專利名稱：一種可同時識別OdDHL和BHL的核酸適體及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，具體涉及利用分子生物學技術篩選到一種可同時識別 N- (3-氧化十二燒酸基)-L-同型絲氛酸內酷[N- (3-oxododecanoyI) -L-homoserinelactone, OdDHL]和 N- 丁酸高絲氨酸內酯(N-butanoyl-L-homoserine lactone, BHL)的核酸適體及其應用，即一種可同時識別OdDHL和BHL的核酸適體及其應用。
背景技術：
:銅綠假單胞菌(Pseudomonase aeruginosa, PA)是臨床上最常見的一種非發酵革蘭氏陰性致病菌。它對臨床上應用的大部分抗生素都具有較強的耐藥性，而且其耐藥性的發展速度非常快，極易對新型抗生素產生耐藥性，這極大地影響了其感染的治療。研究表明，銅綠假單胞菌產生的各種嚴重感染與其毒力因子的釋放密切相關，而銅綠假單胞菌的絕大部分毒力因子的表達都受其群體效應系統(quorum sensing，QS)的正性調控。N-(3_氧化十二燒酰基)-L_同型絲氨酸內酯(N-(3-oxododecanoyl)-L-homoserine lactone, OdDHL)和 N-丁酸高絲氨酸內酯(N-butanoyl-L-homoserine lactone, BHL)分別是銅綠假單胞菌群體效應系統的Ias和rhl信號途徑的信號分子。銅綠假單胞菌在生長過程中，不斷向細胞外分泌這兩種信號分子。當細菌周圍環境中的信號分子濃度達到閾值時，便可激活這兩個信號途徑，從而啟動銅綠假單胞菌毒力基因的表達，增強銅綠假單胞菌的致病性。研究發現，干擾銅綠假單胞菌的群體效應系統可以抑制細菌毒力，降低其致病性，具有治療感染的作用。目前，國外已經報道了一類可以與OdDHL結合的鼠源性單克隆抗體，親和力在5nM 150nM之間。這類抗體在體外實驗中可結合OdDHL分子，干擾銅綠假單胞菌的QS系統的信號轉導，從而可抑制細菌毒力的表達。然而，這類抗體雖然具有治療銅綠假單胞菌感染的潛在價值，但是這種抗體只能結合OdDHL和BHL兩種分子中的一種，不能完全阻斷PA的QS系統的激活，因而阻斷PA毒力的表達的效果有限。此外，由于鼠源性抗體對人類來說是一種異種蛋白，如果直接將OdDHL的鼠源性單克隆抗體應用于人體的治療，人體可產生針對鼠抗的抗體(人抗鼠反應)，從而與抗體結合并清除鼠抗，降低其的療效。而且，直接應用鼠源性抗體還可能會誘發過敏反應，對患者造成損傷。由此，鼠源性抗體需要通過人源化改造后才能應用于人體，但是，鼠源性抗體的人源化改造是一個復雜、費時的過程，對技術要求相當高，而且在改造過程中容易導致抗體親和力降低，甚至完全喪失，這導致鼠源性抗體應用于治療的開發逐漸被放棄。與抗體相比，核酸適體是通過體外篩選技術SELEX(指數富集配體系統進化)從DNA/RNA文庫中篩選出來的能特異結合蛋白質或其他小分子物質的單鏈寡聚核苷酸片段(ssDNA或ssRNA)，它具有高特異性和親和力識別其靶標分子，一些與疾病密切相關的生長因子、酶、受體等物質均能成為核酸適體的靶標，而且其化學性質穩定，因此，亟需要研究和發展能夠特異性抑制銅綠假單胞菌毒性的核酸適體，從而為疾病治療的臨床應用奠定基礎。
發明內容:本發明的目的在于提供一種可同時識別OdDHL和BHL的核酸適體及其應用，它能夠解決現有技術的不足，提供一種易于制備、節約成本、安全性好的能夠與OdDHL和BHL均發生高親和力和高特異性結合的核酸適體，以及上述核酸適體在制備抑制銅綠假單胞菌毒性的試劑中的應用。本發明的技術方案:一種可同時識別OdDHL和BHL的核酸適體，其特征在于:所述核酸適體的核苷酸序列為 GCAATGGTACGGTACTTCCTGTGGGTTAGTTTGACTCAAGGCTGGGCTTATACAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA。