專利名稱：凡納濱對蝦金屬硫蛋白基因LvMT及其編碼蛋白和應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及凡納濱對蝦金屬硫蛋白基因LvMT及其編碼蛋白和應用。
背景技術：
金屬硫蛋白(metallothionein, MT)的化學名稱為金屬硫組氨酸三甲基內鹽,是一類普遍存在于生物體內的低分子量^_7kDa)、富含半胱氨酸、熱穩定性、可誘導型非酶蛋白。1957年，Margoshes和Vallee首先在馬腎細胞中發現MT ；1977年，Casterline和Barnett在大豆根中發現了植物中的第一個MT，隨后陸續又在糠穗草、番茄等植物中發現了植物金屬硫蛋白，現已在多種真核和原核生物中發現了 MT基因和蛋白。金屬硫蛋白富含Cys，能夠大量結合二價重金屬離子，具有很強的金屬結合能力和氧化還原能力，在生物體內主要參與微量元素儲存、運輸和代謝，重金屬解毒，拮抗電離輻射，清除自由基，以及機體生長、發育、生殖、衰老、腫瘤發生、免疫、應激反應等生理生化反應。其研究和開發利用涉及農業、醫藥、生物工程、環境保護等各個領域，具有重要的應用價值，金屬硫蛋白也因此成為生命科學研究的熱點之一。與此同時，許多海洋生物體內都含有MTs或類金屬硫蛋白(MTLPs),至今已發現，1979年,首次報道了美洲牡販(Crassostrea virginica)的MT,此后又陸續60多種無脊椎動物中存在著MTs。目前為止，在大多數主要無脊椎動物中都發現了MTs，不同物種間的MT存在顯著的差異，表現多種生理生態功能。凡納濱對蝦又稱南北白對蝦，由于其具有繁殖期長；廣鹽性；廣溫性；可以密養產量高；抗病力較強；耐干性較強；肉質鮮美；個體較大等優點目前已經成為全球第一大養殖對蝦，并且也是我國對蝦養殖的主 導品種。使凡納濱對蝦一躍成為養殖最多的品種。近年來養殖產量有很大提高，從2001年以來，我國養殖凡納濱對奸面積和產量一直居于對奸養殖的首位。2009年凡納濱對蝦養殖產量約110萬噸，占對蝦總產量的87%，其中我省養殖產量超過四十萬噸，所占比例接近40%。凡納濱對蝦的生長受環境的影響非常明顯，比如溫度、含氧量以及重金屬等因素。為了減少生態環境中重金屬對于凡納濱對蝦的影響，金屬硫蛋白作為重金屬篩查的一種特殊生物標記也有較多研究。然而凡納濱對蝦的MT基因篩選報道較少，且MT基因的鑒定和功能分析至今未有報道。

發明內容
本發明第一個目的是提供一種凡納濱對蝦金屬硫蛋白基因LvMT及其編碼蛋白。本發明的凡納濱對蝦金屬硫蛋白基因LvMT，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其編碼的凡納濱對蝦金屬硫蛋白LvMT的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。考慮到密碼子的簡并性，在不改變氨基酸序列的前提下，對上述編碼基因的核苷酸序列進行修改，也屬于本發明的保護范圍內。本發明的第二個目的是提供一種含有凡納濱對蝦金屬硫蛋白基因LvMT的重組表達載體。
所述的表達載體優選為原核表達載體pET_32a。本發明的第三個目的是提供一種轉化有含有凡納濱對蝦金屬硫蛋白基因LvMT的重組表達載體的宿主細胞。所述的宿主細胞優選為大腸桿菌BL21。本發明的第四個目的是提供凡納濱對蝦金屬硫蛋白基因LvMT在抗重金屬方面的應用。本發明根據抑制縮減雜交文庫中的凡納濱對蝦MT基因的EST全長基因序列，設計了特異性引物，再提取凡納濱對蝦腮組織的RNA反轉錄合成cDNA，以該cDNA為模板，采用上述特異性引物進行PCR擴增出LvMT基因片段，采用瓊脂糖凝膠電泳回收片段，連接于PMD18-T載體上，獲得重組載體pMD18-LvMT，測序分析，該序列包含一個開放閱讀框，為177個堿基，其序列如SEQ ID NO.1所示，將此基因命名為LvMT，其編碼蛋白具有58個氨基酸殘基，其序列如SEQ ID NO. 2所示，將該蛋白命名為LvMT，再將LvMT基因片段連接到原核表達載體pET-32a中，再用化學法將含有LvMT基因的原核表達載體pET_32a轉入大腸桿菌中，篩選陽性菌株擴大培養后利用IPTG誘導表達金屬硫蛋白，將誘導表達后的陽性菌株涂布含不同重金屬濃度的LB固體培養基平板，37°C培養，平板上的菌落數目明顯多于沒有轉入LvMT基因的大腸桿菌。