專利名稱：多通道環(huán)介導(dǎo)核酸等溫擴增定量檢測器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于核酸等溫擴增技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于多通道環(huán)介導(dǎo)核酸等溫擴增定量(LAMP)檢測器。
背景技術(shù)：
常規(guī)的病原微生物檢測方法是采用體外培養(yǎng)技術(shù)，但是，僅有約1%的細菌或病毒可以培養(yǎng)，以及培養(yǎng)過程的復(fù)雜性和漫長的培養(yǎng)時間，大大限制了這樣技術(shù)的普及。以聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)為代表的基于核酸的檢測技術(shù)發(fā)展迅速，為病原體的精確檢測診斷提供了可能。經(jīng)過幾十年的改進，PCR方法已從定性發(fā)展為定量，能夠在幾個小時內(nèi)，從幾個拷貝或單個細胞開始擴增到數(shù)十億特異性的核酸片段，而且特異性也有了極大的提高。然而，從PCR技術(shù)的誕生之日起，它始終無法擺脫依賴精良儀器設(shè)備的局限，使得以PCR為基礎(chǔ)的核酸擴增檢測技術(shù)無法更廣泛地推廣和應(yīng)用。基于這種強烈的需求，以核酸等溫擴增技術(shù)為基礎(chǔ)的檢測技術(shù)近年來得到了迅猛的發(fā)展。核酸等溫擴增技術(shù)不需 要溫度變化的時間過程，擺脫了對精良儀器設(shè)備的依賴，使得我們對病原體的檢測診斷得以快速并高通量的實現(xiàn)。Notomi等于2000年開發(fā)的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增法(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技術(shù)，其特點是針對靶基因的6個區(qū)域設(shè)計4條特異引物，并利用一種鏈置換DNA聚合酶(Bst DNApolymerase)在等溫條件(65 °C左右)保溫幾十分鐘，即可高效、快速、高特異地完成革巴核酸序列的擴增反應(yīng)。該技術(shù)不需要模板的熱變性、長時間溫度循環(huán)、繁瑣的電泳、紫外觀察等過程。LAMP是一種嶄新的DNA擴增方法，具有簡單、快速、特異性強的特點，具有替代PCR方法的可能性。近年來，國外己將該技術(shù)廣泛應(yīng)用于病原體檢測。Masaki Imai等人(2007)利用LAMP建立了禽流感病毒的實驗室確診體系；0buyuki Rayashi等人(2007)針對四種香酒酵母的ITS序列設(shè)計了特異性引物，建立了高效的LAMP檢測體系。LAMP法的原理
DNA在65°C左右處于動態(tài)平衡狀態(tài)，任何一個引物向雙鏈DNA的互補部位進行堿基配對延伸時，另一條鏈就會解離，變成單鏈。上游內(nèi)部引物FIP的F2序列首先與模板F2c結(jié)合，在鏈置換型DNA聚合酶的作用下，以FIP引物F2區(qū)段的3’末端為起點，與模板DNA互補序列配對，啟動鏈置換DNA合成。F3引物與F2c前端F3c序列互補，以3’末端為起點，通過鏈置換型DNA聚合酶的作用，一邊置換先頭FIP引物合成的DNA鏈。一邊合成自身DNA，如此向前延伸。最終F3引物合成而得的DNA鏈與模板DNA形成雙鏈。由FIP引物先合成的DNA鏈被F3引物進行鏈置換產(chǎn)生一單鏈，這條單鏈在5’末端存在互補的Flc和Fl區(qū)段，于是發(fā)生自我堿基配對，形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。同時，BIP引物同該單鏈雜交結(jié)合，以BIP引物的3’端為起點，合成互補鏈，在此過程中環(huán)狀結(jié)構(gòu)被打開。接著，類似于F3，B3引物從BIP引物外側(cè)插入，進行堿基配對，以3’端為起點，在聚合酶的作用下，合成新的互補鏈。通過上述兩過程，形成雙鏈DNA。而被置換的單鏈DNA兩端存在互補序列，自然發(fā)生自我堿基配對，形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，于是整條鏈呈現(xiàn)啞鈴狀結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)是LAMP法基因擴增循環(huán)的起始結(jié)構(gòu)。