專利名稱：葡萄球菌腸毒素小分子抗體及制備方法及用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程重組抗體，特別涉及一種葡萄球菌腸毒素小分子抗體及制備方法及用途。
背景技術：
葡萄球菌腸毒素(Staphylococcal enterotoxins, SEs)是由血衆凝固酶或耐熱核酸酶陽性葡萄球菌，如金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus, SA)和表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis, SE)等產生的一組單肽鏈可溶性胞外蛋白質毒素。該毒素家族結構相關、毒力相似，但抗原性不同，其中以金黃色葡萄球菌產生的腸毒素致病力最強，是導致食物中毒的常見重要致病因子。迄今，世界諸多國家都曾相繼報道金黃色葡萄球菌的暴發流行，其中，美國由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒占整個細菌性食物中毒的33%，加拿大則更多，占45%，而我國每年此類中毒事件則占約25%。葡萄球菌的易感染性及其腸毒素的強致病性不僅嚴重危害人類健康，且直接間接經濟損失巨大。除引起急性胃腸炎外，葡萄球菌腸毒素還可引發毒性休克綜合癥(Toxic shock-like syndrome, STSS),亦與川崎疾病、銀屑病等免疫疾病相關，已成為世界性衛生問題。葡萄球菌腸毒素為分子量較小的簡單蛋白，約27.5^30.0kDa，易溶于水及鹽溶液，對胃蛋白酶、胰蛋白酶等消化酶有抵抗作用，同時可耐受100°c煮沸30min而不被破壞。自從1959年葡萄球菌腸毒素被證實以來，已獲得腸毒素類型共21種，根據血清學特征分類，包括早為人類發現和熟知的五種腸毒素SEA，SEB, SEC (C型又可分為Cl、C2和C3三亞型)，SED, SEE 和毒性休克綜合癥毒素 I(Toxic shock syndrome toxin-1, TSST-1,既 SEF),以及近幾年相繼發現的 SEG, SEH, SEI, SEJ, SEK, SEL, SEM, SEN, SE0, SEP, SEQ, SER, SET, SEU等多種新型腸毒素。葡萄球菌腸毒素的生物活性以催吐活性和超抗原活性為主，表現在引發類似細菌內毒素誘導的發熱反應、致命性休克、增強宿主對內毒素敏感性、細胞因子分泌，以及刺激T細胞快速增殖等。研究表明，并非所有的腸毒素都具有催吐活性，其中以SEA和SED最常見，并以SEA毒力最強，攝入I μ g即能引起中毒。雖然已從基因水平對傳統及新型腸毒素加以區分，但關于其毒素蛋白及功能的研究甚少，尚無借鑒資料，因此廣泛獲得不同動物及動物性食品中葡萄球菌株，提純天然腸毒素蛋白，可為研究葡萄球菌腸毒素檢測方法及其功能活性奠定基礎，對豐富其認識亦有重要意義。目前，葡萄球菌腸毒素導致食物中毒機制有待于進一步證實，從免疫機制研究，可能與其介導大量細胞因子釋放而引起多器官損害有關。與此同時，作為第一個被發現的超抗原，其獨特高效的誘導機體免疫機制依舊倍受關注。新生物構建技術與其固有生物特性的結合，葡萄球菌腸毒素研究及應用前景將更為廣闊。對于葡萄球菌腸毒素蛋白的檢測方法和治療手段多基于免疫原理，但均受到傳統抗體制備技術的制約，如多克隆抗體特異性差，單克隆抗體分子量大，親和力弱，免疫原性強，應用于人體時 HMAM反應強烈等缺陷。