將LvMT 基因編碼的蛋白質在 NCBI (http://www. ncb1. nlm. nih. gov/)中米用Blastx程序進行序列比對之后，發現該蛋白和Dromia personata的金屬硫蛋白序列有72%的同源性(如圖1所示)，說明LvMT基因所編碼的蛋白具有金屬硫蛋白的結構特征。經Blastx比對，LvMT基因所編碼的蛋白序列不與任何先前已公布的蛋白序列完全一致，說明其是一個新發現的蛋白序列。本發明首次從凡納濱對蝦中克隆出凡納濱對蝦金屬硫蛋白基因LvMT，并通過實驗證明該基因具有抗重金屬的功能。因此本發明對提高宿主細胞的耐受重金屬能力、同時克服它們自身對重金屬耐受力低的缺點提供了一種有效的技術手段，具有廣泛的應用前景和極大的經濟價值。


圖1是LvMT基因編碼的蛋白的Blastx對比結果圖；圖2是凡納濱對蝦腮組織RNA電泳圖，其中M為DL2000的Marker，1-4為RNA ；圖3是cDNA轉錄的電泳圖，其中M為DL2000的Marker，1為cNDA ；圖4是LvMT基因擴增電泳圖，其中M為DL2000的Marker，1為LvMT基因；圖5是LvMT基因純化后的電泳圖，其中M為DL2000的Marker，1為LvMT基因；圖6是重組載體pMD18_LvMT轉化大腸桿菌后的菌落PCR檢測電泳圖，其中M為DL2000的Marker，1、4、5、6為陽性菌落PCR擴增產物，2、3為陰性菌落PCR擴增產物(轉入了空載體)；圖7是雙酶切檢測原核重組載體pET-32a_LvMT的電泳圖，其中，M為λ -HindIIIdigest DNAMarker, 1為被雙酶切的原核重組表達載體pET_32a_LvMT ；圖8是原核重組表達載體pET-32a_LvMT菌落PCR檢測電泳圖，其中M為DL2000的Marker，1-6為菌落PCR擴增產物；
圖9是原核重組表達載體pET-32a_LvMT誘導表達的SDS-PAGE電泳圖，其中I為蛋白Marker，2為未經IPTG誘導的原核表達載體pET_32a，3為經IPTG誘導的原核表達載體pET-32a，4為未經IPTG誘導的原核重組表達載體pET-32a_LvMT，5為經IPTG誘導的原核重組表達載體pET-32a-LvMT ；圖10是重金屬氯化鎘耐受力檢測圖，圖中的pET32a_LvMT代表轉化有原核重組表達載體pET-32a-LvMT的大腸桿菌BL21，pET32a代表轉化有空原核表達載體pET_32a的大腸桿菌BL21。
具體實施例方式以下實施例是對本發明的進一步說明，而不是對本發明的限制。下列實施例中未注明具體實驗條件和方法，所采用的技術手段通常為本領域技術人員所熟知的常規手段。實施例中所涉及的材料及來源如下大腸桿菌DH5 α感受態細胞、大腸桿菌BL21感受態細胞、pMD18_T載體、原核表達載體pET-32a、大腸桿菌BL21均購自天根生化科技有限公司。實施例1 :凡納 兵對it!下金屬硫蛋白基因LvMT的克隆及測序1、引物的設計在已構建的凡納濱對蝦淡水脅迫文庫中篩選出凡納濱對蝦金屬硫蛋白基因全長EST，根據 EST 設計上游引物(5 ’ -ACGGGATCCGCCACCATGCCTGATCCATGCTGT-3，)(下劃線表示酶切位點BamHI)和下游引物(5’ -AGCAAGCTTCTGGGCAGCACTT-3 ’)(下劃線表示酶切位點Hindlll)，引物由英濰捷基(上海)貿易有限公司合成。