專利名稱：一種蘇丹草胚接種轉(zhuǎn)基因技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種蘇丹草胚接種轉(zhuǎn)基因技術(shù)涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中的植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)。
背景技術(shù)：
蘇丹草轉(zhuǎn)基因技術(shù)是采用生物技術(shù)方法改造蘇丹草品種，培育具有高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗蟲、抗病等優(yōu)良特性新品種的最為有效的技術(shù)手段。目前蘇丹草的轉(zhuǎn)基因一般都采用農(nóng)桿菌侵染愈傷的方法，該方法先要進(jìn)行愈傷誘導(dǎo)，然后農(nóng)桿菌侵染，再用組織培養(yǎng)的方法獲得轉(zhuǎn)基因苗。由于蘇丹草組織培養(yǎng)難度較大，因此該方法的效率較低，應(yīng)用困難。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是采用一種新的技術(shù)路線進(jìn)行蘇丹草轉(zhuǎn)基因的接種處理，以期達(dá)到方法易行，操作簡(jiǎn)單，費(fèi)用低廉，效果良好的技術(shù)效果。本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的:1.一種蘇丹草胚接種轉(zhuǎn)基因技術(shù)包括接種液接種和暗箱培養(yǎng)，其特征在于，以蘇丹草種子為載體，進(jìn)行刺胚接種加接種液反復(fù)真空浸泡、充分接種。它包括①制備雙元載體接種液、②蘇丹草種子消毒、③無菌水浸種、④刺胚接種、⑤接種液抽真空浸種、⑥暗箱培養(yǎng)、⑦育苗栽培7個(gè)步驟。2.上述7個(gè)步驟的具體實(shí)施過程如下:
①制備雙元載體接種液:將已經(jīng)轉(zhuǎn)入雙元載體的農(nóng)桿菌接種到100mL的YEP液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)2天(培養(yǎng)基中加入100 μ L的潮霉素和利福平)，培養(yǎng)溫度為28°C。②蘇丹草種子消毒:選取飽滿的蘇丹草種子先后用乙醇和84消毒液消毒，消毒結(jié)束后用滅菌水洗凈種子。③無菌水浸種:將種子轉(zhuǎn)入滅菌水中28°C浸泡2-24小時(shí),使種子充分吸脹。④刺胚接種:將吸脹的種子取出置于已滅菌的培養(yǎng)皿中，用已消毒的鋼針蘸取OD600為0.6的農(nóng)桿菌接種液扎刺胚芽，深度大約為1mm。⑤接種液抽真空浸種:將刺完的種子放在含有200 μ mol /L乙酰丁香酮的農(nóng)桿菌接種液中抽真空(-0.1MPa)浸種30min，恢復(fù)常壓后再抽真空(-0.1MPa)浸種5min。⑥暗箱培養(yǎng):將種子置于發(fā)芽盒中，22°C恒溫培養(yǎng)箱暗濕潤培養(yǎng)4天。⑦育苗和鑒定:將培養(yǎng)后的種子單粒播到營養(yǎng)缽中，置于合適的溫度生長，3葉期即可進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植株的鑒定。本發(fā)明的有益效果:一種蘇丹草胚接種轉(zhuǎn)基因技術(shù)避開了傳統(tǒng)的農(nóng)桿菌侵染愈傷后再組織培養(yǎng)的技術(shù)路線，與現(xiàn)有方法相比有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn):第一，所需時(shí)間減少2個(gè)月左右，農(nóng)桿菌浸染法從愈傷誘導(dǎo)到獲得轉(zhuǎn)基因植株一般需要3-4個(gè)月，本方法從接種開始到鑒定完成僅需1個(gè)月；第二，本方法對(duì)技術(shù)要求不高，而蘇丹草組織培養(yǎng)難度大，愈傷易褐化，因此對(duì)實(shí)驗(yàn)者的技術(shù)和實(shí)驗(yàn)的條件要求高，而本方法不涉及組織培養(yǎng)過程，因此大大降低了技術(shù)難度和實(shí)驗(yàn)條件；第三，本方法所需費(fèi)用較少，現(xiàn)有的轉(zhuǎn)基因技術(shù)需要借助植物組織培養(yǎng)技術(shù)，而組織培養(yǎng)的各種試劑較貴，而且需要建立組培室并配備大量的儀器設(shè)備才能開展工作，而本發(fā)明免除了這部分的花費(fèi)，節(jié)約了大量資金。
具體實(shí)施方式
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下面結(jié)合具體實(shí)例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的描述。實(shí)施例1:將S1305GFP載體轉(zhuǎn)入到蘇丹草Sa植株中