至此為止的所有過程都是為了形成LAMP法基因擴增循環(huán)的起點結(jié)構(gòu)。在啞鈴狀結(jié)構(gòu)中，以3’末端的Fl區(qū)段為起點，以自身為模板，進行DNA合成延伸。與此同時，F(xiàn)IP引物F2與環(huán)上單鏈F2c雜交，啟動新一輪鏈置換反應(yīng)。解離由Fl區(qū)段合成的雙鏈核酸。同樣，在解離出的單鏈核酸上也會形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。在環(huán)狀結(jié)構(gòu)上存在單鏈形式B2c，BIP引物上的B2與其雜交，啟動新一輪擴增。經(jīng)過相同的過程，又形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。通過此過程，結(jié)果在同一條鏈上互補序列周而復(fù)始形成大小不一的結(jié)構(gòu)。該方法主要是利用4種不同的特異性引物識別靶基因的6個特定區(qū)域，且可在等溫條件進行擴增反應(yīng)?；虻臄U增和產(chǎn)物的檢測可一步完成，擴增效率高，可在15 60min擴增IO9 101°倍；特異性高，所有靶基因序列的檢測可只通過擴增產(chǎn)物的有、無來判另O。有、無擴增反應(yīng)是利用熒光定量PCR儀檢測反應(yīng)的熒光強度或利用核酸擴增過程中產(chǎn)生的焦磷酸鎂沉淀反應(yīng)，用濁度儀檢測沉淀濁度來判定的。(I)熒光定量檢測利用SYBR Green I熒光染料只與雙鏈DNA小溝結(jié)合，當(dāng)它與DNA雙鏈結(jié)合時，發(fā)出較原先強800 1000倍的熒光的原理，在一個體系內(nèi)，其信號強度代表了雙鏈DNA分子的數(shù)量。在核酸大量合成時，SYBR Green I能自動摻入雙鏈DNA，通過檢測所產(chǎn)生的熒光強度，獲取Ct值，比照標(biāo)準(zhǔn)曲線，可確定模板DNA的起始拷貝數(shù)。
(2)焦磷酸鎂副產(chǎn)物的濁度檢測在核酸大量合成時，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的Mg2+結(jié)合，產(chǎn)生焦磷酸鎂副產(chǎn)物沉淀。反應(yīng)方程式如下
(DNA)lri +dNTP= (DNA) n+P2074_
P2O74- +2Mg2+=Mg2P207(沉淀)
此反應(yīng)具有極高的特異性，在400nm光下，檢測沉淀濁度就能夠判斷擴增與否。LAMP還可以檢測其他與人類相關(guān)的病毒，如病毒性出血性敗血病、巨細胞病毒、埃博拉病毒、慢性伯基特淋巴瘤病`毒、虹彩病毒，人類疤疹病毒、造血組織壞死病毒、番茄斑萎病毒、番茄黃化曲葉病毒、口蹄疫病毒等的檢測。但是LAMP反應(yīng)的“等溫模式”和其復(fù)雜的核酸探針使其不能實現(xiàn)一個樣品中多種目標(biāo)物的同時檢測，即多重檢測。微流控芯片技術(shù)的發(fā)展為我們提供了一個十分有效的解決方案。利用微流控芯片相關(guān)技術(shù)解決了 LAMP檢測的多重性難題，克服了上述缺陷。本發(fā)明為LAMP芯片提供一種多通道的LAMP檢測儀，其檢測原理為光電比色法，其分析對象為各類核酸分子，例如病原微生物及其他生物樣品。本發(fā)明的檢測器以LAMP芯片核心，由檢測器控制主板1、與上位機通訊或檢測器之間通訊及儀器調(diào)試或數(shù)據(jù)存貯打印用的主板接口 2、電源3、顯示屏4、操作面板/按鍵5、光源及光電檢測器6、光纖連接線7、檢測芯片8、反光鏡片9、加熱板10、進樣池11、廢液池12、泵/閥13、液路連接管14等組成。檢測方法包括進樣、溫控和檢測等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種可更換芯片的多重LAMP檢測器，一個芯片可以同時檢測一個樣品中多種目標(biāo)物，更換不同芯片，可以實現(xiàn)多種病原體或其他核酸檢測
