專利名稱：一種硫酸鹽還原菌的檢測方法
技術領域：
本發明涉及微生物檢測鑒定技術領域，尤其是涉及一種硫酸鹽還原菌的快速檢測方法。
背景技術：
硫酸鹽還 原菌(SRB)是一類能夠還原硫酸鹽的細菌的總稱，目前已發現18個屬約幾十種。雖然已經對SRB進行了大量研究，但目前對有些SRB的生理生長特性還沒有完全認識，對其培養方法也了解甚少。此外，某些SRB由于生長條件苛刻，培養難度較大，因此依賴培養的方式還無法對所有SRB進行系統的定量分析。研究表明，高溫環境中SRB主要以脫硫腸狀菌屬(Desulfotomaculum)為主。Desulfotomaculum為中溫型或高溫型，是直或彎的桿菌，大小為0.3^1.5 X 3飛μ m，端圓，一般單生，有時也呈鏈狀，能以周生鞭毛運動。其孢子呈卵圓形或球形，叢端生到次端生。孢子可以使細胞膨脹，一般為革蘭氏陰性。脫硫腸狀菌屬是有機化能營養型細菌，呼吸代謝過程中，可以利用硫酸鹽、亞硫酸鹽和還原性硫化物作為電子受體，并將硫元素還原為S2—。可以利用乳酸鹽和丙酮酸鹽為電子受體；一般不能利用碳水化合物和乙酸鹽。脫硫腸狀菌屬在含有還原性硫化物和有機生長因子的培養基內生長，一般將有機物氧化為醋酸鹽或其同系物，并生成二氧化碳。脫硫腸狀菌屬是嚴格厭氧型細菌，其生長的最適溫度為35 55°C，有些菌種的最高耐受溫度可達到70°C。嗜熱硫酸鹽還原菌一般生長在較深的地層水體中，對高熱環境中管道(如油田采油井油管和套管等)、金屬設施(泵)等的腐蝕有重要影響。特異性地對嗜熱硫酸鹽還原菌進行檢測可以了解高熱環境中硫酸鹽還原菌的發育情況，并可據此對腐蝕情況進行分析，以便采取適當的措施有效控制腐蝕。嗜熱脫硫腸狀菌Desulfotomaculum thermocisternum在高熱環境中普遍發育，是最具典型的硫酸鹽還原菌，快速檢測分析Desulfotomaculumthermocisternum在保障生產正常運行、延長高熱環境中金屬設施的使用壽命、保護地層環境等方面具有非常重要的現實意義。在硫酸鹽還原菌檢測分析方面，傳統技術主要包括以下3種方法:(1)直接鏡檢法；(2)液體培養方法(測試瓶法):將待測樣品進行梯度稀釋，利用硫酸鹽還原菌選擇性培養基培養不同稀釋度的待檢測樣品，獲得硫酸鹽還原菌培養液，根據培養液性狀結合最大概率數法(MPN法)確定細菌濃度；(3)固體培養方法:用硫酸鹽還原菌選擇性固體培養基篩選分離硫酸鹽還原菌，根據菌落數確定細菌濃度。待測樣品一般通過采集的方法獲得，其中包括多種微生物，單就硫酸鹽還原菌而言，也是多種多樣:既包括嗜熱硫酸鹽還原菌，也包括中低溫硫酸鹽還原菌；既包括可培養硫酸鹽還原菌，也包括不可培養硫酸鹽還原菌。同時，不同菌的豐度相差巨大。因此，按照前述的3種傳統方法檢測硫酸鹽還原菌存在如下缺陷:對于豐度低的硫酸鹽還原菌，可能出現漏檢；對于各種不同生理特性的硫酸鹽還原菌，往往因為培養條件不適而造成漏檢；檢測周期長、消耗大、工作量大；鏡檢等方法不能有效將硫酸鹽還原菌區分開而導致較大的測定誤差；對于嗜熱硫酸鹽還原菌和非嗜熱硫酸鹽還原菌不能有效地區分開，造成嗜熱菌檢測上的誤差；環境(如油藏)中孕育著豐富多樣的微生物，其中絕大多數嗜高溫硫酸鹽還原菌生長在較深的地層不易培養和分離，用傳統方法無法準確檢測到這些微生物，并及時了解較深地層管道的腐蝕情況。本發明采用特異性引物結合熒光定量PCR擴增目標DNA的方法，獲得環境樣品中嗜熱脫硫腸狀菌屬的相對含量，克服了傳統技術中培養及計數等方面的一系列缺陷。本發明方法特異性強，操作便捷、檢測準確。

發明內容
本發明的目的就是為了克服上述現有技術存在的缺陷而提供一種針對性強、操作快捷簡便的硫酸鹽還原菌檢測方法。本發明的目的可以通過以下技術方案來實現:提供一種檢測硫酸鹽還原菌的特異性引物對，其序列為:正向:GCGTAGATATCAGGAGGAACAC(SEQ ID N0:1)；反向:CACCTAGCACCCATCGTTTAT(SEQ ID NO: 2 )。 提供一種檢測硫酸鹽還原菌的方法，包括如下步驟:(I)提取待測樣品中微生物的DNA ；(2)采用上述特異性引物對正向:GCGTAGATATCAGGAGGAACAC(SEQ ID N0:1),反向:CACCTAGCACCCATCGTTTAT(SEQ ID NO: 2)，對嗜熱脫硫腸狀菌(Desulfotomaculum thermocisternum)標準樣品DNA和步驟