所述核酸適體的應用，其特征在于:用于干擾銅綠假單胞菌的群體效應系統的Ias和rhl信號途徑，抑制群體效應系統調控的毒素分泌以及生物膜的形成，抗銅綠假單胞菌感染。 所述核酸適體的篩選方法，其特征在于它由以下步驟構成:1、OdDHL類似物與載體的偶聯:OdDHL類似物與EDC分別溶于預冷的MES緩沖液中，配制成濃度均為20mg/ml的溶液。用MES緩沖液充分洗滌氨基化納米磁顆粒，然后加入等體積的上述兩種溶液，20°C反應2h。在此條件下，OdDHL類似物通過其分子中的羧基與氨基化納米磁顆粒表面的氨基發生縮合反應，使分子偶聯到氨基化納米磁顆粒的表面；偶聯結束后，用Tris-HCl緩沖液充分洗滌去除EDC及未偶聯的OdDHL類似物后，獲得的偶聯有OdDHL類似物的氨基化納米磁顆粒備用；2、隨機單鏈DNA文庫的設計:隨機單鏈DNA文庫是兩端為固定的引物序列、中間為35個堿基的隨機序列:5 ’ -GCAATGGTACGGTACTTCC- (N35) -CAAAGTGCACGCTACTTCGTAA -3 ’，其中，N35 表示 35 個隨機核苷酸；3、核酸適體的篩選:3.1核酸適體與OdDHL類似物結合:3.1.1隨機單鏈DNA文庫的預處理:將步驟2設計的隨機單鏈DNA文庫于95°C變性5min后立即置于冰中lOmin，然后用選擇緩沖液稀釋至所需體積；3.1.2隨機單鏈DNA文庫中單鏈DNA與OdDHL類似物的結合:將經過預處理后的隨機單鏈DNA文庫與選擇緩沖液(含pH7.4的50 mmol/LTris-HCl 含 1% BSA、0.01% 鮭魚精 DNA、100 mmol/L NaClU mmol/L MgCl2,5 mmol/L KCl和0.05% Tween 20 )混合后，加入到步驟I獲得的偶聯有OdDHL類似物的氨基化納米磁顆粒中，并于37°C緩慢顛倒混合溫育45min,在磁力架上靜置5min,再用洗漆緩沖液連續洗滌10次，去除未與靶分子結合及結合不牢固的單鏈DNA ；3.2 OdDHL 競爭篩選:向結合有核酸適體的納米磁性顆粒中加入20mg/ml的OdDHL溶液，使OdDHL與OdDHL類似物競爭性結合核酸適體，與OdDHL結合的核酸適體即進入溶液中；3.3單鏈DNA的制備:取步驟3.2所得的溶液作為PCR模版，用第一引物和生物素標記的第二引物進行PCR擴增，擴增產物用PCR產物純化試劑盒進行回收，然后加入到鏈親和素磁納米磁顆粒中，室溫下溫育30min后，上磁力架，去掉上清，向鏈親和素納米磁顆粒中加入200mol/L的氫氧化鈉溶液，使目的單鏈DNA脫離納米磁顆粒；然后在磁力架上靜置后，取上清，用200mmol/L的鹽酸調節pH值至6.8-7.2，所獲得的單鏈DNA即可用于下一輪篩選；3.4核酸適體與OdDHL類似物結合:將步驟3.3所獲得的核酸適體按照步驟3.1.2中所述方法與OdDHL類似物結合，并進行洗滌；3.5 BHL 競爭篩選:3.5.1向步驟3.4中結合有核酸適體的納米磁性顆粒中加入20mg/ml的BHL溶液，使BHL與OdDHL類似物競爭性結合核酸適體，與BHL結合的核酸適體即進入溶液中；3.5.2單鏈DNA的制備方法同3.3:3.5.3將所得ssDNA按照步驟3.1-3.3進行下一輪篩選；3.6反向篩選:為了除去文庫中可能存在的與氨基化磁珠本身結合的核酸適體，在每兩輪正向篩選之間，進行一次反向篩選:將經過篩選后獲得的單鏈DNA加入到未與OdDHL類似物偶聯的氨基化納米磁顆粒中，于37°C緩慢顛倒混合溫育45min,使氨基化納米磁顆粒與核酸適體充分結合，然后在磁力架上靜置后，取上清，用上清進行下一輪篩選；3.7克隆測序:經過上述多輪篩選后，將篩選所獲的PCR產物，克隆入T-A克隆載體，轉化大腸桿菌DH5 α，取陽性克隆進行測序，制備核酸適體單鏈DNA并檢測親和力，最終獲得核酸適體。本發明的優點和有益效果:1、本發明采用SELEX技術篩選到一種能夠與OdDHL和BHL高親和力結合的核酸適體，該核酸適體能同時結合OdDHL和BHL，因而具有高效干擾銅綠假單胞菌的群體效應系統，抑制銅綠假單胞菌毒力基因的表達的作用。