本發(fā)明提供的多通道核酸等溫擴增定量檢測器，采用于環(huán)介導(dǎo)等溫擴增及微流控芯片技術(shù)，快速檢測病原微生物。本發(fā)明的檢測器由電路、LAMP芯片、液路和光路四個部分構(gòu)成。電路部分控制液路和光路，并采集處理光路中的光電信號，控制液路中的泵閥開啟停止或關(guān)閉，LAMP芯片通過光纖和液體管路與光路及液路連接。電路部分由電源3、主板1、顯示屏4、鍵盤/操作面板5及主板接口 2構(gòu)成。電源3可采用市電供電或12V電池供電，主板I采用MCU作為控制器及數(shù)據(jù)采集芯片，如C8051F340或STM32F106等，采用片上集成A/D或前置信號放大器轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號后輸入到MCU。主板接口 2的功能是與上位機通訊或檢測器之間通訊及儀器調(diào)試或數(shù)據(jù)存貯和打印使用，如USB接口、RS232、SF卡接口、網(wǎng)絡(luò)接口、無線通訊接口等。液路部分由進樣池11、廢液池12、泵/閥13和連接管道14構(gòu)成；樣品及檢測試劑均由進樣池11注入。LAMP芯片具有光纖和液路管道接口，內(nèi)有擴增池，擴增池內(nèi)包被針對目標(biāo)物的特異性探針，通過可更換LAMP芯片與被測液體進行接觸，保證了儀器主體部分并不與被測液體進行接觸，從而避免了被測液體和化學(xué)試劑對檢測器主體的腐蝕，也使得被測液體與電氣單元完全地隔離起來，提高了安全性，還具有抗干擾性。光路部分由檢測用光源與光電檢測器6、連接光纖7及光反射鏡8構(gòu)成。連接光纖7由3根以上的多模光纖組成，具有傳導(dǎo)光源光和芯片光的雙重作用，檢測光源采用激光器組件，包含波長為650nm的紅色可見二極管激光器；電源3經(jīng)過控制主板I與檢測光源的激光二極管相連；光電檢測器的光信號通過光電池檢測。多重LAMP檢測器所采用的可更換LAMP芯片接口，且接口具有可擴展性，可以根據(jù)實際需求更換不同數(shù)量檢測通道的芯片，芯片內(nèi)的檢測通道數(shù)決定了光纖接口的數(shù)量，如三重、五重或十重通道分別外接3個、5個、10個檢測光纖，實現(xiàn)任意多重的LAMP有效擴增及多重LAMP檢測信號的有效區(qū)分，為臨床多種病原體快速診斷提供一種有效手段。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點
I)本發(fā)明的檢測器可以更換各種類型的多通道芯片，以實現(xiàn)多重LAMP信號的有效區(qū)分，結(jié)果直觀檢測并顯示存貯到SD卡中，檢測器便攜，功耗低，可用電池驅(qū)動，有利于LAMP方法的推廣和應(yīng)用。2)可以根據(jù)實際需求更換任意多重的LAMP有效擴增芯片8，從而滿足臨床任意多種病原體的有效快速診斷。3)從加樣到結(jié)果檢測全部自動化操作，簡單方便，非專業(yè)人員通過檢測器上帶有的例程即可成功操作。4)使用本檢測器可自動化快速定量檢測樣品中的特征病原體，具有靈敏度高、檢測速度快、特異性強、操作簡單、結(jié)果穩(wěn)定、自動給出測量結(jié)果、便攜等優(yōu)點。本檢測器與芯片相連接的探頭部分采用光纖及全防腐材料制成，且主體部分并不與被測液體進行接觸，從而避免了被測液體和化學(xué)試劑對檢測器主體的腐蝕，具有耐腐蝕性，也使得被測液體與電氣單元完全地隔離起來，提高了安全性。芯片更換操作簡單，清洗方便，且對被測液體的取樣量需求很少，避免了樣品及檢測試劑的浪費，還把污染等風(fēng)險降低到最小。本發(fā)明的檢測體系在自動控溫的條件下，快速、方便、高效、高特異、高靈敏地檢測各種病原微生物及其他生物樣品，為臨床、醫(yī)學(xué)研究、環(huán)境、食品安全等領(lǐng)域的應(yīng)用提供了新的技術(shù)平臺，能較好滿足現(xiàn)場檢測的迫切需要，易于大范圍推廣應(yīng)用，具有廣闊的市場前景和較大的經(jīng)濟、社會效益。適合從事分子生物學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、環(huán)境科學(xué)等學(xué)科的科研工作者使用。