2、RNA 的提取 以凡納濱對蝦腮組織為材料，使用Trizol法提取總RNA，具體操作如下用液氮將O.1g凡納濱對蝦腮組織研磨成粉末以后，加入ImL Trizol提取液(購自invitrogen公司，貨號為15596-026)，室溫放置5min，使其充分裂解，再加入氯仿，振蕩混勻15分鐘，室溫放置15min，4°C 12000g離心15min，再加入O. 5mL異丙醇混勻，室溫放置5-10min,4°C 12000g離心IOmin,再加入lmL75%乙醇，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀，40C 8000g離心5min，室溫晾干，再加入50 μ I DEPC處理水待溶解充分后測O. D值定量RNA濃度。RNA電泳結果如圖2所示。3、cDNA 的合成以提取的凡納濱對蝦腮組織的RNA為模板，用S叩erScHpt III反轉錄酶合成 cDNA，具體步驟為RNA2y I (約 5 μ g)、Oligo (d Τ)201 μ IUOmM dNTPl μ 1，DEPC 處理水補足總體積至13 μ I ;65°C處理5min后，轉至冰上IOmin ;再加入5X第一鏈緩沖液4μ 1,0.1MDTTly1、RNA酶抑制劑1μ 1，1μ I反轉錄酶(購自invitrogen公司，貨號為18080-051 )，25°C反應5min，然后50°C反應60min ;70°C處理15min使反轉錄酶失活，得到cDNA序列。cDNA電泳結果如圖3所示。4、擴增基因LvMT的cDNA序列并克隆、測序以cDNA為模板，使用上述上游引物和下游引物進行PCR擴增基因LvMT。PCR擴增反應體系共 20 μ1: (IOX) Ex-Taq 緩沖液 2. 5 μ1、Ex-TaqO. 2 μ1、cDNA 模板 I μ IUOmM(1ΝΤΡ0.4μ 1、10μΜ上游引物1μ 1、10μΜ下游引物1μ 1，使用CldH2O補足至20μ I。反應條件為94°C 2min, 30 個循環，94°C變性 30s，55°C退火 30s，72°C有延伸 30s，72°C反應 lOmin。將PCR產物在1. 5%的瓊脂糖凝膠上進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖4所示。使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(購自天根生化科技有限公司，貨號為DP209)對瓊脂糖凝膠電泳中的目的條帶進行回收，具體操作步驟參照產品說明書。取3μ I用于瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖5所示，由此得到基因LvMTcDNA。采用pMD18-T vector kit (購自寶生物工程(大連)有限公司，貨號為D101A)對基因LvMT進行TA克隆，具體步驟為向1. 5mL離心管中分別加入基因LvMTcDNA 2. 5 μ UpMD18-Τ 載體 I μ I (50ng/μ I)、Ligation Solution I 3. 5 μ I,用封口膜封好,置于金屬浴中16 0C過夜連接獲得連接產物。使用熱激法將上述連接產物轉化大腸桿菌DH5CI感受態細胞(購自天根生化科技有限公司，貨號為CB101 )，具體步驟為將7μ I上述連接產物加入到100 μ I大腸桿菌Ε. coli DH5 α感受態細胞中，混合，再將混合液冰浴20min，42°C熱刺激45s，再冰浴2min，加入900 μ I SOC液體培養基，370C、150rpm搖床培養60min ;在超凈臺上吸取300 μ I菌液于含有Amp、IPTG和X-gal的LB固體培養基平板上，用無菌三角玻璃棒涂布均勻，37 °C過夜培養。在上述過夜培養的LB固體培養基平板上挑取白色菌落，接種到帶有Amp抗性的LB液體培養基中培養12h，用上述上游引物和下游引物進行菌落PCR檢測重組情況，PCR擴增體系和條件與之前擴增Lv MT基因相同。使用1. 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果圖6所示，由此得到含有重組載體pMD18-LvMT的陽性克隆，該陽性克隆是將PMD18-T載體與基因LvMT相連接。