①制備雙元載體接種液:將已經(jīng)轉(zhuǎn)入S1305GFP基因的雙元載體的農(nóng)桿菌接種到IOOmL的YEP液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)2天(培養(yǎng)基中加入100 μ L的潮霉素和利福平)，培養(yǎng)溫度為28。。。②蘇丹草種子消毒:選取400粒飽滿的蘇丹草Sa首先用70%乙醇消毒3min，然后用84消毒液消毒40min，消毒結(jié)束后用滅菌水漂洗4次，洗凈種子。③無菌水浸種:將種子轉(zhuǎn)入滅菌水中30°C浸泡24小時(shí),使種子充分吸脹。④刺胚接種:將吸脹的種子取出置于已滅菌的培養(yǎng)皿中，用已消毒的鋼針蘸取OD600為0.6的農(nóng)桿菌接種液扎刺胚芽，深度大約1mm。⑤接種液抽真空浸種:將刺完的種子放在含有200ymol/L乙酰丁香酮的農(nóng)桿菌接種液中抽真空(-0.1MPa)浸種30min，恢復(fù)常壓后再抽真空(-0.1MPa)浸種5min。⑥暗箱培養(yǎng):將處理好的N108種子置于發(fā)芽盒中，22°C恒溫培養(yǎng)箱暗濕潤培養(yǎng)4天。⑦育苗和鑒定:將培養(yǎng)后的種子單粒播到營養(yǎng)缽中，置于22°C下生長，3葉期進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植株的鑒定。經(jīng)鑒定，通過以上 步驟在23株Sa幼苗中獲取了 2株轉(zhuǎn)基因植株。歷時(shí)8天，比現(xiàn)有的轉(zhuǎn)基因技術(shù)減少80天左右。
權(quán)利要求
1.一種蘇丹草胚接種轉(zhuǎn)基因技術(shù)包括接種液接種和暗箱培養(yǎng)，其特征在于，以蘇丹草種子為載體，進(jìn)行刺胚接種加接種液反復(fù)真空浸泡、充分接種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，其特征在于它包括①制備雙元載體接種液、②蘇丹草種子消毒、③無菌水浸種、④刺胚接種、⑤接種液抽真空浸種、⑥暗箱培養(yǎng)、⑦育苗栽培7個(gè)步驟。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，其特征在于所述的制備雙元載體接種液的做法是:將已經(jīng)轉(zhuǎn)入雙元載體的農(nóng)桿菌接種到IOOmL的YEP液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)2天，培養(yǎng)溫度為28℃。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，其特征在于所述的蘇丹草種子消毒的做法是:選取飽滿的蘇丹草種子先后用乙醇和84消毒液消毒，消毒結(jié)束后用滅菌水洗凈種子。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，其特征在于所述的無菌水浸種的做法是:將種子轉(zhuǎn)入滅菌水中28°C浸泡2-24小時(shí)，使種子充分吸脹。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，其特征在于所述的刺胚接種的做法是:將吸脹的種子取出置于已滅菌的培養(yǎng)皿中，用已消毒的鋼針蘸取OD60為0.6的農(nóng)桿菌接種液扎刺胚芽，深度大約為1mm。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，其特征在于所述的接種液抽真空浸種的做法是:將刺完的種子放在含有200 μ mo I/L乙酰丁香酮的農(nóng)桿菌接種液中抽真空到-0.1MPa浸種30min，恢復(fù)常壓后再抽真空到-0.1MPa浸種5min。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，其特征在于所述的暗箱培養(yǎng)的做法是:將種子置于發(fā)芽盒中，22°C恒溫培養(yǎng)箱暗濕潤培養(yǎng)4天。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，其特征在于所述的育苗和鑒定的做法是:將培養(yǎng)后的種子單粒播到營養(yǎng)缽中，置于合適的溫度生長，在出現(xiàn)3片葉時(shí)即可進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植株的鑒定。
全文摘要
一種蘇丹草胚接種轉(zhuǎn)基因技術(shù)，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。將蘇丹草種子消毒后充分吸水，用鋼針扎刺種胚接種攜帶雙元載體的農(nóng)桿菌，后將種子放在接種液中抽真空浸泡并2次，充分侵染，再對(duì)種子進(jìn)行暗箱培養(yǎng)，促進(jìn)農(nóng)桿菌侵染并在體內(nèi)大量增殖擴(kuò)散，再在適宜的條件下育苗，3葉期后進(jìn)行轉(zhuǎn)基因鑒定。本方法簡(jiǎn)便，操作容易，費(fèi)用低廉。
文檔編號(hào)C12N15/82GK103074367SQ20131002924
公開日2013年5月1日 申請(qǐng)日期2013年1月27日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月27日
發(fā)明者李杰勤, 王麗華, 詹秋文, 趙庭, 周青, 萬海波, 王茂輝 申請(qǐng)人:安徽科技學(xué)院