圖1多重LAMP檢測器原理圖。圖2多重LAMP檢測器原理框圖。圖3多重LAMP檢測器芯片結(jié)構(gòu)圖。圖中標(biāo)號1.檢測器主板；2.接口，與上位機通訊或檢測器之間通訊及儀器調(diào)試用；3.電源；4.顯示屏；5.操作面板/按鍵；6.光源及光電檢測器；7.光纖連接線；8.檢測芯片；9.反光鏡片；10.加熱板；11.進樣池；12.廢液池；13.泵/閥；14.液路
連接管。
具體實施例方式(I)儀器基本結(jié)構(gòu) 本發(fā)明的多重LAMP微流控芯片檢測器在結(jié)構(gòu)上主要包括電路、LAMP芯片、液路和光路四個部分(附圖1):電路部分是由電源3、主板1、顯示屏4、鍵盤/操作面板5及主板接口 2等部分構(gòu)成。電源3可采用市電供電或12V電池供電，主板I采用51系列(如C8051F340)或ARM系列(如STM32F106) MCU作為控制及數(shù)據(jù)采集芯片，采用片上集成A/D或前置信號放大器并轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號后輸入到MCU，如采用CS5532模塊或ADS1230模塊。主板接口 2的功能是與上位機通訊或檢測器之間通訊及儀器調(diào)試或數(shù)據(jù)存貯使用；液路部分是由進樣池11、廢液池12、泵/閥13和連接管道14構(gòu)成；LAMP芯片(可按現(xiàn)有技術(shù)制備)具有光纖和液路管道接口，內(nèi)有擴增池，擴增池內(nèi)包被針對目標(biāo)物的特異性探針，芯片內(nèi)的檢測通道數(shù)決定了光纖接口的數(shù)量，如三重、五重或十重通道分別外接3個、5個、10個檢測光纖。光路部分是由光源與光電檢測器6、連接光纖7及光反射鏡構(gòu)成。連接光纖7是由3根以上的多模光纖組成，具有傳導(dǎo)光源光和芯片光的雙重作用。附圖3示出了本發(fā)明的芯片與光纖及液體管路的連接方式。檢測器供電可使用市電或電池供電，實現(xiàn)便攜及現(xiàn)場檢測。(2)儀器操作流程
開機一自檢一泵閥復(fù)位一光源開啟及加熱器開啟并檢測至穩(wěn)定一顯示正常并等待鍵盤命令，如果檢測到上位機，則將控制權(quán)交由上位機。( 3 )樣品測試流程
安裝芯片8 —進樣泵/閥開啟一排液閥打開一進樣泵啟動一檢測光信號并顯示，如果有上位機，則向上位機傳送數(shù)據(jù)。上述的箭頭一表示流程的行進次序。(4)操作實例
下面結(jié)合具體實例對本發(fā)明做進一步描述，但具體實例并不對本發(fā)明做任何限定。實施例1甲型流感病毒(Flu A virus),季節(jié)性甲型流感病毒(Seasonal flu Avirus)和2009年豬源性甲型流感病毒(Pandemic flu A virus)快速分型檢測。將包被有三種流感病毒的特異性LAMP探針的芯片安裝到芯片架上，開機。注入4//L三種病毒標(biāo)準(zhǔn)品液和臨床參考品,然后注入46 P L LAMP擴增液,關(guān)閉進樣閥，反應(yīng)I小時。結(jié)果顯示三種標(biāo)準(zhǔn)品及相應(yīng)的擴增池中出現(xiàn)LAMP信號，陰性對照通道中不出現(xiàn)信號。實施例2八種重要豬病病毒的分型檢測。將包被有豬口蹄疫病毒(FMDV)，豬瘟病毒(CSFV)，豬藍耳病病毒(PRRSV)，豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)，豬偽狂犬病毒(PRV)，豬細小病毒(PPV)，豬圓環(huán)病毒(PCV)，豬流感病毒(SIV)八種重要豬病病毒的LAMP特異核酸探針的功能分型芯片安裝到芯片架上，開機。待光路與溫度穩(wěn)定后，注入樣品I (FMDV)，樣品2 (CSFV)，樣品3 (PRRSV)，樣品 4 (TGEV),樣品 5 (PRV)，樣品 6 (PPV)，樣品 7 (PCV)，樣品 8 (SIV)，樣品 9 (FMDV，CSFV)，樣品 10 (FMDV, CSFV, PRRSV)，樣品 11 (FMDV, CSFV, PRRSV, TGEV)，樣品 12 (FMDV,CSFV，PRRSV，TGEV，PRV)，樣品 13 (FMDV，CSFV，PRRSV，TGEV，PRV，PPV)，樣品 14 (FMDVjCSFV,PRRSV, TGEV, PRV, PPV, PCV)，樣品 15 (FMDV, CSFV, PRRSV, TGEV, PRV, PPV, PCV, SIV)，然后注入LAMP擴增液，封閉芯片，反應(yīng)I小時，檢測、顯示并存貯結(jié)果，排出廢液。實驗結(jié)果能很好地區(qū)分八種豬病病毒，也可 以判定出樣品中目標(biāo)病原體的類型。
