OsFLA19蛋白在調(diào)控植物葉夾角中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了OsFLA19蛋白在調(diào)控植物葉夾角中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了沉默或失活目的植物中OsFLA19蛋白編碼基因表達(dá)的物質(zhì)在調(diào)控植物葉夾角中的應(yīng)用；所述OsFLA19蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2。所述調(diào)控植物葉夾角為增大植物葉夾角。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的OsFLA19編碼基因部分特異序列組成的DNA分子構(gòu)建到目的載體pTCK303中，得到RNA干擾載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將RNA干擾載體轉(zhuǎn)化水稻Kitaake愈傷組織，得到OsFLA19的RNAi株系，該植株與未轉(zhuǎn)入該基因的水稻相比表現(xiàn)出明顯葉夾角增大的特性，說明沉默OsFLA19表達(dá)與提高水稻葉夾角密切相關(guān)。
【專利說明】OsFLAI 9蛋白在調(diào)控植物葉夾角中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種0sFLA19蛋白在調(diào)控植物葉夾角中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]水稻是全世界重要的糧食作物之一，占全球谷類作物種植面積的1/3。隨著人口迅速增長(zhǎng)，全球糧食危機(jī)日益嚴(yán)重。我國城市化進(jìn)程、水資源限制等導(dǎo)致耕地面積減少，加上種植結(jié)構(gòu)調(diào)整，我國的水稻實(shí)際種植面積已有下降趨勢(shì)，要滿足巨大人口增長(zhǎng)對(duì)稻米的需求，解決糧食安全問題，必須實(shí)現(xiàn)水稻育種上的新突破。20世紀(jì)60年代，我國選育出綜合性狀良好的矮桿抗倒 品種，開創(chuàng)了我國水稻矮化育種的新紀(jì)元，矮桿水稻品種的選育和推廣成為水稻育種實(shí)踐中非常重要的研究課題。因此，發(fā)掘和鑒定影響水稻矮化的基因，開展矮化相關(guān)基因的定位、克隆及作用機(jī)理等方面的研究，實(shí)現(xiàn)對(duì)于水稻株高的定向改良，具有十分重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。
[0003]矮化作為水稻的一種優(yōu)良性狀，具有抗倒伏和增產(chǎn)的作用，并且水稻矮桿基因的發(fā)掘和育種利用已為人類糧食生產(chǎn)做出了巨大貢獻(xiàn)。然而，中國矮桿資源十分貧乏、矮桿基因單一化以及可利用的矮源比較稀少，遺傳研究表明，生產(chǎn)上應(yīng)用的矮桿和半矮桿品種絕大多數(shù)是帶有sdl的品種及其衍生品種，但是由于sdl基因與不良農(nóng)藝性狀的連鎖，使其在生產(chǎn)上廣泛利用潛伏著由遺傳單一而帶來的風(fēng)險(xiǎn)(Yu et al.，2005)。因此創(chuàng)建、篩選非sdl矮源，以擴(kuò)大水稻矮桿基因的遺傳基礎(chǔ)，增加遺傳多樣性或者作為矮桿基因的儲(chǔ)備是極為重要和必要的，該項(xiàng)研究受到廣大水稻育種工作者和種質(zhì)資源工作者的高度重視；到目前為止，已發(fā)現(xiàn)多種矮化突變體，而大多數(shù)突變體都過度矮化或不具備實(shí)用的農(nóng)藝性狀。因此挖掘新的矮桿資源，通過多種途徑探求對(duì)育種具有應(yīng)用價(jià)值的新矮源，無論在理論上還是在育種實(shí)踐上都將具有非常重要的實(shí)用價(jià)值。