(I)獲得的待測樣品DNA進行熒光定量PCR擴增；(3)讀取熒光定量PCR擴增反應初始循環數，獲得環境樣品中嗜熱脫硫腸狀菌(Desulfotomaculum thermocisternum)的定量結果。本發明的硫酸鹽還原菌檢測方法中，提取嗜熱脫硫腸狀菌Desulfotomaculumthermocisternum標準樣品DNA和待測樣品DNA的方法按照Axygen公司的細菌組DNA提取試劑盒說明書進行(Axygen生物科技有限公司，美國)。所述的嗜熱脫硫腸狀菌Desulfotomaculum thermocisternum標準樣品DNA的系列溶液按以下方式制備:取純培養Desulfotomaculum thermocisternum樣品,測定細菌濃度后按10倍梯度稀釋，分別提取不同稀釋樣品的DNA。所述的嗜熱脫硫腸狀菌Desulfotomaculum thermocisternum標準樣品DNA,在針對不同待測樣品檢測時可重復使用。所述的熒光定量PCR擴增，反應體系組成如下:9.5 μ L無菌水、12.5 μ LUniversal SYBR Green Master Mix (普通SYBR綠色突光染料混合試劑，Bio-Rad生物科技有限公司，美國)和12.5 μ M的正向和反向引物各0.5 μ L、2 μ L標準樣品DNA或待測樣品DNA。待測樣品DNA的濃度控制在20至IOOng/ μ L。所用熒光定量PCR儀由Bio-Rad公司制造，型號為C1000 Thermal Cycler。所述的熒光定量PCR擴增，程序設置為:a)95° C保溫3min ;b)94° C保溫20s ;c)60° C保溫30s ；d)重復執行b) c) 39次；e)從65°C開始每5s增加0.5°C至達到95°C為止；f)讀取熒光定量PCR擴增反應初始循環數。由熒光定量PCR反應初始循環數及標準樣品細菌濃度和反應循環數對應關系，確定待測環境樣品中嗜熱脫硫腸狀菌(Desulfotomaculum thermocisternum)的濃度。附圖的簡要說明

圖1為初始循環數與嗜熱脫硫腸狀菌(Desulfotomaculum thermocisternum)細菌濃度關系的標準曲線。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明進行詳細說明。該實施例僅僅是對本發明的舉例說明，并不意味著對本發明范圍的限制。實施例我國華北油田某采油井產出液樣品中嗜熱脫硫腸狀菌Desulfotomaculumthermocisternum 的檢測1.硫酸鹽還原菌的特異性引物本發明設計的特異性引物(正向:GCGTAGATATCAGGAGGAACAC,反向=CACCTAGCACCCATCGTTTAT)。2.純培養嗜熱脫硫腸狀菌Desulfotomaculum thermocisternum,測定其細菌濃度為 2 X IO5 個/mL。3.系列稀釋純培養嗜熱脫硫腸狀菌(Desulfotomaculum thermocisternum)樣品，按照Axygen細菌基因組DNA提取試劑盒(Axygen生物科技有限公司，美國)說明書提取稀釋樣品嗜熱脫硫腸狀菌(Desulfotomaculum thermocisternum)的DNA,獲得對應不同細菌濃度的標準樣品DNA。4.按照Axygen細菌基因組DNA提取試劑盒(Axygen生物科技有限公司，美國)說明書提取待測樣品華北油田某采油井產出液中微生物的DNA。5.