權(quán)利要求
1.一種多重LAMP檢測器，其特征在于該檢測器由電路、LAMP芯片、液路和光路四個部分構(gòu)成；所述的電路部分控制液路和光路，并采集處理光路中的光電信號，控制液路中的泵閥開啟停止或關(guān)閉，所述的LAMP芯片通過光纖和液體管路與光路及液路連接。
2.如權(quán)利要求1所述的多重LAMP檢測器，其特征在于電路部分由電源(3)、主板(I)、 顯示屏(4)、鍵盤/操作面板(5)及主板接口(2)構(gòu)成；主板(I)采用51系列或ARM系列MCU 作為控制及數(shù)據(jù)采集芯片，采用片上集成A/D或采用前置信號放大器并轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號后輸入到MCU ;主板接口(2)的功能是與上位機通訊或檢測器之間通訊及儀器調(diào)試或數(shù)據(jù)存貯、打印使用。
3.如權(quán)利要求1所述的多重LAMP檢測器，其特征在于液路部分由進樣池(11)、廢液池(12)、泵/閥(13)和連接管道(14)構(gòu)成；樣品及檢測試劑均由進樣池(11)注入。
4.如權(quán)利要求1所述的多重LAMP檢測器，其特征在于LAMP芯片具有光纖和液路管道接口，內(nèi)有擴增池，擴增池內(nèi)包被針對目標(biāo)物的特異性探針，通過可更換LAMP芯片與被測液體進行接觸，保證儀器主體部分并不與被測液體進行接觸。
5.如權(quán)利要求1所述的多重LAMP檢測器，其特征在于光路部分由檢測用光源與光電檢測器(6)、連接光纖(7)及光反射鏡(8)構(gòu)成；連接光纖(7)由3根以上的多模光纖組成， 具有傳導(dǎo)光源光和芯片光的雙重作用，檢測光源采用激光器組件，包含波長為650nm的紅色可見二極管激光器；電源(3)經(jīng)過控制主板(I)與檢測光源的激光二極管相連；光電檢測器的光信號通過光電池檢測。
6.如權(quán)利要求1所述的多重LAMP檢測器，其特征在于所采用可更換LAMP芯片接口， 且接口具有可擴展性，可以根據(jù)實際需求更換不同數(shù)量檢測通道的芯片，芯片內(nèi)的檢測通道數(shù)決定了光纖接口的數(shù)量，實現(xiàn)任意多重的LAMP有效擴增及多重LAMP檢測信號的有效區(qū)分，為臨床多種病原體快速診斷提供一種有效手段。
7.如權(quán)利要求1所述的多重LAMP檢測器，其特征在于基本操作與測試流程開機一自檢一泵閥復(fù)位一光源開啟及加熱器開啟并檢測至穩(wěn)定一顯示正常并等待鍵盤命令，如果檢測到上位機，則將控制權(quán)交由上位機。
8.如權(quán)利要求1所述的多重LAMP檢測器，其特征在于基本測試流程安裝芯片(8)—進樣泵/閥開啟一排液閥打開一進樣泵啟動一檢測光信號并顯示并存貯打印，如果有上位機，則向上位機傳送數(shù)據(jù)。
全文摘要
本發(fā)明屬于核酸等溫擴增技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于多通道環(huán)介導(dǎo)核酸等溫擴增定量(LAMP)檢測器。本發(fā)明的檢測器以可更換LAMP芯片為核心，由檢測器控制主板、與上位機通訊或檢測器之間通訊及儀器調(diào)試用和檢測數(shù)據(jù)存貯打印用的主板接口、電源、顯示屏、操作面板/按鍵、光源及光電檢測器、光纖連接線、檢測芯片、反光鏡片、加熱板、進樣池、廢液池、泵/閥、液路連接管等組成。使用本檢測器可自動化快速定量檢測樣品中的特征核酸分子，具有靈敏度高、檢測速度快、特異性強、操作簡單、結(jié)果穩(wěn)定、自動給出測量結(jié)果等優(yōu)點。本發(fā)明適用于實驗研究、臨床檢測、食品安全檢測、藥物篩選等領(lǐng)域中的核酸檢測。
文檔編號C12M1/34GK103045469SQ20131001732
公開日2013年4月17日 申請日期2013年1月17日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月17日
發(fā)明者鮑軍波, 方雪恩, 孔繼烈 申請人:復(fù)旦大學(xué)