[0004]水稻植株矮化一般認(rèn)為是矮桿基因的作用導(dǎo)致水稻植株形態(tài)學(xué)或細(xì)胞學(xué)上的變化，如節(jié)間變短和細(xì)胞數(shù)目減少等；同時(shí)，基因的表達(dá)還受到外部環(huán)境以及內(nèi)源條件的影響。近年來，對(duì)水稻矮化相關(guān)基因的遺傳學(xué)、矮化突變體的激素調(diào)控以及矮化相關(guān)基因的克隆和利用等方面開展了廣泛而深入的研究，尤其在利用基因工程手段控制水稻株高方面取得了很大的進(jìn)步。植物激素幾乎參與水稻生長(zhǎng)發(fā)育的整個(gè)過程，植物矮化突變與植物赤霉素(Gibberel I in, GA)和油菜素類固醇(Brassinosteroid, BR)有關(guān)；少數(shù)植物矮化突變與生長(zhǎng)素(Auxin，IAA)有關(guān)。水稻矮化突變體dwarf I (dl)是GA鈍感型突變體，表現(xiàn)為矮化、葉寬且呈墨綠色、花序緊密。研究表明，水f稻IG基Adwar因編碼的是結(jié)合蛋白，該蛋白在植物的生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮著重要作用flGTP (Ashikari et al.，1999)。Sasaki等分離的水稻矮化突變體gid2也是GA鈍感突變體，因抑制GA的信號(hào)傳導(dǎo)，導(dǎo)致植株矮化(Sasaki etal.，2003)。水稻brdl突變體是是一種BR缺陷型矮化突變體，外源施加BR能恢復(fù)到正常表型。該突變體葉鞘短、葉片短而彎曲、分蘗少、不育。內(nèi)源BR含量分析發(fā)現(xiàn)BR合成過程中的BR-6-氧化酶減少(Mori et al.，2002)。Hong等研究發(fā)現(xiàn)，矮化突變體d2是BR敏感型突變體，外源施加10_6M的BL (BR的一種活性形式)，能使突變體的表型恢復(fù)到野生型，利用d2突變體克隆了 D2基因，該基因編碼細(xì)胞色素P450家族中一個(gè)新成員，屬于與BR合成酶高度相似的CYP90D家族(Hong etal.，2003)。隨著RFLP、RAPD、AFLP、SSR等分子標(biāo)記技術(shù)的開展及廣泛應(yīng)用，許多控制株高性狀的基因已得到了定位和克隆，利用這些基因控制GA或者BR的生物合成或者信號(hào)傳導(dǎo)從而獲得適合的株高，將是未來生產(chǎn)的重要手段(Mori et al., 2002 ；Hong et al., 2003 ；Hedden et al., 2003 ；Sakamoto et al.，2003)。
[0005]水稻產(chǎn)量與它的株型密切相關(guān)，除了株高，還包括分蘗數(shù)目、分蘗角度、花形態(tài)和葉夾角等。直立葉片株型和密植相結(jié)合是目前獲得水稻增產(chǎn)的新策略，擁有直立葉片的植株能夠吸收更多的陽光促進(jìn)光合作用和種子灌漿，從而提高整株的產(chǎn)量。水稻對(duì)油菜素內(nèi)酯(BR)響應(yīng)的一個(gè)重要形態(tài)特征就是產(chǎn)生直立葉片的表型。多年來科學(xué)家們對(duì)水稻中BRs合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子機(jī)制的研究投入了極大的熱情，越來越多的水稻BRs合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵元件被克隆和印證。BR合成減少的突變體以及信號(hào)減弱的突變體表現(xiàn)出矮化、葉片直立、種子變小等特征，例如brd2、d2、dll、brdl、d61，相反，超表達(dá)合成基因或者信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的正調(diào)控因子能夠增大葉夾角的角度，例如超表達(dá)BZR1。因此，分離水稻油菜素內(nèi)酯信號(hào)元件，不僅完善了水稻油菜素內(nèi)酯信號(hào)傳遞的分子機(jī)制，而且對(duì)于改良水稻株型、提高水稻產(chǎn)量也有重要意義。
[0006]具有類成束蛋白結(jié)構(gòu)域(Fasciclin-like domain)的阿拉伯半乳聚糖蛋白(Arabinogalactan proteins,AGP)是阿拉伯半乳聚糖蛋白家族中的一類,它不僅包含有類AGP的糖基化區(qū)域,而且還存在1-2個(gè)fasciclin-like結(jié)構(gòu)域,該類蛋白被許多實(shí)驗(yàn)證明行使分子粘連的功能。Faik等通過生物信息學(xué)的方法分析了水稻和小麥中的FLA基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些谷物類的FLA蛋白與擬南芥的有相同的結(jié)構(gòu),包含fasciclin-like和AGP-1ike結(jié)構(gòu)域。這些基因中的70%也被推測(cè)含有GP1-錨定序列。