隨著分子生物學的進一步發展，抗體技術也逐步由細胞工程抗體(單克隆抗體)向基因工程抗體演替。基因工程抗體，又被稱為第三代抗體，主要技術領域包括人源化抗體、小分子抗體、抗體庫技術。基因工程抗體具有分子小、免疫原性低、可塑性強及成本低等優點。此技術的基本原理是，首先從雜交瘤或免疫脾細胞、外周血淋巴細胞等中提取mRNA，逆轉錄成cDNA后，經PCR分別擴增出抗體的輕鏈及重鏈可變區基因，按特定方式連接克隆到表達載體后，表達、折疊成功能抗體分子，篩選出高表達的細胞株，再用親和層析等手段純化抗體片段。該技術的著眼點在于盡量減少鼠源成分，保留原有抗體的親和力和特異性，可以對完整抗體及抗體片段進行改造，且不受倫理和技術等因素的制約，發展迅速。小分子抗體是基因工程抗體技術的重要應用產物，可應用于寄生蟲抗原表位、自身免疫疾病、基因治療、腫瘤印象分析與治療等方面。小分子抗體分子量約為完整IgG的1/6，有利于穿透腫瘤組織，并避免了傳統制備方法中細胞雜交的過程，減少工作量，提高制備成功率。另外，此類抗體保留完整抗原結合位點，并缺失Fe片段，減少了與FcR陽性細胞發生非特異性結合的可能性，最大限度地降低鼠源性蛋白的同時，降低了免疫變態反應的可能性。現階段，小分子抗體的技術路線普遍采取將輕鏈可變區和重鏈可變區基因通過寡聚核苷酸以串聯方式連接后，經原核系統表達，折疊后形成只由重鏈和輕鏈可變區構成的單鏈抗體。該傳統方法雖宜于基因工程操作及大量制備抗體，但其導致的輕鏈或重鏈肽鏈反向、缺乏糖基化修飾、折疊錯誤等缺陷，使得所獲抗體空間構象有別于天然抗體，進而影響抗體的特異性和親和力。基因工程重構抗體技術日趨成熟，但將其應用于葡萄球菌腸毒素抗體的研究，國內外罕有報道，且研究對象僅局限于SEB、SEC等少數傳統腸毒素。綜述其基本路線為:查找相關IgG抗體的基因序列，分析抗體基因的結構及完整性，利用PCR技術分別擴增其重鏈可變區和輕鏈可變區基因序列，再通過LinkeH多采用(Gly4Ser)3)將二者連接，克隆到表達載體后轉入表達系統。2009年，Kalinina等建立抗SECl基因重構抗體原核表達體系，但受到表達系統蛋白修飾功能缺乏的制約，其蛋白活性表現受阻，該抗體與SEA、SEB、SED、SEE、SEG和SEI均有不同程度交叉反應，特異結合能力有待提高；2010年，Pawan等通過PCANTAB5E載體系統制備出特異性強和親和力高的抗SEB單鏈抗體，但研究發現該表達系統隨時間推移分泌能力逐漸消失，穩定性缺陷突顯。`

發明內容
本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種應用于葡萄球菌腸毒素檢測的葡萄球菌腸毒素小分子抗體。本發明的第二個目的是提供一種葡萄球菌腸毒素小分子抗體的制備方法。本發明的第三個目的是提供一種葡萄球菌腸毒素小分子抗體的用途。本發明的技術方案概述如下:一種葡萄球菌腸毒素小分子抗體，是序列表中SEQ ID N0.1所示氨基酸序列。