatment with paraquat
[0032]圖13 是噴施 paraquat 溶液后煙草葉片 CAT 含量 Figl3:Change of CAT contentin tobacco leaves under treatment with paraquat
[0033] 圖14是植物表達載體是pBI121_sikCSDl的構建流程圖
[0034]圖1 中:
[0035]M:Marker ;1_3:sikCSDl ；
[0036]圖2 中:
[0037]M =Marker ;1_3:pGM_sikCSDl ；4 陰性對照；
[0038]圖3 中:
[0039]M =Marker ；1 陽性對照;2、3:pBI121_sikCSDl ；4 陰性對照；
[0040]圖4 中:
[0041]M =Marker ；1 質粒對照;2、3:pBI121_sikCSDl ；
[0042]圖5 中:
[0043]M =Marker ；1:陽性對照;2_6:pBI121-sikCSDl-GV3101 ；
[0044]圖6 中:
[0045]M =Marker ;1_11:sikCSDl 轉化煙草；12:陰性對照；[0046]圖 7 中:
[0047]M =Marker ;1_8:sikCSDl轉化煙草；9:陽性對照；10:陰性對照；
【具體實施方式】:
[0048]實驗所涉及的藥品瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒為上海生工公司生產(chǎn)；LA PCRTM invitro Cloning Kit 購自 TaKaRa 公司；RNA 酶、Taq 酶、T4-DNA 連接酶(T4-DNA ligase)、Marker、TRNzol總RNA提取試劑購于TIANGEN公司；BamH 1、Sac I等限制性內(nèi)切酶為Fermentas公司原裝；IPTG、Χ-gal及抗生素、植物激素購自上海Sangon公司；其他試劑及配制MS培養(yǎng)基的各種試劑均為國產(chǎn)分析純。具體實驗操作依據(jù)[美]J.薩姆布魯克D.W.拉塞爾的《分子克隆實驗指南》。
[0049]實施例1:天山雪蓮cDNA文庫單克隆質粒的提取
[0050]取天山雪蓮cDNA文庫單克隆保存的甘油管于IOmlLB液體培養(yǎng)基(Cm 50 μ g/ml)中，37°C 220rpm振蕩培養(yǎng)過夜。蘸取菌液于LB固體培養(yǎng)基(Cm 50 μ g/ml)平板上劃線培養(yǎng)，37°C暗培養(yǎng)12-16hr。挑取單克隆于20mlLB液體培養(yǎng)基(Cm 50 μ g/ml)中，37°C 220rpm振蕩培養(yǎng)14hr，提取質粒，具體方法如下:
[0051]I)將菌液分裝于1.5ml Ep管，12000rpm離心3min,棄上清液；
[0052]2)加入400 μ I STE溶液,重懸，12000rpm離心3min,棄上清液；
[0053]3)沉淀用150 μ L堿裂解溶液I重懸，混勻；
[0054]4)加入新鮮配制的300 μ L堿裂解溶液11，輕輕混勻，至溶液清澈；
[0055]5)加入225 μ L堿裂解溶液III，輕輕混勻，冰上放置5min ；離心(12000rpm，5min)；
[0056]6)吸取上清于另一新Ep管，加入等體積三氯甲烷，充分混勻，室溫放置5min ;離心(lOOOOrpm,5min)；
[0057]7)小心吸取上清于另一新Ep管，加入兩倍體積無水乙醇約為850 μ L，_20°C放置IOmin ;離心(12000rpm, 5min)；
[0058]8)棄去上清，沉淀用70%乙醇洗滌兩次，室溫吹干后溶于40 μ L TE (含RNase A20 μ g/ml)溶液中，37°C溫育 30min。
[0059]實施例2:從天山雪蓮中克隆到sikCSDl基因
[0060]以天山雪蓮cDNA文庫單克隆質粒為模板，用Pl和P2為引物進行擴增，同時以去離子水為模板進行擴增作為陰性對照。
[0061]P1Sd, GGATCC GAAGTCCAGAAACGCTGAGTCGG 3;
[0062]BamH I
[0063]卩2為:5'GAGCTC TTTACACTGAAGATTGAAGCCCG 3;
[0064]Sac I [0065]PCR 反應體系(20 μ I)為:
[0066]
【權利要求】
1.一種從天山雪蓮中克隆的銅鋅超氧化物歧化酶基因sikCSDl，其序列為〈210>1，其特征在于該基因編碼區(qū)全長471bp，編碼157個氨基酸。
2.根據(jù)權利要求1所述的核苷酸序列構建的植物表達載體。
3.根據(jù)權利要求2所述的植物表達載體，通過遺傳轉化獲得的抗寒、抗旱和抗氧化轉基因植 物。
【文檔編號】C12N15/53GK103923930SQ201310009751
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2013年1月11日 優(yōu)先權日:2013年1月11日
【發(fā)明者】祝建波, 張林華, 馮玉杰 申請人:石河子開發(fā)區(qū)石大元禾生物科技有限公司