專利名稱：：黃病毒疫苗的制作方法黃病毒疫苗
背景技術(shù)：
：本發(fā)明涉及黃病毒科病毒。黃病毒屬包括70多種病毒,其中40種與人類疾病有關(guān)。大部分黃病毒是蟲媒病毒，通過蚊、蜱向鳥和哺乳動物(包括人)等宿主傳播。其中，登革熱病毒(1-4型)、黃熱病毒、日本腦炎病毒、蜱傳腦炎病毒和西尼羅河病毒能引起人類很高的發(fā)病率和死亡率。而另一些黃病毒是重要的獸醫(yī)病原，如跳躍病病毒能引起綿羊的神經(jīng)性疾病，西尼羅河病毒能引起馬腦炎，日本腦炎病毒能引起馬腦炎和豬死產(chǎn)。黃病毒基因組由一條線性的單鏈正意RNA組成，該正鏈能感染適合的宿主細胞。全部基因組長10-llkbs,無3’端polyA,5’端有甲基化cap。黃病毒的基因組不含內(nèi)部核糖體進入部位(IRES，提供一個宿主核糖體翻譯起始位點)。它通過核糖體掃描啟動蛋白合成。黃病毒顆粒呈球狀，直徑40-65nm;外被脂囊膜，內(nèi)含直徑約25_30nm的二十面體衣殼。一般來說，黃病毒由節(jié)肢動物傳播，如蚊和蜱。黃病毒在其介體內(nèi)繁殖并通過介體從一個宿主傳播到另外一個宿主。黃熱病毒能引起大規(guī)模疫病流行。它在宿主猴和人以及介體蚊之間傳播。一種傳播途徑是病毒通過非洲伊蚊(Aedesafricanus)和其它伊蚊(在非洲)、或Hemogogus蚊(在美洲)傳播，猴作為儲存宿主，深入森林或叢林的人常被感染。另一種傳播途徑是通過與人類生活密切相關(guān)的家蚊——埃及伊蚊，直接將病毒傳播到人，此途徑只有一個宿主。蜱傳腦炎病毒由俄羅斯和歐洲溫帶的硬蜱傳播。病毒只在硬蜱存在的地區(qū)感染人類。黃病毒能引起其它類型的腦炎,如墨累谷腦炎(MurrayValleyencephalitis)、羅西奧腦炎(Rocioencephalitis)和玻瓦桑腦炎(Powassanencephalitis),以及最近多在北美流行的西尼羅河熱病。登革熱是一種急性傳染病，其典型特征是兩階段發(fā)熱，頭疼，全身疼痛，疲勞，皮疫，淋巴結(jié)腫大和白細胞減少(Holstead,SB,1980,Immunologicalparametersoftogavirusdiseasesyndromes,p.107-173,inRffSchlesinger(ed.)TheTogaviruses,AcademicPress,Inc.,NY；Sabin,AB,1959,Dengue,p.361-373,inTRiversandFHorsfall(eds.),ViralandRickettsialInfectionsofMan,JBLippincottC0.,Philadelphia).登革熱由蚊子傳播，由四種血清學(xué)相關(guān)的登革病毒類型(登革I型-4型)感染引起。一種登革病毒血清型的感染能提供該亞型病毒的終生免疫，但不能形成對其它亞型病毒的交叉免疫保護。也就是說，生活在登革熱疫區(qū)的人在其一生中可能感染3種甚至是4種亞型的登革病毒。癥狀從無明顯感染到典型的登革熱，在一些嚴重的病例中，還出現(xiàn)可能致命的登革出血熱/登革休克綜合征(DHF/DSS)。登革出血熱(DHF)是一種嚴重的熱病，其特征是止血異常、血管通透性增加，有時能導(dǎo)致血量減少性休克綜合征，即登革休克綜合征(DSS)(WorldHealthOrganization:1975.TechnicalGuidesforDiagnosis，Treatment，Surveillance,PreventionandControlofDengueHemorrhagicFever.WorldHealthOrganization.Geneva).在不同的病例中DHF/DSS的機理可能不同。主要因素可能包括病毒毒性，患者健康狀況和不同血清型登革病毒的二次感染。基于對黃病毒疫苗的迫切需求，需要建立新的疫苗方案。理論上，活的弱毒疫苗能刺激最有效、持久且病毒特異性的免疫，而滅活病毒疫苗，包括重組亞單位疫苗，能提供最高水平的安全性。理想的疫苗應(yīng)能產(chǎn)生活疫苗的效力和亞單位疫苗的安全性。本發(fā)明的目標是發(fā)展一種假傳染性病毒樣顆粒(PVLP)疫苗。發(fā)明概要本發(fā)明涉及制造一種黃病毒疫苗的材料和方法。該疫苗由病毒樣顆粒組成，能感染宿主細胞，在宿主細胞中復(fù)制并合成可被宿主免疫系統(tǒng)識別的病毒蛋白，但不能包裝成感染性病毒顆粒。該病毒樣顆粒包含一個復(fù)制子，該復(fù)制子含有所有能確保復(fù)制子RNA自我復(fù)制和黃病毒蛋白合成所需的基因。所以，優(yōu)選的復(fù)制子應(yīng)含有所有的非結(jié)構(gòu)蛋白基因和preM、E基因。但其衣殼基因需要處理，以確保不能合成衣殼蛋白，或合成后無法用于形成感染性病毒顆粒，同時保證preM、E蛋白的高水平表達。本發(fā)明所述的病毒樣顆粒能感染宿主細胞，然后在細胞中合成多拷貝的復(fù)制子，繼而由復(fù)制子表達preM、E蛋白。preM、E蛋白由宿主細胞釋放或被表達在細胞表面，進而激發(fā)宿主的體液和細胞免疫發(fā)應(yīng)。本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點將在以下的發(fā)明細節(jié)描述和附圖中被解釋和展示。圖1顯示了黃病毒的結(jié)構(gòu)。圖2顯示了黃病毒的基因組結(jié)構(gòu)以及多聚蛋白的翻譯和加工位點。圖的上部顯示了病毒的基因組結(jié)構(gòu)，包括結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)，5’cap，假定的3’二級結(jié)構(gòu)，以及5’和3’非翻譯區(qū)(NTR)。