一種葡萄球菌腸毒素小分子抗體的制備方法，包括如下步驟:(I)制備葡萄球菌腸毒素單抗雜交瘤細胞5C12 ；(2)采用Trizol法提取葡萄球菌腸毒素單抗雜交瘤細胞5C12總mRNA，以oligo(dT) 18為引物,逆轉錄合成cDNA ；(3)在相對保守的FRl區和FR4區，設計由所述葡萄球菌腸毒素單抗雜交瘤細胞5C12表達的單抗的輕鏈可變區基因的上、下游簡并引物，分別為SEQ ID N0.8和SEQ IDN0.9所示，以及由所述葡萄球菌腸毒素單抗雜交瘤細胞5C12表達的單抗的重鏈可變區基因的上、下游簡并引物，分別為SEQ ID N0.10和SEQ ID N0.11所示；以cDNA為模板，PCR擴增獲得輕鏈可變區基因和重鏈可變區基因，分別克隆至pUC-T simple載體，經測序及IMGT/V-QUEST,BLAST分析，確認所獲序列符合鼠源抗體可變區經典結構，均為功能性V (D)J重排模式，其中，輕鏈可變區基因為SEQ ID N0.2所示，其編碼的多肽為SEQ ID N0.3所示；重鏈可變區基因為SEQ ID N0.4所示，其編碼的多肽為SEQ ID N0.5所示；(4)設計輕鏈可變區基因的上、下游表達引物，分別用SEQ ID N0.12和SEQ IDN0.13所示，以SEQ ID N0.2所示序列為模板，通過PCR擴增，使輕鏈可變區基因序列C端修飾半胱氨酸及Sma I和Xba I酶切位點；設計重鏈可變區基因的上、下游表達引物，分別用SEQ IDN0.14和SEQ ID N0.15所示，以SEQ ID N0.4所示序列為模板，通過PCR擴增，使重鏈可變區基因序列C端修飾半胱氨酸及Nhe I和Hind III酶切位點，同時在輕鏈可變區基因序列和重鏈可變區基因序列的N端引入Kozak序列；(5)經酶切、連接，將步驟(4)獲得的修飾的重鏈可變區基因序列插入真核表達載體 pcDNA3.1 (+)，獲得 pcDNA3.1-Vh 過渡載體；另以pIRESneo質粒為模板，以SEQ ID N0.16和SEQ ID N0.17所示核苷酸為上、下游引物，通過PCR擴增獲得ivs-1RES序列；同時以步驟(4)獲得的修飾的輕鏈可變區基因序列和ivs-1RES序列為模板，以SEQ ID N0.12所示核苷酸為上游引物，以SEQ ID N0.17所示核苷酸為下游引物，采用兩步法重疊PCR方法，擴增獲得帶有后續重組操作BamHI和XbaI酶切位點的ivs-1RES-'融合基因片斷，插入所述pcDNA3.1-Vh過渡載體，構建真核單啟動子共表達重組載體P5C12HIL0，其中，5'-VH-1vs-1RES-VL_3'融合序列為SEQ ID N0.6所示，p5C12HIL0質粒序列為SEQ ID N0.7所示；(6)通過Lipo2000脂質體介導瞬時轉染哺乳動物細胞BHK-21細胞系，經PCR鑒定和G418抗性篩選，獲得穩定表達分泌細胞系。上述抗體在葡萄球菌腸毒素檢測中的應用。其中檢測為細胞間接免疫熒光檢測法或流式細胞術檢測法。本發明設計并構建葡萄球菌腸毒素單抗輕鏈、重鏈可變區基因的真核單啟動子共表達載體，分別于輕鏈、重鏈C端引入半胱氨酸殘基，結合細胞內肽段自組裝原理形成鏈間二硫鍵，模擬天然抗體的抗原結合域空間構象，獲得高效表達穩定分泌哺乳動物細胞系及特異性高、親和力強的小分子抗體。 實驗證明，本發明的葡萄球菌腸毒素小分子抗體可以應用于葡萄球菌腸毒素檢測中，可以應用于細胞間接免疫熒光檢測和流式細胞術檢測。本發明中所涉及的葡萄球菌腸毒素為天然的葡萄球菌腸毒素或者通過原核表達獲得的重組葡萄球菌腸毒素，該腸毒素優選為葡萄球菌腸毒素A、葡萄球菌腸毒素G、葡萄球菌腸毒素K、葡萄球菌腸毒素O、葡萄球菌腸毒素Q、葡萄球菌腸毒素U型中的一種或多種。