由于干擾細菌群體效應系統并不具有殺菌或者抑菌的作用，不對細菌的生長產生選擇壓力，因此，本發明的核酸適體既具有抗銅綠假單胞菌感染的潛力，又不存在誘發耐藥性的風險。2、核酸適體僅需要通過簡單的PCR技術即可大量制備，與抗體相比，核酸適體的生產過程更加簡單，成本更低，無明顯的毒性及過敏源性，而且核酸適體是一種DNA分子或者經過修飾后的RNA，其理化性質相當穩定，無需特殊條件即可以穩定保存。另一方面，單克隆抗體的分子量為160KD,而核酸適體的分子量介于4.95KD-29KD之間，在相同質量的情況下，核酸適體捕獲的靶分子較抗體多，治療效果可能會更好，到目前為止，尚未發現核酸適體具有明顯的毒性或過敏源性，因而，本發明的核酸適體完全可以替代抗體，可用于制備抑制銅綠假單胞菌毒性的試劑，其具有極佳的臨床治療應用前景。


:圖1為OdDHLS的核磁共振氫譜圖。圖2為OdDHLS的核磁共振碳譜圖。圖3為OdDHLS在MES緩沖液(ρΗ5.0)中的穩定性。

圖4為OdDHLS在Tris-HCl緩沖液(ρΗ7.4)中的穩定性。
圖5為SPR檢測核酸適體與OdDHLS的親和力。圖6為熒光競爭法檢測核酸適體對OdDHL (A)和BHL (B)親和力。圖7為核酸適體抑制LasB毒素分泌的作用。
具體實施方式
:以下通過實施例對本發明進行進一步描述。下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。實施例:一種可同時識別N-(3_氧化十二烷酰基)-L-同型絲氨酸內酯(N-(3-oxododecanoyl)-L-homoserine lactone, OdDHL)和 N- 丁酸高絲氨酸內酯(N-butanoyl-L-homoserine lactone, BHL)的核酸適體的核苷酸序列為:GCAATGGTACGGTACTTCCTGTGGGTTAGTTTGACTCAAGGCTGGGCTTATACAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA (SEQ ID NO:1)。所述核酸適體的篩選方法:1.主要試劑及緩沖液:1.1 OdDHL 類似物(OdDHL surrogates, OdDHLS)本發明選用的OdDHLS 為:7-oxo_7-[[(3S)-2-oxo-3-pyrrolidinyl]amino]-Heptanoic acid，是由上海科勝藥物研發有限公司合成。OdDHL和BHL購自sigma-aIdrich。OdDHLS 的化學式如下:
權利要求
1.一種可同時識別OdDHL和BHL的核酸適體，其特征在于:所述核酸適體的核苷酸序列為 GCAATGGTACGGTACTTCCTGTGGGTTAGTTTGACTCAAGGCTGGGCTTATACAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA。
2.—種權利要求1所述可同時識別OdDHL和BHL的核酸適體，其特征在于:它用于干擾銅綠假單胞菌的群體效應系統的Ias和rhl信號途徑，抑制群體效應系統調控的毒素分泌以及生物膜 的形成，抗銅綠假單胞菌感染。
全文摘要
本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種可同時識別OdDHL和BHL的核酸適體及其應用。OdDHL和BHL分別是銅綠假單胞菌群體效應系統的las和rhl信號途徑的信號分子，這兩個信號途徑的激活可啟動銅綠假單胞菌毒力基因的表達。本發明采用競爭法篩選出一種可高親和力結合OdDHL和 BHL的核酸適體。該核酸適體具有干擾銅綠假單胞菌的群體效應系統，抑制銅綠假單胞菌毒力基因的表達的潛力。本發明的核酸適體與OdDHL和BHL結合的親和力與抗體相當，而且制備過程更加簡單、更易于操作，且成本更低。
文檔編號C12N15/115GK103173452SQ20131002497
公開日2013年6月26日 申請日期2013年1月23日 優先權日2013年1月23日
發明者趙祖國, 吳淑慶, 楊在明 申請人:國家納米技術與工程研究院