基因組下面的圖顯示了由蛋白水解加工產(chǎn)生的前體蛋白和成熟蛋白。成熟結(jié)構(gòu)蛋白用陰影框標識，非結(jié)構(gòu)蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白的前體用白框標識，連續(xù)的無電荷氨基酸區(qū)用黑條標識。星號*指示帶有N多糖的蛋白，但不表明其位置和數(shù)量。圖中還標識了蛋白酶的剪切位點。ORF指開放閱讀框架。圖3顯示了登革病毒基因組及其衍生的復(fù)制子。復(fù)制子DEN2/AprM-E由基因組刪除PrM蛋白和E蛋白(452nt-2340nt)而成。復(fù)制子DEN2/AC_prM_E由基因組刪除了157nt-2340nt而成。復(fù)制子DEN2/AC由基因組刪除了160nt_320nt而成。UCR指非編碼區(qū)。圖4顯示了用穿梭載體系統(tǒng)獲得全長黃病毒cDNA克隆的技術(shù)方案。TRP代表磷酸核糖-氨基苯甲酸異構(gòu)酶，一種酵母的選擇標記基因；2um表示來自質(zhì)粒的酵母復(fù)制起點；amp指氨節(jié)青霉素抗性基因；ori表示細菌復(fù)制起點。RT-PCR指反向轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)。圖5顯示了NS3缺失的黃病毒亞基因組表達質(zhì)粒結(jié)構(gòu)。CMV指巨細胞病毒啟動子。UTR指非翻譯區(qū)。HDVr將在下文解釋。Neo指新霉素抗性基因。PA指聚腺苷酸化位點。圖6顯示了構(gòu)建體生成的方案。pTet-off質(zhì)粒被用于生產(chǎn)第一個穩(wěn)定細胞株BHK/Tet-off,該細胞株能自調(diào)控表達四環(huán)素轉(zhuǎn)錄激活因子(tetracyclinetransactivator,tTA)。TRE指四環(huán)素反應(yīng)因子。Pminaw指最小化的CMV啟動子。tTA指四環(huán)素轉(zhuǎn)錄激活因子。IRES指腦心肌炎病毒的內(nèi)部核糖體進入位點。Hyix)指潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶基因。Neo指新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因。Intron指在Clontech某載體中一段合成序列。Cpr指含有衣殼蛋白和部分PrE片段的多肽。發(fā)明的具體描述黃病毒顆粒由6%RNA、66%蛋白、9%多糖和17%脂組成(RussellPK,BrandtWE,DalrympleJM，ChemicalandAntigenicStructureofFlaviviruses,inSchlesingerRW,eds.，TheTogaviruses:Biology，Structure，Replication.NewYork:Academic；1980:503-529；andTrentDW,NaeveCW,BiochemistryandReplication，inMonathT，ed.St.LouisEncephalitis.Washington,DC:AmericanPublicHealthAssociation；1980p.159-199)。電子致密的核心(nucleocapsid)由衣殼蛋白C和基因組RNA組成。囊膜蛋白E(envelopeproteinE)和膜蛋白M通過C端疏水錨嵌入脂雙層中。但是在胞內(nèi)囊泡中發(fā)現(xiàn)一些未成熟的顆粒，含有獨特的未加工的prM，這些顆粒的感染性低于被釋放的病毒顆粒(MorensDM:Antibody-dependentenhancementofinfectionandthepathogenesisofviraldisease.ClinInfectDis1994,19:500-512)。黃病毒基因組均由一條約IO-1lkb的單鏈正義RNA分子組成，僅含一個ORF,約占基因組的95(ChambersTJ,HahnCS,GallerR,RiceCM:Flavivirusgenomeorganization,expression,andreplication,AnnRevMicrobiol1990,44:649-688)。在病毒感染的細胞中，全長基因組RNA似乎是唯一的病毒特異性信使RNA(mRNA)。感染時，病毒RNA被翻譯成約3400氨基酸的多肽，該多肽被加工成10個基因產(chǎn)物:三個結(jié)構(gòu)蛋白(C、prM和E)和七個非結(jié)構(gòu)蛋白(1、2A、2B、3、4A、4B和5)(BhamarapravatiN,YokanS:Liveattenuatedtetravalentvaccine,inGublerDJ,KunoG(eds.):DengueandDengueHemorrhagicFever.Wallingford,CABInternational,1997,pp367-377；andFalgout,BandMarkoff,L,1995,Thefamilyflaviviridaeanditsdiseases,p.47-66.1n:JSPorterfield(ed.),ExoticViralInfections.ChapmanandHallMedical,London,UnitedKingdom)。象所有正意鏈RNA病毒一樣，黃病毒基因組RNA具感染性。本發(fā)明旨在通過對基因組的加工獲得一些黃病毒復(fù)制子，這些復(fù)制子不能造成二次感染，但能持續(xù)表達能被宿主識別的抗原表位和決定簇,如M和E蛋白。例如，刪除部分或全部結(jié)構(gòu)基因能構(gòu)建出一些復(fù)制子。