RNAgel blot分析發(fā)現(xiàn)大多數(shù)FLA基因在種子和根中微弱表達(dá)，而且大多數(shù)小麥FLA基因的表達(dá)因非生物條件的脅迫而下調(diào)(Faik et al.，2006)。到目前為止，水稻基因組中FLA基因家族已有29個(gè)成員被鑒定出來。在擬南芥基因組中已經(jīng)報(bào)道的FLA類基因一共有24個(gè)成員。目前關(guān)于植物FLA蛋白的功能還知之較少，己有的證據(jù)表明，F(xiàn)LA蛋白可能在細(xì)胞伸長(zhǎng)、細(xì)胞粘連和次生壁成熟的過程中起作用。擬南芥一個(gè)sos5(fla4)突變體生長(zhǎng)在高鹽濃度的培養(yǎng)基上時(shí)，表現(xiàn)出根尖膨脹、根的伸長(zhǎng)受到了抑制，測(cè)序結(jié)果顯示突變位點(diǎn)位于該基因內(nèi)的fasciclin-like結(jié)構(gòu)域中，因此，F(xiàn)LA4是細(xì)胞增殖所必需的(shi et al.，2003)。擬南芥另一個(gè)FLA基因AtFLAll，其mRNA在花序莖和莢果的厚壁組織(sclerenchyma)中特異表達(dá)，且表達(dá)強(qiáng)度隨著果實(shí)的成熟不斷增強(qiáng)，推測(cè)AtFLAll可能促進(jìn)次生細(xì)胞壁的木質(zhì)化，對(duì)次生細(xì)胞壁的成熟有重要的作用(Ito et al.,2005) ο
[0007]目前，雖然人們對(duì)AGP類基因家族蛋白的研究已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展，但在水稻中的研究還比較少，該類基因參與的生物學(xué)過程還不清楚。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供沉默或失活目的植物中0sFLA19蛋白編碼基因表達(dá)的物質(zhì)的用途。
[0009]本發(fā)明提供了沉默或失活目的植物中0sFLA19蛋白編碼基因表達(dá)的物質(zhì)在調(diào)控植物葉夾角中的應(yīng)用；所述OsFLA19蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2。
[0010]上述應(yīng)用中，所述0sFLA19蛋白編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列I。
[0011]上述應(yīng)用中，所述沉默或失活目的植物中0sFLA19蛋白編碼基因表達(dá)的物質(zhì)為如下I) -3)中的至少一種:
[0012]1) RNA 分子，為如下(a)或(b):
[0013]Ca)序列表的序列4所示的RNA分子(單鏈RNA或雙鏈RNA)；
[0014](b)與序列表的序列4反向互補(bǔ)的RNA分子(單鏈RNA或雙鏈RNA)；
[0015]2 )上述RNA分子的DNA分子；
[0016]3)含有所述DNA分子的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
[0017]上述應(yīng)用中，所述DNA分子的核苷酸序列為序列表中的序列3或序列表中的序列3自5’末端第16-1199位核苷酸；
[0018]所述重組載體為將所述DNA分子插入表達(dá)載體中，得到的載體，在本發(fā)明的實(shí)施例中，表達(dá)載體具體為載體PTCK303。
[0019]上述應(yīng)用中，所述調(diào)控植物葉夾角為增大植物葉夾角。
[0020]上述應(yīng)用為將所述DNA分子導(dǎo)入目的植物中，得到轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物的葉夾角大于所述目的植物；
[0021]所述葉夾角具體為劍葉夾角或劍葉下第一葉夾角；
[0022]上述應(yīng)用中，所述目的植物為雙子葉植物或單子葉植物；所述單子葉植物具體為水稻。
[0023]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因植物的方法。
[0024]本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟:沉默或失活目的植物中0sFLA19蛋白編碼基因表達(dá)，得到轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物的葉夾角大于所述目的植物；所述0sFLA19蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2。