圖1:葡萄球菌腸毒素單抗可變區基因克隆的電泳圖片；圖中A為輕鏈可變區基因擴增電泳圖譜，M為DNA Marker2000,l為葡萄球菌腸毒素單抗雜交瘤細胞5C12的輕鏈可變區基因，2為陰性對照，3為空白對照。B為重鏈可變區基因擴增電泳圖譜，M為DNAMarker2000,1為葡萄球菌腸毒素單抗雜交瘤細胞5C12的重鏈可變區基因，2為陰性對照，3為空白對照。圖2:真核單啟動子共表達重組載體P5C12HIL0質粒圖譜。圖3:細胞間接免疫熒光(IFA)結果圖；圖中a-g為SEA、SEA-his、SEG-his、SEK-his、SEO-his、SEQ-his、SEU-his 處理組，h 為陰性對照細胞系。圖4:穩定表達細胞系識別天然及重組抗原流式細胞術(FCM)結果圖。
圖5:兩步法重疊PCR反應程序。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明作進一步的說明。1.葡萄球菌腸毒素單抗雜交瘤細胞5C12的制備以SEO-GST融合蛋白為免疫抗原，免疫6周齡Balb/c小鼠4次，2周/次:初次免疫采用加入等量弗氏完全佐劑方法頸背部多點皮下注射，免疫抗原劑量為IOOyg/只；二次免疫采用加入等量弗氏不完全佐劑方法頸背部多點皮下注射，免疫抗原劑量為100 μ g/只；第三次及終次免疫不加佐劑，采用尾靜脈注射，免疫抗原劑量為50 μ g/只。處死已結束免疫的Balb/c小鼠，無菌取脾，制備免疫脾臟細胞懸浮液備用。通過PEG法體外融合免疫脾細胞與骨髓瘤SP2/0細胞，步驟如下:分別吸取并混勻IX IO8個免疫脾細胞和5 X IO7個SP2/0細胞，1000r/min離心lOmin，棄上清；緩緩加入lmL37°C預溫的PEG4000融合劑，作用90s后使用DMEM液終止反應，800r/min離心lOmin，棄上清；加入適量HAT選擇培養基，以1000個cell/孔鋪于96孔細胞培養板中，每2天更換培養液，持續篩選7d ;陽性細胞通過有限稀釋法單克隆后， 逐步擴大培養，制備得到葡萄球菌腸毒素單抗雜交瘤細胞5C12。2.單抗雜交瘤輕鏈、重鏈可變區基因克隆、測序分析及表達載體的構建(I)選取穩定分泌抗葡萄球菌腸毒素單克隆抗體的雜交瘤細胞5C12株，采用Trizol法提取葡萄球菌腸毒素單抗雜交瘤細胞5C12的總mRNA，以oligo(dT)18為引物，逆轉錄合成cDNA。(2)分別在相對保守的FRl區和FR4區，設計由所述葡萄球菌腸毒素單抗雜交瘤細胞5C12表達的單抗的輕鏈可變區基因的上、下游簡并引物，分別用SEQ ID N0.8和SEQ IDN0.9所示，以及由所述葡萄球菌腸毒素單抗雜交瘤細胞5C12表達的單抗的重鏈可變區基因的上、下游簡并引物，分別為SEQ ID N0.10和SEQ ID N0.11所示；以cDNA為模板，通過PCR擴增獲得輕鏈可變區基因\和單抗重鏈可變區基因VH。輕鏈可變區基因PCR反應體系(50 μ L):
權利要求
1.一種葡萄球菌腸毒素小分子抗體，是序列表中SEQ ID N0.1所示氨基酸序列。
2.一種葡萄球菌腸毒素小分子抗體的制備方法，包括如下步驟: (1)制備葡萄球菌腸毒素單抗雜交瘤細胞5C12； (2)采用Trizol法提取葡萄球菌腸毒素單抗雜交瘤細胞5C12總mRNA，以oligo(dT)18為引物，逆轉錄合成cDNA ； (3)在相對保守的FRl區和FR4區，設計由所述葡萄球菌腸毒素單抗雜交瘤細胞5C12表達的單抗的輕鏈可變區基因的上、下游簡并引物，分別為SEQ ID N0.8和SEQ ID