也就是說，C、prM和/或E的全部或部分可以被刪除。例如，可以刪除幾乎全部C序列而僅余20個氨基酸，但不影響復(fù)制和表達。另一方面，本發(fā)明涉及缺陷病毒基因組，它含有病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白或至少含有宿主抗體決定簇的主要多肽結(jié)構(gòu)。優(yōu)選的方案是保留大部分PrM和E的編碼序列，這些蛋白是野生型病毒感染的主要免疫位點。C蛋白不是宿主免疫的主要目標，因此，它是使病毒失去增殖能力的更理想的操作靶點。所以，C編碼區(qū)能被部分或全部刪除。C編碼區(qū)也能通過其它方式改變，如一點或多點突變、倒置、刪除，以及其它確保衣殼蛋白不表達的方式，或衣殼蛋白被表達但不能用于形成感染性病毒所需的功能性衣殼。C編碼區(qū)的改變不應(yīng)影響prM和E編碼序列的表達。因此，可以在衣殼中加入其它可表達的氨基酸，以防止蛋白正確折疊或形成可復(fù)制的外殼。不同的結(jié)構(gòu)蛋白基因被刪除或修飾后可獲得如圖3所示的各種登革病毒復(fù)制子。電擊轉(zhuǎn)染宿主細胞后，復(fù)制子開始復(fù)制和表達。按照本發(fā)明所述方法獲得的顆粒是一種感染性顆粒，它含有缺陷的復(fù)制子，但進入宿主細胞后不能再被包裝成感染性顆粒。因此，一旦所述顆粒感染宿主細胞，復(fù)制子就開始復(fù)制和表達，但不能被包裝成顆粒。優(yōu)選的載體類型應(yīng)具有如圖3下部所示的結(jié)構(gòu)和特性，其中僅C不能表達。因為各種黃病毒的基因組結(jié)構(gòu)具有相似性，所以同樣的方法也可以用于其它黃病毒血清學(xué)類型、株系或種，如日本腦炎病毒、西尼羅河病毒和黃熱病毒。黃病毒感染克隆在大腸桿菌中不穩(wěn)定。此障礙可通過真核宿主細胞克服，如啤酒酵母。登革病毒感染性全長克隆的穿梭載體已被構(gòu)建(Polo,S,Ketner,G,Levis,RandFalgout,B,1997,InfectiousRNAtranscriptionsfromfull-lengthdenguevirustype2cDNAclonesmadeinyeast.JVirol71:5366-5374；Pang,XandMarkoff,L1998，Afull-length“infectious，，cDNAcloneofadengueserotype2vaccinevirus.Poster,FifthInternationalSymposiumonPositiveStrandRNAviruses,p.1-73；andPur,B,Polo,S,Hayes,C,Falgout,B,2000,Constructionoffulllengthinfectiousclonefordengue-1viruswesternpacific74strain.VirusGenes,2000:20(I):57-63)。該穿梭載體含有一個細菌的復(fù)制起點和選擇標記，一個酵母復(fù)制起點和酵母選擇標記。因此，為利于構(gòu)建和提高本發(fā)明PVLP的產(chǎn)量，建立了如下方案:將黃病毒的5’、3’cDNA片段(不含中間cDNA片段)克隆入穿梭載體的一個多聚接頭上，然后在酵母中通過中間cDNA片段與5’、3’cDNA片段間的同源重組裝配出全長的cDNA克隆，如圖4所示。缺失部分C基因的復(fù)制子能表達所有主要病毒抗原，在已被構(gòu)建和測試的復(fù)制子中免疫原性最高。本發(fā)明開發(fā)了一種黃病毒復(fù)制子，該復(fù)制子表達時，含有最高的免疫原性。所以，所述復(fù)制子具有如下特性:含有大部分或全部已知的病毒抗原，有一種或多種導(dǎo)致病毒感染性喪失的缺陷。該復(fù)制子不能在宿主細胞中被包裝入VLP，而能在宿主細胞內(nèi)保持持續(xù)的RNA復(fù)制和表達。由于本發(fā)明所述復(fù)制子的目的在于生產(chǎn)preM和E蛋白，所述復(fù)制子不需要含有轉(zhuǎn)基因。因此，所述復(fù)制子的目標不是攜帶外源基因，也就是說，所述復(fù)制子不是一種克隆載體。替代的是，所述復(fù)制子的目標在于產(chǎn)生大量無復(fù)制能力的黃病毒基因組，且不含任何其它病毒或其它種黃病毒的任何基因。但是，該復(fù)制子可以含有和表達能提高宿主對PreM和E蛋白識別和反應(yīng)能力的分子，即該復(fù)制子可(被構(gòu)建成)含有佐劑或任何其它可提高免疫原性的分子。而且，preM和E編碼序列可以被改變以確保或提高免疫原性。所以，在preM和E編碼序列中可以進行點突變或類似的操作，使其在宿主中表達時能誘導(dǎo)免疫保護反應(yīng)的發(fā)生。有幾種方法可幫助技術(shù)人員將所述復(fù)制子包裝入病毒樣顆粒。通常，可采用額外的載體或包裝細胞包裝復(fù)制子。它們能反式提供缺陷復(fù)制子包裝所需要的成分。本發(fā)明的另一目的在于發(fā)展黃病毒復(fù)制子的包裝系統(tǒng)。例如，本發(fā)明構(gòu)建了能表達登革結(jié)構(gòu)蛋白prM、E和C的辛德畢斯病毒(Sindbis)復(fù)制子。在缺陷登革復(fù)制子轉(zhuǎn)染細胞24小時后，再用辛德畢斯復(fù)制子轉(zhuǎn)染細胞，然后登革復(fù)制子RNA被包裝成病毒樣顆粒(VLPs)，并釋放到培養(yǎng)基中。含有合適補充表達產(chǎn)物的包裝細胞能向復(fù)制子RNA反式提供包裝所需的結(jié)構(gòu)蛋白。因此，復(fù)制子RNA在包裝細胞內(nèi)能被包裝成VLP。雖然含有復(fù)制子的VLP具有感染性，但不通過感染產(chǎn)生新的感染性病毒顆粒，因為在被感染的宿主細胞內(nèi)無法合成正確的衣殼蛋白，所以VLP被稱為“假感染病毒樣顆粒”(PVLP)或非復(fù)制型顆粒。