對重組載體pMD18_LvMT進行測序，經分析表明，該序列包含一個開放閱讀框,為177個堿基，其序列如SEQ ID NO.1所示，將此基因命名為LvMT，其編碼蛋白具有58個氨基酸殘基，其序列如SEQ ID NO. 2所示，將該蛋白命名為LvMT。將LvMT 基因編碼的蛋白質在 NCBI (http://www. ncb1. nlm. nih. gov/)中米用Blastx程序進行序列比對之后，發現該蛋白和Dromiapersonata的金屬硫蛋白序列有72%的同源性(如圖1所示)，說明LvMT基因所編碼的蛋白具有金屬硫蛋白的結構特征。經Blastx比對，LvMT基因所編碼的蛋白序列不與任何先前已公布的蛋白序列完全一致，說明其是一個新發現的蛋白序列。實施例2 :構建原核重組表達載體pET-32a_LvMT使用BamHI限制性內切酶和HindIII限制性內切酶對重組載體pMD18_LvMT和原核表達載體pET-32a (購自天根生化科技有限公司，貨號為V1078)分別進行雙酶切獲得LvMT基因片段和線型的pET-32a雙酶切片段，具體步驟為向0. 5mL離心管中分別加入重組載體pMD18-LvMT2y I (lOOng/μ I)、BamHI限制性內切酶0. 5 μ1、HindIII限制性內切酶0. 5 μ1、10XK buffer2y 1，使用ddH20補足至20 μ 1，37°C反應8h。使用1. 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收LvMT基因和原核表達載體pET-32a，將回收的片段進行連接，具體步驟為=LvMT基因片段3 μ I (約300ng)、原核表達載體pET_32al μ I(IOOng/μ I)、Ligation Solution 14 μ I,金屬浴中16 °C過夜連接，將原核表達載體pET-32a和LvMT基因連接，得到原核重組表達載體pET-32a_LvMT。使用熱激法將原核重組表達載體pET-32a_LvMT轉化大腸桿菌BL21感受態細胞(購自天根生化科技有限公司，貨號為CB105)，具體步驟為向100 μ I大腸桿菌BL21感受態細胞中加入6 μ I上述原核重組表達載體pET-32a-LvMT的連接液，混合液冰浴20min，42°C熱刺激45s，再冰浴2min，加入900 μ ISOC液體培養基，37°C、150rpm搖床培養60min，然后在超凈臺上吸取300 μ I菌液轉入帶有Amp、IPTG和X-Gal的LB固體培養基平板上，用無菌三角玻璃棒涂布均勻；37°C過夜培養。挑取白斑接種于帶有Amp抗性LB液體培養基中37°C、200rpm搖床培養12h，提取質粒，進行電泳檢測。通過雙酶切檢測獲得原核重組表達載體pET-32a-LvMT，具體方法為向 O. 5mL 離心管中分別加入質粒 DNA2y l(50ng/y l)、BamHI0. 5μ l、HindIII0. 5μ 1U0XKbufferfy 1，使用ddH20補足至20 μ I，37°C反應8h，使用1. 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖7所示；同時利用上述上游引物和下游引物對菌液進行PCR擴增檢測，結果如圖8所由此得到轉有含有LvMT基因的原核表達載體pET_32a的大腸桿菌BL21，即得到含有原核重組表達載體pET-32a-LvMT的大腸桿菌BL21。實施例3 :原核重組表達載體pET-32a_LvMT的誘導表達分別取500 μ I轉化有原核重組表達載體pET-32a_LvMT的大腸桿菌BL21菌液和轉化有空原核表達載體pET-32a的大腸桿菌BL21菌液置于30mL LB液體培養基中，37°C、180rpm搖床培養2h ，培養結束后，分別取出1ml，測定菌液0D600值，0D600達到O. 6，再分別取出2管(2ml/管)菌液，作為未經IPTG誘導的樣品和未經IPTG誘導的陰性對照，再分別向剩余的兩種菌液中加入終濃度為O. 8mM的IPTG進行誘導，30°C、180rpm搖床培養2. 5h，分別取出2管(2ml/管)菌液，作為經IPTG誘導的樣品和經IPTG誘導的陰性對照。