N0.9所示，以及由所述葡萄球菌腸毒素單抗雜交瘤細胞5C12表達的單抗的重鏈可變區基因的上、下游簡并引物，分別為SEQ ID N0.10和SEQ ID N0.11所示^cDNA為模板，PCR擴增獲得輕鏈可變區基因和重鏈可變區基因，分別克隆至pUC-T simple載體，經測序及MGT/V-QUEST, BLAST分析，確認所獲序列符合鼠源抗體可變區經典結構，均為功能性V (D) J重排模式，其中，輕鏈可變區基因為SEQ ID N0.2所示，其編碼的多肽為SEQ ID N0.3所示；重鏈可變區基因為SEQ ID N0.4所示，其編碼的多肽為SEQ ID N0.5所示； (4)設計輕鏈可變區基因的上、下游表達引物，分別用SEQID N0.12和SEQ ID N0.13所示，以SEQ ID N0.2所示序列 為模板，通過PCR擴增，使輕鏈可變區基因序列C端修飾半胱氨酸及Sma I和Xba I酶切位點；設計重鏈可變區基因的上、下游表達引物，分別用SEQIDN0.14和SEQ ID N0.15所示，以SEQ ID N0.4所示序列為模板，通過PCR擴增，使重鏈可變區基因序列C端修飾半胱氨酸及Nhe I和HindIII酶切位點，同時在輕鏈可變區基因序列和重鏈可變區基因序列的N端引入Kozak序列； (5)經酶切、連接，將步驟(4)獲得的修飾的重鏈可變區基因序列插入真核表達載體pcDNA3.1 (+)，獲得 pcDNA3.1-Vh 過渡載體； 另以PlRESneo質粒為模板，以SEQ ID N0.16和SEQ ID N0.17所示核苷酸為上、下游引物，通過PCR擴增獲得ivs-1RES序列；同時以步驟(4)獲得的修飾的輕鏈可變區基因序列和ivs-1RES序列為模板，以SEQ ID N0.12所示核苷酸為上游引物，以SEQ ID N0.17所示核苷酸為下游引物，采用兩步法重疊PCR方法，擴增獲得帶有后續重組操作BamHI和XbaI酶切位點的ivs-1RES-'融合基因片斷，插入所述pcDNA3.1-Vh過渡載體，構建真核單啟動子共表達重組載體P5C12HIL0，其中，5'-VH-1vs-1RES-VL_3'融合序列為SEQ ID N0.6所示，p5C12HIL0質粒序列為SEQ ID N0.7所示； (6)通過Lipo2000脂質體介導瞬時轉染哺乳動物細胞BHK-21細胞系，經PCR鑒定和G418抗性篩選，獲得穩定表達分泌細胞系。
3.權利要求1的抗體在葡萄球菌腸毒素檢測中的應用。
4.根據權利要求3所述的應用，其特征是所述檢測為細胞間接免疫熒光檢測法。
5.根據權利要求3所述的應用，其特征是所述檢測為流式細胞術檢測法。
全文摘要
本發明公開了一種葡萄球菌腸毒素小分子抗體及制備方法及用途，一種葡萄球菌腸毒素小分子抗體是序列表中SEQ ID No.1所示氨基酸序列。本發明設計并構建葡萄球菌腸毒素單抗輕鏈、重鏈可變區基因的真核單啟動子共表達載體，分別于輕鏈、重鏈C-端引入半胱氨酸殘基，結合細胞內肽段自組裝原理形成鏈間二硫鍵，模擬天然抗體的抗原結合域空間構象，獲得高效表達穩定分泌哺乳動物細胞系及特異性高、親和力強的小分子抗體。本發明的葡萄球菌腸毒素小分子抗體可應用于葡萄球菌腸毒素檢測，細胞間接免疫熒光檢測和流式細胞術檢測。
文檔編號C12N15/11GK103224561SQ20131001612
公開日2013年7月31日 申請日期2013年1月16日 優先權日2013年1月16日
發明者黃金海, 劉鵬翀, 孫盈 申請人:天津大學