因此，一個非復(fù)制型顆粒能感染宿主細胞，但被感染細胞不能再產(chǎn)生感染性病毒顆粒。在本發(fā)明中，PVLP與VLP意義相同。PVLP獨特的性能使其成為一種潛在的、安全有效的黃熱病毒疫苗。一種高免疫原性的PVLP病毒株應(yīng)該能形成與天然黃病毒相似的感染過程，并誘發(fā)長期持續(xù)的免疫力。因此，理想的PVLP應(yīng)含有這樣一些遺傳材料，它們能表達野生型prM和E蛋白的所有表位，有時可能還包括C的表位。如果對結(jié)構(gòu)蛋白加工的目的是為了確保復(fù)制無法實現(xiàn)，則應(yīng)改變C蛋白，且改變較小更好。實施例1:第一個包裝系統(tǒng)的實施例是采用兩個連續(xù)的感染:先用黃病毒PVLP感染包裝細胞，然后在24小時后，再用能反式提供結(jié)構(gòu)蛋白的辛德畢斯PVLP感染，具體細節(jié)將在下文詳細描述。甲病毒包裝細胞株的發(fā)展已有文獻報導(dǎo)(Polo，JM，Belli，B，DriVer，D，F(xiàn)roloV，I,Sherrill,S,Hariharan,MJ,Townsend,K,Perri,S,Ment,SJ,Jolly,DJ,Chang,Sff,Schlesinger,SandDubensky,Jr,.T,1999.StablealphaviruspackagingcelllinesforSindbisvirus-derivedvectorsandSemlikiforestvirus-derivedvectors.ProcNatlAcadSciUSAVol96:4598-4603)。本發(fā)明所述辛德畢斯病毒包裝細胞株含兩個表達盒，每個表達盒都含有部分結(jié)構(gòu)蛋白基因。做一些修飾能有利于表達盒的構(gòu)建和提聞包裝效率。適當(dāng)?shù)味鹊狞S病毒PVLP幾乎能感染100%的敏感細胞。用不同滴度的PVLP感染六孔板中的Vero細胞。約在感染24小時后，加入包裝辛德畢斯PVLP，37°C搖床振蕩2小時，然后用培養(yǎng)基沖洗，除去未吸附的辛德畢斯PVLP。在二次感染后，用辛德畢斯特異性多克隆抗體處理，去除可能產(chǎn)生的復(fù)制型辛德畢斯顆粒。48小時后，收集細胞培養(yǎng)基。為了部分純化PVLP，將培養(yǎng)液置于微型離心機中，16，000g40°C離心15分鐘，取上清。然后用Sorvall0TD55B離心機AH650轉(zhuǎn)頭，40，OOOrpm4°C超速離心2小時，沉淀病毒顆粒。再用50illPBS重懸沉淀，4°C過夜。為確定登革PVLP的滴度，用50ill10倍倍比稀釋的細胞培養(yǎng)液或沉淀的重懸液于37°C感染八孔細胞培養(yǎng)玻片(chamberslides)中的BHK-21細胞2小時。繼而用Iml含有2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基替換上述液體。細胞在CO2培養(yǎng)箱中37°C孵育24小時，最后用1:100滴度的HMAF進行免疫熒光分析，如下文所述。實施例2:第二個包裝細胞株的實施例是基于哺乳動物基因表達系統(tǒng)。由于真核表達質(zhì)粒pC1-neo(Promega)表達效率高(Almond,BDandSchenborn,ET,AcomparisonofpC1-neovectorandpcDNA4/HisMaxvector.PromegaPublication),所以本發(fā)明用該質(zhì)粒表達結(jié)構(gòu)蛋白C-pr(pr代表prM中的片段pr)。pC1-neo哺乳動物表達載體含有一個CMVIE增強子/啟動子，一個優(yōu)化的嵌合內(nèi)含子和猴病毒40(SV40)后期多聚腺苷酸化信號。這三個元素的結(jié)合使被克隆的基因在哺乳動物細胞中高效組成型表達。以登革2型病毒(DEN-2)為例。用PCR方法，以DEN-2cDNA為模板擴增DEN~2NGC(一種登革病毒株)結(jié)構(gòu)蛋白C和pr中編碼1-105氨基酸(nt93-640)的基因片段。引物中加入XhoI和XbaI兩個單一酶切位點。將PCR產(chǎn)物與pCI載體一起用XhoI和XbaI消化，消化產(chǎn)物用Qiagen柱純化，然后連接成pC1-C質(zhì)粒。將篩選的陽性克隆用Qiagen柱純化，其中的C蛋白基因序列通過DNA測序驗證。繼而將pC1-C電轉(zhuǎn)染BHK-21細胞，在96孔板上以不同滴度篩選G418抗性細胞的單個克隆。最后用缺失C蛋白的DEN-2復(fù)制子轉(zhuǎn)染篩選出來的各細胞克隆，收集培養(yǎng)液測定每個克隆的包裝能力。理想的包裝細胞株應(yīng)能生產(chǎn)高水平的病毒樣顆粒，而不產(chǎn)生復(fù)制型病毒。實施例3:第三個實施例的包裝細胞是基于四環(huán)素誘導(dǎo)基因表達系統(tǒng)。該系統(tǒng)可采用Clontech的商業(yè)產(chǎn)品-Tet-On和Tet_0ff。這些產(chǎn)品可通過加入或移除四環(huán)素而誘導(dǎo)基因表達，詳情請參見Clontech手冊中相關(guān)產(chǎn)品的描述。選擇Tet-Off系統(tǒng)是為了避免在PVLP制備過程中存在抗生素。為獲得四環(huán)素誘導(dǎo)表達的包裝細胞株(四環(huán)素誘導(dǎo)黃病毒結(jié)構(gòu)蛋白基因盒Cpr表達)，本發(fā)明建立了一種能穩(wěn)定表達四環(huán)素轉(zhuǎn)錄激活因子的BHK細胞株BHK-Tet-Off。