[0025]上述方法中，所述0sFLA19蛋白編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列I。
[0026]上述方法中，所述沉默或失活目的植物中0sFLA19蛋白編碼基因表達(dá)為將上述應(yīng)用中的所述DNA分子導(dǎo)入目的植物中，得到轉(zhuǎn)基因植物。
[0027]上述方法中，所述將上述應(yīng)用中的所述DNA分子通過上述應(yīng)用中的所述重組載體導(dǎo)入目的植物。
[0028]所述葉夾角為劍葉夾角或劍葉下第一葉夾角。
[0029]上述方法中，所述目的植物為雙子葉植物或單子葉植物；所述單子葉植物具體為水稻。
[0030]本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的0sFLA19，將其編碼基因部分特異序列組成的DNA分子構(gòu)建到目的載體pTCK303中，得到RNA干擾載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將RNA干擾載體轉(zhuǎn)化水稻Kitaake愈傷組織，經(jīng)潮霉素篩選和PCR檢測(cè)，得到0sFLA19的RNAi株系，該植株與未轉(zhuǎn)入該基因的水稻相比表現(xiàn)出明顯葉夾角增大的特性，說明沉默0sFLA19表達(dá)與提高水稻葉夾角密切相關(guān)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0031]圖1為RT-PCR方法擴(kuò)增到0sFLA19的全長(zhǎng)cDNA中較特異的序列[0032]圖2為RNAi表達(dá)載體0sFLA19RNAi的部分結(jié)構(gòu)示意圖
[0033]圖3為轉(zhuǎn)基因水稻的Real-time-PCR鑒定
[0034]圖4為0sFLA19RNAi轉(zhuǎn)基因水稻葉夾角變大表型觀察
【具體實(shí)施方式】
[0035]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0036]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0037]實(shí)施例1、干擾0sFLA19編碼基因表達(dá)載體0sFLA19RNAi的構(gòu)建及干擾DNA分子的
獲得
[0038]1、干擾0sFLA19編碼基因表達(dá)的靶片段的獲得
[0039]根據(jù)在GenBank提交的水稻基因序列，找到編碼0sFLA19基因，其完整讀碼框序列GenBank號(hào)為ΝΜ_001053180 (序列I ;編碼的蛋白命名為0sFLA19，其氨基酸序列為序列表中序列2)，據(jù)此設(shè)計(jì)正反向引物，5'端引物:5' -CGG GGTACCACTAGTCAATAAGGAGCACAAGAAG-3 '(下劃線序列為 Kpn 1、Spe I 位點(diǎn))，3 '端引物:5 ' -CGCGGATCC GAGCTC CTGAGTGAATCATCATCAACA-3 '(下劃線序列為 BamH 1、Sac I位點(diǎn))，以三葉期 Kitaake 水稻(Oryza sativaL.cv.Kitaake, Qu et al., J.Exp.Bot.2008, 59:24172424,公眾可從中國科學(xué)院植物研究所獲得，以下簡(jiǎn)稱為野生型水稻。)幼苗總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為 模板，采用RT-PCR方法擴(kuò)增到0sFLA19全長(zhǎng)cDNA中316bp的特異序列。具體操作過程如下:
[0040]水稻總RNA的提取:選取三葉期Kitaake水稻。幼苗IOOmg為材料，在液氮中研磨，將液氮中研碎的凍干粉轉(zhuǎn)入到含Iml Trizol試劑(Invitrogen)的1.5ml離心管中，充分混勻；室溫25°C放置5分鐘；每管中加入0.2ml新鮮氯仿，劇烈振搖15秒，25°C溫育2~3分鐘；12，000rpm，4°C，離心15分鐘；把上清的水相0.5ml轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的1.5ml離心管中，加0.5ml異丙醇，室溫放置10分鐘使RNA沉淀；12，OOOrpm，4°C，離心10分鐘；去上清，將RNA沉淀用lml75%乙醇清洗2次，超凈臺(tái)吹至半干；用50 μ I DEPC_ddH20重懸沉淀，60°C水浴10分鐘，以溶解RNA沉淀。將此RNA溶液分裝后_70°C保存，備做反轉(zhuǎn)錄的模板。