采用特異性引物(正向:GCGTAGATATCAGGAGGAACAC，反向:CACCTAGCACCCATCGTTTAT)對獲得的標準樣品DNA和待測樣品華北油田某采油井產出液中微生物的DNA進行熒光定量PCR擴增，反應體系和反應條件如下:1)熒光定量PCR擴增反應體系:熒光定量PCR擴增反應總體系為25 μ L，PCR擴增反應總體系的詳細組成包括:9.5 μ L無菌水，12.5 μ L Universal SYBR Green MasterMix (普通SYBR綠色熒光·染料混合試劑，Bio-Rad生物科技有限公司，美國)，12.5 μ M的正反向引物各0.5 μ L，2 μ L標準樣品DNA或待測樣品DNA。待測樣品DNA的濃度控制在20至IOOng/μ L02)熒光定量PCR擴增反應條件:熒光定量PCR儀使用Bio-Rad公司的ClOOOThermal Cycler。熒光定量PCR擴增程序設置為:a) 95° C保溫3min ;b) 94° C保溫20s ；c)60° C保溫30s ；d)重復執行b) c) 39次；e)從65°C開始每5s增加0.5°C至達到95°C為止；f)讀取PCR反應初始循環數。6.待測樣品中嗜熱脫硫腸狀菌(Desulfotomaculum thermocisternum)的定量分析表I為系列稀釋標準菌的數據。繪制標準菌的細菌濃度與初始循環數標準曲線見圖1，待測樣品華北油田某采油井產出液初始循環數及檢測結果見表2。表I標準樣品的熒光定量PCR擴增數據表
權利要求
1.種檢測硫酸鹽還原菌用的特異性引物對，其序列為:正向:GCGTAGATATCAGGAGGAACAC ； 反向:CACCTAGCACCCATCGTTTAT。
2.種檢測硫酸鹽還原菌的方法，包括如下步驟: (1)提取待測樣品中微生物的DNA； (2)采用權利要求1所述特異性引物對，對Desulfotomaculumthermocisternum標準樣品DNA和步驟(I)獲得的待測樣品DNA進行熒光定量PCR擴增； (3)讀取突光定量PCR擴增反應初始循環數，獲得環境樣品中Desulfotomaculumthermoci sternum 的定量結果。
3.權利要求2所述的檢測硫酸鹽還原菌的方法，其特征在于，其中所述Desulfotomaculum thermoci sternum標準樣品DNA的系列溶液按以下方式制備:取純培養Desulfotomaculum thermocisternum樣品,測定細菌濃度后按10倍梯度稀釋,分別提取不同稀釋樣品的DNA。
4.權利要求2所述的檢測硫酸鹽還原菌的方法，其中所述Desulfotomaculumthermocisternum標準樣品DNA在針對不同待測樣品檢測時可重復使用。
5.權利要求2所述的檢測硫酸鹽還原菌的方法，其中所述熒光定量PCR擴增的反應體系組成如下:9.5 μ L無菌水、12.5 μ L Universal SYBR Green Master Μ χ、12.5μΜ 的正向和反向引物各0.5 μ L、 2 μ L標準樣品DNA或待測樣品DNA。
6.權利要求2所述的檢測硫酸鹽還原菌的方法，其中所述熒光定量PCR擴增的程序設置為:a)95° C保溫3min ;b)94° C保溫20s;c)60° C保溫30s ;d)重復執行b) c) 39次；e)從65°C開始每5s增加0.5°C至達到95°C為止；f)讀取熒光定量PCR擴增反應初始循環數。
全文摘要
本發明提供一種檢測硫酸鹽還原菌的特異性引物對(正向GCGTAGATATCAGGAGGAACAC，反向CACCTAGCACCCATCGTTTAT)及使用該引物對檢測硫酸鹽還原菌的方法。采用該特異性引物對結合熒光定量PCR方法可對環境樣品中嗜熱脫硫腸狀菌(Desulfotomaculum thermocisternum)進行快速定量分析。本發明方法克服了傳統技術的缺陷，具有特異性強，操作便捷、檢測準確等特點。
文檔編號C12N15/11GK103088133SQ20131002234
公開日2013年5月8日 申請日期2013年1月22日 優先權日2013年1月22日
發明者牟伯中, 劉金峰, 楊世忠, 王立影, 管婧 申請人:華東理工大學