方法如下:將pTet-off質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染BHK21細胞。兩天后，加入200yg/ml抗生素G418(Sigma)篩選陽性克隆。通過這次轉(zhuǎn)染，成功地分離和培養(yǎng)了一些細胞克隆。然后，在含有0.g/ml強力霉素或缺乏強力霉素(一種與四環(huán)素廣譜相同但特異性活力更強、半壽期更長的抗生素)條件下轉(zhuǎn)染PTRE2熒光素酶質(zhì)粒，分析這些細胞克隆的誘導(dǎo)表達能力。與未誘導(dǎo)細胞相比，能高度誘導(dǎo)熒光素酶表達的BHK-Tet-Off細胞可用于建立表達黃病毒結(jié)構(gòu)蛋白基因盒Cpr的穩(wěn)定細胞株。然后，將黃病毒Cpr基因的PCR片段接入質(zhì)粒pTK-Hyg構(gòu)建成質(zhì)粒pTRECpr，轉(zhuǎn)染那些已被證明為高表達的細胞株。在培養(yǎng)基中分別加入潮霉素、G418和強力霉素至終濃度10ug/ml、200ug/ml和0.5yg/ml，篩選被轉(zhuǎn)染的細胞。為選出最高效的包裝細胞株，將黃病毒復(fù)制子RNA電擊轉(zhuǎn)染具有G418和嘌呤霉素抗性的細胞克隆。在無強力霉素的條件下培養(yǎng)，以確定它們是否能生產(chǎn)PVLPs。用鼠超免疫腹水免疫熒光分析PVLPs感染的Veix)細胞，以測定收獲培養(yǎng)液(CFs)中的PVLPs的滴度(感染單位IU/ml)。最高效的細胞克隆被用于PVLP的生產(chǎn)。在另一個具體方案中，采用四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)的改良方案。在本實施例中，構(gòu)建了兩套雙順反子表達載體pTet-off和pCpr(Fig.6)以增加包裝細胞株的穩(wěn)定性，減少需要篩選的細胞數(shù)量。其中，所構(gòu)建的自調(diào)控表達質(zhì)粒pTet-off依次含有一個四環(huán)素調(diào)控啟動子PhCiv*-!(來自Clontech質(zhì)粒pTRE2)，四環(huán)素反應(yīng)轉(zhuǎn)錄激活因子(tTA)和潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶(Hygr)的雙順反子表達盒。當(dāng)受到誘導(dǎo)時，自調(diào)控tTA表達載體允許tTA的高水平表達；當(dāng)加入強力霉素后，tTA保持低水平表達以最小化其毒性。所構(gòu)建的質(zhì)粒pCpr含有Pm^1啟動子，啟動子后是C-pr和新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(Neor)的雙順反子表達盒。將質(zhì)粒pTet-off轉(zhuǎn)染BHK-21細胞，再加入0.4mg/ml潮霉素B和0.5yg/ml強力霉素進行篩選，所獲陽性克隆為BHK/Tet-ofT細胞。在0.5yg/ml強力霉素或無強力霉素的條件下，通過質(zhì)粒PTRE2EGFP的轉(zhuǎn)染分析10個克隆的誘導(dǎo)表達能力。所有克隆的EGFP表達均顯示出一定程度的可誘導(dǎo)性。最高EGFP誘導(dǎo)生產(chǎn)能力的克隆被用于建立穩(wěn)定表達登革蛋白Cpr的BHK細胞株。用質(zhì)粒pCpr轉(zhuǎn)染該細胞株，然后在0.2mg/mlG418、0.3mg/ml潮霉素B和0.5yg/ml強力霉素條件下篩選。為選出最高效率包裝的細胞株，將復(fù)制子DEN2/AC(一個缺失C編碼序列160-320nt的克隆)RNA電擊轉(zhuǎn)染15個細胞株，然后在無強力霉素的培養(yǎng)基內(nèi)進行培養(yǎng)。以間接免疫熒光分析(IF)方法用登革3型超免疫鼠腹水(HMAF)測定收獲培養(yǎng)液(CFs)中復(fù)制子VLP的滴度(感染單位IU/ml)。15個克隆中的10個能生產(chǎn)復(fù)制子VLPs。最高效率的細胞克隆BHK/Cpr/8能產(chǎn)生4.6xl06IU的復(fù)制子VLPs。實施例4:與缺陷黃病毒基因組RNA互補的包裝細胞株。該缺陷黃病毒基因組在非結(jié)構(gòu)基因(如NS3)的C端存在一個致死性大片段缺失。用巨細胞病毒CMV即時早期增強子/啟動子替代在上文所述全長克隆中的SP6啟動子，獲得一個新質(zhì)粒。通過融合PCR，將黃病毒序列5’端連在CMV序列后。將丁肝病毒反基因組核糖酶(HDVr)序列直接插入黃病毒最后一個核苷酸下游。然后加入腦心肌炎病毒的內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)和新霉素的抗性基因(ORF)作為選擇壓力。將所構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK21細胞。兩天后，加入抗生素G418(Sigma)至終濃度200yg/ml以篩選細胞克隆。一些細胞克隆被成功地分離和培養(yǎng)出來。為選出最有效率的包裝細胞株，將具有G418和嘌呤霉素抗性的細胞克隆與黃病毒復(fù)制子RNA—起電穿孔，以確定是否能生產(chǎn)出PVLPs。用鼠超免疫酸性液體對PVLPs感染的Veix)細胞進行免疫熒光分析，以測定收獲培養(yǎng)液(CFs)中的PVLPs的滴度(感染單位IU/ml)。最高效的細胞克隆被用于PVLP的生產(chǎn)。為進一步促進病毒樣顆粒(VLP)的形成，可以在prM信號序列羧基末端插入和替換氨基酸(例如VPQAQA突變)(見圖3最上面的部分，VPQAQA突變可被插入在C和prM連接區(qū)的109-114殘基之間)。VPQAQA序列能增強信號肽酶的剪切。