[0041]RT-PCR:取1μ I上述RNA樣品，用DEPC-ddH20稀釋100倍，用分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度。參照RT-PCR試劑盒(Promega)說明書，根據(jù)RNA的定量結(jié)果，取2 μ g該RNA，加1.0 μ gOligo dT引物，用DEPC-ddH20補(bǔ)充至15 μ 1，混勻后70°C變性5分鐘，冰浴5分鐘。短暫離心后，加入25 μ I反轉(zhuǎn)錄混合物(5μ I M-MLV5 X ReactionBuffer, 6 μ I dNTPMixture (2.5mM), I μ I M-MLV Reverse Transcriptase,0.5 μ I RNaseInhibitor, 12.5 μ IDEPC-ddH20)。混勻后，42°C水浴I小時(shí)完成反轉(zhuǎn)錄過程；75°C水浴10分鐘使反轉(zhuǎn)錄酶失活，得到含有第一鏈cDNA的混合物。
[0042]取I μ I上述第一鏈cDNA作為PCR的模板，按以下體系進(jìn)行PCR反應(yīng):0.2 μ ILATaqC 5U/μ 1),10 μ 12 X GC buffer, 1.8 μ I dNTPs, 0.5 μ 15'端引物(10 μ Μ), 0.5 μ 13'端引物(?ο μ Μ)，加ddH20終體積20 μ I。引物序列如前，PCR程序?yàn)?94° C預(yù)變性3分鐘后進(jìn)入PCR循環(huán)，循環(huán)參數(shù)為94° C30秒變性一58° C30秒復(fù)性一72° Cl分鐘延伸，30個(gè)循環(huán)后在72° C繼續(xù)合成10分鐘。
[0043]擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物經(jīng)過0.8%的瓊脂糖凝膠電泳分離，結(jié)果如圖1所示，從圖中可以看出，得到分子量大約0.3kb的條帶，用AxyPr印DNA凝膠回收試劑盒回收該片斷得到20 μ I回收產(chǎn)物。進(jìn)行測(cè)序分析,測(cè)序結(jié)果316bp的PCR片段具有序列表中序列I自5’末端第713-1028之間的核苷酸，將該P(yáng)CR片段命名為A。
[0044]克隆載體的構(gòu)建和純化:取3.5 μ I上述回收片段，加入T4-DNA連接酶I μ I (3U/μ 1)、2Χ 連接酶緩沖液 5 μ 1、pGEM-T Easy 載體(Promega) 0.5 μ I (50mg/ml) 4°C連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)含羧芐青霉素的抗性平板篩選得到轉(zhuǎn)化子，得到質(zhì)粒pTeasy-A。
[0045]經(jīng)過測(cè)序，質(zhì)粒pTeasy-A為將序列表中序列I自5’末端第713-1028之間的核苷酸插入pGEM-T Easy載體中得到的質(zhì)粒。
[0046]2、0sFLA19RNAi表達(dá)載體的構(gòu)建
[0047]pTCK303載體酶切:用限制性內(nèi)切酶Spe I和Sac I雙酶切載體pTCK303(pTCK303 記載在如下文獻(xiàn)中:Wang Z, Chen C，Yunyuan Xu, et al.2004.A PracticalVectorfor Efficient Knockdown of Gene Expression in Rice(Oryza sativa).PlantMolecularBiology reporter22:1-9.;公眾可從中國科學(xué)院植物研究所獲得)，酶切體系為:質(zhì)粒 10 μ l、10x 酶切緩沖液 5 μ 1、Spe I 1μ I (lOU/μ I), Sac I 10.8 μ I (IOU/μ 1)，加ddH20補(bǔ)充反應(yīng)體系至50μ 1，37°C酶切4小時(shí)。用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行分離，回收14621bp線性化的pTCK303大片段，溶于20 μ I ddH20中。