未經IPTG誘導的樣品、未經IPTG誘導的陰性對照、經IPTG誘導的樣品、經IPTG誘導的陰性對照各取一管(2ml/管),用于總蛋白分析。具體步驟為4°C、12000rpm離心2min,棄上清，再加入100 μ I細菌蛋白抽提緩沖液，再加入25 μ 15Χ蛋白上樣緩沖液(LoadingBuffer)，然后煮沸 5min，-20°C保存。對上述2種樣品和2種陰性對照進行SDS-PAGE電泳檢測分析。具體步驟為制備分離膠、濃縮膠，2種樣品和2種陰性對照各上樣10 μ 1，電泳后，取出分離膠，置于固定液中，搖床固定30min,棄固定液,加入染色液染色30min,棄染色液,加入脫色液,脫色60min ；棄脫色液，加入ddH20，搖床45rpm過夜，取出膠體，置于膠板上掃描，結果如圖9所示。由此可見，未經IPTG誘導的樣品和經IPTG誘導的樣品均誘導出LvMT蛋白，而未經IPTG誘導的陰性對照和經IPTG誘導的陰性對照則沒有誘導出LvMT蛋白。實施例4 :重金屬耐受性實驗分別將轉化有原核重組表達載體pET-32a_LvMT的大腸桿菌BL21菌液和轉化有空原核表達載體pET-32a的大腸桿菌BL21菌液涂布于含有0，40，80，120，160，200mM的氯化鎘的LB固體培養基平板上，每一個濃度設有三個重復，37°C培養箱培養過夜，統計每個LB平板的菌體個數。實驗結果顯示轉化有原核重組表達載體PET-32a-LvMT的大腸桿菌BL21在40mM的氯化鎘平板上菌個體數目開始明顯多于轉化有空原核表達載體pET-32a的大腸桿菌BL21的個體數目，在200mM的氯化鎘濃度平板上轉化有空原核表達載體pET_32a的大腸桿菌BL21幾乎沒有長出菌落，而轉化有原核重組表達載體pET-32a-LvMT的大腸桿菌BL21在200mM氯化鎘的LB固體培養基平板上的菌斑有三十多個(如圖10所示)。
由此可見，轉化有原核重組表達載體pET-32a_LvMT的大腸桿菌BL21對重金屬具有的一定的抗性，從而證明了凡納濱對蟲下金屬硫蛋白基因LvMT具有典型的金屬硫蛋白基因重金屬離子耐受性的功 能。
權利要求
1.一種凡納濱對蝦金屬硫蛋白基因LvMT，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一種由權利要求1所述的凡納濱對蝦金屬硫蛋白基因LvMT編碼的凡納濱對蝦金屬硫蛋白LvMT，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3.一種含有權利要求1所述的凡納濱對蝦金屬硫蛋白基因LvMT的重組表達載體。
4.根據權利要求3所述的含有凡納濱對蝦金屬硫蛋白基因LvMT的重組表達載體，其特征在于，所述的表達載體為原核表達載體pET-32a。
5.一種轉化有權利要求3或4所述的重組表達載體的宿主細胞。
6.根據權利要求5所述的宿主細胞，其特征在于，所述的宿主細胞為大腸桿菌BL21。
7.權利要求1所述的凡納濱對蝦金屬硫蛋白基因LvMT在抗重金屬方面的應用。
全文摘要
本發明公開了一種凡納濱對蝦金屬硫蛋白基因LvMT及其編碼蛋白和應用。所述的凡納濱對蝦金屬硫蛋白基因LvMT，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其編碼的金屬硫蛋白LvMT的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本發明首次從凡納濱對蝦中克隆出金屬硫蛋白基因LvMT，并通過實驗證明該基因具有抗重金屬的功能。因此本發明對提高宿主細胞的耐受重金屬能力、同時克服它們自身對重金屬耐受力低的缺點提供了一種有效的技術手段，具有廣泛的應用前景和極大的經濟價值。
文檔編號C12N15/70GK103060333SQ201310018000
公開日2013年4月24日 申請日期2013年1月17日 優先權日2013年1月17日
發明者王艷紅, 任春華, 胡超群, 張呂平, 夏建軍 申請人:中國科學院南海海洋研究所