該插入有利于prM蛋白的信號肽酶剪切，降低了其對細胞質(zhì)中病毒NS2B-3蛋白酶剪切的依賴。本工作提高了包裝效率。通過兩次連續(xù)的細胞電擊轉(zhuǎn)染，黃病毒RNA復(fù)制子被包裝到PVLP中。例如，先將黃病毒復(fù)制子RNA電擊轉(zhuǎn)染細胞，24小時后用表達互補黃病毒結(jié)構(gòu)蛋白的重組辛德畢斯病毒復(fù)制子RNA再次轉(zhuǎn)染細胞。一旦獲得了黃病毒PVLPs，第一次細胞電擊轉(zhuǎn)染的步驟就可以用PVLP感染代替。類似Sindbis反式提供黃病毒基因的方法也被用于小RNA病毒(如脊髓灰質(zhì)炎病毒)復(fù)制子PVLPs的生產(chǎn)，該復(fù)制子必需的結(jié)構(gòu)蛋白由痘苗載體反式提供(Porter，DC,Wang,J,Moldoveanu,Z,McPherson,SandMorrow,C,1997.1mmunizationofmicewithpoliovirusrepliconsexpressingtheC-fragmentoftetanustoxinprotectsagainstlethalchallengewithtetanustoxin.Vaccine15:257-264)。體液抗體和細胞免疫反應(yīng)均參與了機體抵抗黃病毒感染和感染恢復(fù)的過程。所述的基于黃病毒復(fù)制子的疫苗激發(fā)了上述免疫反應(yīng)的兩個方面。這些顆粒中含有preM和E蛋白，因此，這些顆粒本身就是免疫原。所述的顆粒感染宿主細胞，并在其中表達額外的preM和E蛋白。preM和E蛋白可以從那些細胞中釋放，提供額外的針對宿主的抗原刺激物，或能在被感染的宿主細胞表面表達，例如，在宿主抗原提呈細胞上提供針對宿主的另一種抗原刺激物。疫苗復(fù)制子含有病毒抗原，包括結(jié)構(gòu)蛋白prM和E，并能自主表達非結(jié)構(gòu)蛋白NSl。以前的報告證實，那些病毒蛋白誘導(dǎo)了保護性免疫反應(yīng)(Heinz，F(xiàn)X&Roehrig,J，1990，inImmunochemistryofViruses,VolI1.Amsterdam-NY-Oxford,Elsvier,p.289-305；HeinzFX，1986，Epitopemappingofflavivirusglycoproteins.AdvVirusRes31:103—168;Bray,MandLai,CJ,1991,Dengueviruspremembraneandmembraneproteinselicitaprotectiveimmuneresponse.Virology,185:505-508；HenchalEA,Henchal,LSandShlesinger，JJ，1988，Synergisticinteractionsofant1-NSImonoclonalantibodiesprotectpassivelyimmunizedmicefromlethalchallengewithdengue2virus.J.GenVirol.69:2101-2107；andSchlesingerJJ，Brandriss，MW，Cropp，CBetal.，1986.Protectionagainstyellowfeverinmonkeysbyimmunizationwithyellowfevervirusnon-structuralproteinNSLJVirol60:1153-1155).正如存在黃病毒感染的動物模型一樣，也存在用于檢測所述藥物組合物效力的適宜模型。例如，一種免疫小鼠后用登革病毒攻毒的方案已有報道(Bray，M，Zhao,B，Marckoff，L，Eckels，K，Chanock，RMandLai，C，1989，Miceimmunizedwithrecombinantvacciniavirusexpressingdengue4virusstructuralproteinswithorwithoutnonstructuralproteinNSlareprotectedagainstfataldengueencephalitis.J.Virol.63:2853-2856)。簡而言之，每組10只雌性BALB/c小鼠，實驗組小鼠腹膜接種病毒樣顆粒，對照組動物給予磷酸緩沖液(PBS)。小鼠三周齡時進行首次免疫(第一天)，第14天進行二次免疫。所有動物在第0天和第21天進行取血。第22天給小鼠腦內(nèi)注射100倍半數(shù)致死量(LD50)的登革病毒進行攻毒。攻毒后觀察21天,觀察小鼠有無腦炎癥狀,并且每日記錄出現(xiàn)任何重要癥狀(腦炎，偏癱和死亡)的小鼠數(shù)量。收集存活下來的小鼠的血清，以用于比較攻毒前的血清。每一個VLP的劑量都進行了測量。用商品化標記試劑盒和抗體對免疫小鼠的抗登革病毒蛋白血清反應(yīng)進行放射性免疫沉淀分析，其中登革病毒抗原用[35s]甲硫氨酸標記。用蝕斑減少實驗測量小鼠血清中特異性登革中和抗體的滴度。取約0.5ml血清樣品進行分析，先于56°C孵育30分鐘進行熱滅活，然后用含2%熱滅活FBS的M199培養(yǎng)基稀釋血清，從1:10開始，以4倍倍比稀釋，獲得一系列終體積為0.3ml的血清稀釋物。每一份0.3ml的稀釋血清均加入等體積的含有150-180PFU登革病毒的培養(yǎng)基。將病毒和血清混合并在37°C保溫30分鐘。在每個實驗中，均包括一個無血清對照和一組不同登革病毒類型特異性鼠超免腹水(ATCC)的對照，腹水為2倍稀釋。用Costar六孔板(康寧公司，康寧，紐約)培養(yǎng)LLC-MK2融合單層細胞，每孔分別加入0.2ml病毒-血清和對照混合物。每個樣品感染兩個孔。室溫下每15分鐘手搖一次，持續(xù)I小時完成病毒吸附過程。