[0048]正向片段和反向片段的獲得:用限制性內(nèi)切酶Spe I和Sac I同樣條件雙酶切pTeasy-A并回收316bp酶切產(chǎn)物，命名為0sFLA19F (正向片段)。同樣，用限制性內(nèi)切酶BamHI和KpnI對(duì)載體pTeasy-A進(jìn)行雙酶切并回收316bp酶切產(chǎn)物，命名為0sFLA19R (反向片段)。
[0049]0sFLA19RNAi表達(dá)載體:取回收的316bp的0sFLA19F產(chǎn)物10 μ 1、回收的載體PTCK303溶液6 μ 1，與T4DNA連接酶2 μ I (3U/ μ I)、IOx連接酶緩沖液2 μ I混和，16°C連接16小時(shí)，得到連接產(chǎn)物，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，得到轉(zhuǎn)化子。提取轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒，送去測(cè)序，將該質(zhì)粒命名為0sFLA19F/pTCK303。測(cè)序成功的該質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶KpnI和BamH進(jìn)行雙酶切，酶切體系為:質(zhì)粒10 μ 1、IOx酶切緩沖液5 μ 1、ΚρηΙ1 μ 1( IOU/μ I)、BamH
10.8 μ I (IOU/ μ 1)，加ddH20補(bǔ)充反應(yīng)體系至50 μ 1，37°C酶切4小時(shí)。用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行分離，回收14937bp線性化的0sFLA19F/pTCK303大片段，溶于20 μ I ddH20中。取回收的316bp的0sFLA19R產(chǎn)物10 μ 1、回收的載體0sFLA19F/pTCK303溶液6 μ 1，與T4DNA連接酶2μ 1(3υ/μ 1)、10χ連接酶緩沖液2μ I混和，16°C連接16小時(shí)，得到連接產(chǎn)物，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，得到轉(zhuǎn)化子。提取轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒，送去測(cè)序。
[0050]該質(zhì)粒為將序列表中的序列3所示的DNA分子插入pTCK303載體的Spe I和BamH間得到的質(zhì)粒，即為含有正反向插入目的片段0sFLA19F和0sFLA19R的重組載體，命名為0sFLA19RNAi (0sFLA19RNAi載體結(jié)構(gòu)圖譜如圖2所示)。
[0051]序列3所示的DNA分子由正向片段、內(nèi)含子和反向片段組成，正向片段為序列表中序列3自5’末端第884-1199位核苷酸(即為序列表中序列I自5’末端第713-1028的核苷酸)，內(nèi)含子序列表中序列3自5’末端第394-871位核苷酸；反向片段為序列表中序列3自5’末端第16-331位核苷酸。序列3所示的DNA分子編碼的RNA為單鏈RNA或者雙鏈RNA，該RNA為序列表的序列4所示的RNA分子或與序列表的序列4反向互補(bǔ)的RNA分子。[0052]實(shí)施例2、干擾0sFLA19編碼基因表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻的獲得及表型研究
[0053]一、干擾0sFLA19編碼基因表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻的獲得
[0054]1、干擾0sFLA19編碼基因表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻的獲得
[0055]遺傳轉(zhuǎn)化:參照電激儀(EasyJecT Plus電激儀，英國EquiBio公司)操作指南，將質(zhì)粒0sFLA19RNAi用電擊法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105 (Biovector C0.,LTD公司目錄號(hào)Biovec-ΙΙ)，經(jīng)含卡那霉素的抗性平板篩選得到陽性克隆的RNAi工程菌，命名為EHA105/0sFLA19RNAi。