然后每孔用6ml培養(yǎng)基覆蓋，該培養(yǎng)基含有1%瓊脂糖(SeaKemLE;BioWhittaker,Rockland,Maine)、Earle’s平衡鹽溶液、10%FBS,以及一些必需維生素和氨基酸(Invitrogen)。平板在含5%CO2的37°C環(huán)境中孵育7天。然后用含有I%瓊脂糖的4%中性紅溶液(4ml中性紅外加96mlPBS)覆蓋這些小孔。平板在37°C孵育24小時。平均蝕斑數(shù)用于計算蝕斑數(shù)目水平的半數(shù)減少。以一個四聯(lián)登革疫苗為例，該疫苗可以使宿主同時對登革1、2、3、4型免疫。因為各種黃病毒具有該屬病毒共同的遺傳結(jié)構(gòu)，所以，可以通過本發(fā)明所提供的各種登革病毒類型的復(fù)制子(1、2、3和4型)達到獲得四聯(lián)疫苗的目的。本發(fā)明提供的疫苗制造方法包括:用兩個載體攜帶黃病毒結(jié)構(gòu)基因，在酵母中通過同源重組重建整個黃病毒結(jié)構(gòu)基因，得到重疊肽(overlappingpeptide),然后用一個包裝細胞攜帶該重疊肽。該疫苗制造方法不僅可應(yīng)用到登革病毒中，也可應(yīng)用到所有的黃病毒屬病毒中。如同已知的疫苗技術(shù)，所述PVLP可被添加到適于給予的疫苗藥物組合物中。這類組合物一般包括活性組分和藥學(xué)上可接受的載體。如本文所用的，術(shù)語“藥學(xué)上可接受的載體”包括任何的和所有的溶劑、分散劑、包衣、抗生素和抗真菌劑、等滲和吸收延遲劑等可與藥物兼容的成分。這些用于藥物有效成分的介質(zhì)和試劑的使用在疫苗工業(yè)中廣為人知。除與活性物質(zhì)不能相容的介質(zhì)或試劑以外，其它成分均可以考慮在組合物中使用。補充的活性組分也可添加到組合物中。本發(fā)明所采用的藥物組合物與預(yù)設(shè)的給藥途徑相容。可選擇的給藥途徑包括腸道外給藥，如靜脈注射、皮內(nèi)注射、皮下注射、口服(例如吸入劑)、經(jīng)皮(局部)、經(jīng)粘膜和直腸給藥。腸道外、皮內(nèi)或皮下應(yīng)用的溶液或懸液可包括下述組分:滅菌的稀釋劑，如注射用水、生理鹽水、非揮發(fā)油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶劑；抑菌劑，如苯甲基乙醇或?qū)αu基苯甲酸甲酯；抗氧化劑，如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，如EDTA;緩沖液，如醋酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；和調(diào)節(jié)張力的試劑，如氯化鈉或葡萄糖。PH可用酸或堿進行調(diào)節(jié)，如鹽酸或氫氧化鈉。腸道外制劑可包裝在玻璃或塑料制造的安剖瓶、一次性使用注射器或多倍劑量管形瓶中。適于注射用的藥物組合物包括無菌水溶液(水溶性組分)或分散液，以及臨用前配置無菌注射液或分散液的無菌粉末。對于靜脈給藥，合適的載體包括生理鹽水、抑菌水、CremophorEL*(BASF；Parsippany,NJ)或磷酸鹽緩沖液(PBS)。在任何情況下,該組合物必須是無菌的，并且應(yīng)該是容易注射的液體。該組合物在制造和儲存條件下必須是穩(wěn)定的，并且在保存過程中必須避免微生物如細菌和真菌的污染。載體可以是含有諸如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)及其適宜混合物的溶劑或分散介質(zhì)。通過使用卵磷脂做包衣，或在分散液中維持需要的顆粒大小，或使用表面活性劑等方法，可以保持藥物適當(dāng)?shù)牧鲃有浴Ｊ褂酶鞣N抗菌劑和抗真菌劑可以達到抑制微生物的作用，例如，對羥苯甲酸酯、三氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞等。通常，在組合物中加入等滲劑也是一種較好的選擇，如蔗糖、甘露醇、山梨醇或氯化鈉等多元醇。注射劑的延長吸收可通過在組合物中加入能延緩吸收的諸如單硬脂酸鉛和明膠等試劑而實現(xiàn)。將溶解在適當(dāng)溶劑中適當(dāng)劑量的活性成分與一種上文所述成分或其組合物混合，可以制備出無菌注射液，根據(jù)需要，還可輔以過濾除菌。通常，賦形劑含有基本的分散介質(zhì)和上文所述的其它必要成分，將活性成分加入滅菌的賦形劑中可制備出分散劑。制備可調(diào)成無菌注射液的無菌粉末的優(yōu)選方法是:將活性成分和其它事先滅菌、過濾的組分混合后真空干燥和凍干。口服劑通常包括惰性的稀釋劑或可食用的載體。該組合物可包入膠囊或壓縮成片齊U。為口服治療需要，可以將活性組分與片劑、錠劑或膠囊等劑型的賦形劑混合。口服劑也可通過液體載體制成糖漿或液體制劑，或用作漱口，其用法包括口服、漱口、吐出或咽下。藥學(xué)上可兼容的結(jié)合劑，和/或佐劑也可作為藥物組合物的一部分。片劑、丸劑、膠囊、錠劑等可含有下述具有相似性質(zhì)的任何成份或混合物:粘合劑，如微晶纖維素、西黃著膠或明膠；賦形劑，如淀粉或乳糖；崩解劑，如海藻酸、Primogel或玉米淀粉；潤滑劑,如硬脂酸鎂或氫化植物油；助流劑，如二氧化硅膠；甜味劑，如蔗糖或糖精；或調(diào)味劑，如薄荷、冬青油或橙味劑。對于吸入給藥而言，藥物可通過以下形式給予:通過壓力容器、含有適宜推進劑如二氧化碳氣的分散器或噴霧器產(chǎn)生的飛沫，或薄霧。系統(tǒng)給藥也可同通過透粘膜或透皮方式實現(xiàn)。對于透粘膜或透皮給藥，在制劑中可加入能透過吸收屏障的滲透劑。這些滲透劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，例如，對于透粘膜給藥，可使用去污劑、膽汁鹽和夫西地酸衍生物作為滲透劑。透粘膜給藥可通過噴鼻劑或栓劑實現(xiàn)。對于透皮給藥，活性成份可制成軟膏、油劑、凝膠劑或乳膏等本領(lǐng)域熟知的劑型。疫苗也可制成栓劑(如以可可豆脂和其它甘油酯為基質(zhì)的常用栓劑)或灌腸劑，供直腸給藥應(yīng)用。在一個實施例中，制劑時加入一些載體，以保護活性成分使其免于被機體快速排出。這種控釋劑型包括包括埋植劑和微囊分配系統(tǒng)。也可以使用可生物降解的、生物兼容的聚合物，如乙烯醋酸乙烯共聚物、聚酐、聚乙醇酸、膠原、多正酯類和聚乳酸。這些劑型的制備方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。所用的材料也可通過商業(yè)渠道從阿爾扎集團和諾華制藥公司獲取。脂質(zhì)體懸液(包括用單克隆抗體和其它類似的靶向分子定向的脂質(zhì)體)也可用作藥學(xué)上可接受的載體，其制備可采用本領(lǐng)域人員所熟知的方法，如美國專利N0.4，522，811所述的方法。將口服或腸道外的藥物組合物按照適宜的劑量單位水平做成制劑，有利于方便給藥和控制劑量。此處所述的劑量單位水平是指根據(jù)治療需要確定的、不連續(xù)的劑量單位。每個單位含有預(yù)定劑量的活性成分及其所需的藥學(xué)載體，該劑量能達到預(yù)期的治療效果。劑量，即優(yōu)選的給藥途徑和數(shù)量，可根據(jù)臨床前和臨床研究獲得的經(jīng)驗數(shù)據(jù)確定，該方法為本領(lǐng)域人員所熟知。根據(jù)疾病情況，治療可能持續(xù)幾天或更長時間，需多次給藥，直至癥狀好轉(zhuǎn)、預(yù)期的治療效果出現(xiàn)。其它的用藥方法也可采用。治療的進展易通過常規(guī)的技術(shù)和分析而進行監(jiān)測。WO94/04188提供的劑量用法值得效仿。本發(fā)明指示的劑量單位水平遵從并直接依賴于活性成分的獨特特點和要取得的特殊治療效果。對于個體治療而言，這種確定用量的方法在活性成分組合技術(shù)上存在固有局限。藥物組合物可與用藥說明一起裝入容器、小包或分配器。另一種給藥方式是將所述的成分加入食物或飲料，作為食品補充劑或添加劑，或作為一種類似維生素的預(yù)防用制劑。所述的多肽可通過某些形式的包被而順利通過胃環(huán)境(免于破壞)。這些形式是總所周知的，如腸溶衣。另外，可通過修飾提高所述多肽的半壽期，如肽鍵的化學(xué)修飾；根據(jù)本領(lǐng)域熟知的知識，這些修飾還能確保口服給藥的穩(wěn)定性。此處引用的所有文獻都以整體文獻的形式進行了整合。應(yīng)該理解，對此處所述的當(dāng)前優(yōu)選例的各種改變和修飾對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言將是顯而易見的。這樣的改變和修改能夠在沒有脫離本發(fā)明的精神和范圍，沒有縮小其預(yù)期優(yōu)點的情況下取得。因此，這樣的改變或修飾也被附加的權(quán)利要求所覆蓋。權(quán)利要求1.一種經(jīng)改造的黃病毒基因組復(fù)制子，其特征在于，所述復(fù)制子不含轉(zhuǎn)基因，并且表達黃病毒的囊膜蛋白(E)、前膜蛋白(prM)和/或膜蛋白(M)的至少一種免疫決定簇，不表達C蛋白或者表達的C蛋白不能用于形成感染性病毒所需的功能性衣殼。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)制子，其特征在于，所述復(fù)制子為經(jīng)改造的登革病毒基因組復(fù)制子，并且由登革病毒基因組刪除了160nt-320nt而成。3.一種非復(fù)制型黃病毒顆粒，其特征在于，所述黃病毒顆粒含有權(quán)利要求1或2所述的復(fù)制子。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的非復(fù)制型黃病毒顆粒，其特征在于，所述黃病毒為登革病毒。5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的非復(fù)制型黃病毒顆粒，其特征在于，所述黃病毒為西尼羅河病毒。6.根據(jù)權(quán)利要求3至5中任一項所述的非復(fù)制型黃病毒顆粒，其特征在于，所述黃病毒為日本腦炎病毒。7.根據(jù)權(quán)利要求3至6中任一項所述的非復(fù)制型黃病毒顆粒，其特征在于，所述黃病毒為黃熱病毒。8.一種藥物組合物，其含有權(quán)利要求3至7中任一項所述的非復(fù)制型黃病毒顆粒和藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。9.一種制備權(quán)利要求3至7中任一項所述的非復(fù)制型黃病毒顆粒的方法，所述方法包括:用權(quán)利要求1或2所述的復(fù)制子轉(zhuǎn)染宿主細胞，且所述宿主細胞表達C蛋白；優(yōu)選地，當(dāng)所述宿主細胞用所述復(fù)制子轉(zhuǎn)染時，C蛋白的表達被誘導(dǎo)。10.一種轉(zhuǎn)化的細胞，其特征在于，其表達黃病毒的結(jié)構(gòu)蛋白C，且被權(quán)利要求1或2所述的復(fù)制子所轉(zhuǎn)化。全文摘要一種復(fù)制子病毒樣顆粒，能用于制備黃病毒疫苗。文檔編號C12N15/40GK103088038SQ20131001466公開日2013年5月8日申請日期2005年7月11日優(yōu)先權(quán)日2004年7月12日發(fā)明者龐小伍,顧心彬申請人:美國天甲生物醫(yī)藥有限公司,上海天甲生物醫(yī)藥有限公司,北京東方天甲科技發(fā)展有限公司