[0056]水稻陽性苗的篩選:將EHA105/0sFLA19RNAi 導(dǎo)入水稻 Kitaake (Oryza sativaL.cvKitaake，野生型水稻)的愈傷組織，將該愈傷組織用含300mg/L頭孢霉素的無菌水洗滌4-5遍，無菌濾紙吸干后轉(zhuǎn)至N6D2S1培養(yǎng)基(在附表中)上，篩選一代。兩周后，轉(zhuǎn)移至N6D2S2培養(yǎng)基(見表1)上篩選二代(2周/代)。取出經(jīng)過3代篩選生長(zhǎng)旺盛的抗性愈傷組織，轉(zhuǎn)移至預(yù)分化培養(yǎng)基(見表1)上，在分化培養(yǎng)箱(12小時(shí)光周期，白天28°C，夜晚25°C)中培養(yǎng)7天；然后轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基上，在分化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至產(chǎn)生再生苗。再生的植株在生根壯苗培養(yǎng)基(見表1)上生根壯苗。待小苗長(zhǎng)至10厘米左右時(shí)，打開容器封口膜，煉苗2-3天，然后將小苗移入人工氣候室栽培，獲得7個(gè)共21棵TO代轉(zhuǎn)0sFLA19RNAi水稻株系。
[0057]表1水稻組織培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化過程中使用的培養(yǎng)基及其成分
【權(quán)利要求】
1.沉默或失活目的植物中0SFLA19蛋白編碼基因表達(dá)的物質(zhì)在調(diào)控植物葉夾角中的應(yīng)用；所述OsFLA19蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于: 所述OsFLA19蛋白編碼基因的核昔酸序列為序列表中的序列I。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于: 所述沉默或失活目的植物中OsFLA19蛋白編碼基因表達(dá)的物質(zhì)為如下1)-3)中的至少一種: 1)RNA分子，為如下(a)或(b): (a)序列表的序列4所不的RNA分子； (b)與序列表的序列4反向互補(bǔ)的RNA分子； 2)編碼所述RNA分子的DNA分子； 3)含有所述DNA分子的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于: 所述DNA分子的核苷酸序列為序列表中的序列3或序列表中的序列3自5’末端第16-1199位核苷酸； 所述重組載體為將所述DNA分子插入表達(dá)載體中，得到的載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的應(yīng)用，其特征在于: 所述目的植物為雙子葉植物或單子葉植物。
6.一種培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟:沉默或失活目的植物中OsFLA19蛋白編碼基因表達(dá)，得到轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物的葉夾角大于所述目的植物；所述OsFLA19蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于: 所述0sFLA19蛋白編碼基因的核昔酸序列為序列表中的序列I。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于: 所述沉默或失活目的植物中0sFLA19蛋白編碼基因表達(dá)為將權(quán)利要求3-5中任一所述應(yīng)用中的所述DNA分子導(dǎo)入目的植物中。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于: 所述將權(quán)利要求3-5中任一所述應(yīng)用中的所述DNA分子通過權(quán)利要求3-5中任一所述應(yīng)用中的所述重組載體導(dǎo)入目的植物。
10.根據(jù)權(quán)利要求6-9中任一所述的方法,其特征在于: 所述目的植物為雙子葉植物或單子葉植物。
【文檔編號(hào)】C12N1/19GK103923916SQ201310009507
【公開日】2014年7月16日 申請(qǐng)日期:2013年1月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年1月10日
【發(fā)明者】種康, 陳麗萍, 馬巖, 徐云遠(yuǎn), 王曉夏 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院植物研究所