專利名稱：快速高效篩選高產5-氨基乙酰丙酸突變菌株的方法
技術領域：
本發明屬于與生物工程領域，尤其是一種可保證篩選準確度、減少篩選工作量，提高篩選效率的快速高效篩選高產5-氨基乙酰丙酸突變菌株的方法。
背景技術：
5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid,簡稱ALA)又名S-氨基乙酰丙酸、S-氨基戊酮酸，其用途非常廣泛，已應用于農業和醫學等領域。如作為光活化綠色無公害的除草劑、殺蟲劑、抗微生物藥劑和植物生長促進劑而應用于農業領域；在醫學上已被應用于癌癥的光動力學治療和診斷上，另外，還可作為治療痤瘡的外用藥及生發劑。Nishikawa等以NTG (亞硝基胍，CH4N4O)重復誘變紅假單胞菌屬的類球紅細菌( o而如cter
而s)并通過對類球紅細菌生長條件的控制，增大了 5-氨基乙酰丙酸的產量；日本科莫斯石油公司也是利用變異的類球紅細菌iRhodebacter sphaeroides、來制取5_氨基乙酰丙酸，極大的提高了產量。提高5-氨基乙酰丙酸產量的關鍵是對高產5-氨基乙酰丙酸突變菌株的篩選，現有的篩選方法是通過搖瓶培養菌株后進行篩選，但由于誘變育種的盲目性及誘變產生的優良生產性狀不易保持，增大了誘變育種篩選的難度，使得篩選工作量大，篩選效率低?！?br>
發明內容
本發明是為了解決現有技術所存在的上述技術問題，提供一種可保證篩選準確度、減少篩選工作量，提高篩選效率的快速高效篩選高產5-氨基乙酰丙酸突變菌株的方法。本發明的技術解決方案是:一種快速高效篩選高產5-氨基乙酰丙酸突變菌株的方法，依次按照如下步驟進行:
a.將經過誘變處理的用以生產5-氨基乙酰丙酸的類球紅細菌IRhodobactersphaeroides^ (CICC No: 10278)用生理鹽水洗滌，液體培養基重懸，32°C培養后稀釋制成IO3^lO4個/ml的菌懸液，涂平板培養至生成菌落；
b.挑取菌落大而光澤鮮亮的單菌落接種于深孔板各孔中的液體培養基中培養36 48h，然后再向液體培養基中加入甘氨酸、琥珀酸和乙酰丙酸，加入量分別為甘氨酸15 45mmol/L,琥拍酸20 40 mmol/L,乙酰丙酸30 60mmol/L,繼續培養24h ;所述液體培養基為每升水中含有:葡萄糖9.0g,谷氨酸鈉3.Sg,磷酸氫二鉀0.5g，磷酸二氫鉀0.5g，硫酸銨0.8g，硫酸鎂0.2g，氯化鈣0.053g,硫酸錳1.2X 10_3g，尼克酸1.0X 10_3g，VB1 1.0X 10_3g，酵母膏2.0g,生物素1.0X 10_5g ;所述培養是在恒溫微孔快速振蕩器上，30 32°C，黑暗，振蕩15(Tl80r/min培養；
c.向每孔中加入0.1mlIM的醋酸鹽緩沖液和乙酰丙酮，乙酰丙酮在醋酸緩沖液中的質量濃度為1%，然后密封孔板，100°C水浴15min，再置于冰上冷卻，冷卻之后加入Ehrlich顯色劑，室溫15min后檢測各孔菌液553nm分光光度值，數值最大的菌液為高產5-氨基乙酰丙酸突變菌株。本發明操作簡單，不僅篩選準確度高于現有技術，而且縮短了篩選周期，保留了突變菌株的突變性狀，可減少篩選工作量，提高篩選效率，可以應用于高通量、大規模篩選高產5-氨基乙酰丙酸突變菌株。
圖1為本發明實施例1的96深孔板篩選直方圖。
具體實施例方式實施例1:
a.將經過物理或(和)化學誘變處理(處理方法同現有技術)的用以生產5-氨基乙酰丙酸的類球紅細菌如cter sphaeroides^ (CICC No: 10278)用生理鹽水洗滌，液體培養基重懸，32°C培養后稀釋制成IO4個/ml的菌懸液，涂平板靜置培養，31°C黑暗培養4天，平板上生成菌落； b.挑取菌落大而光澤鮮亮的單菌落接種于96深孔板的96個孔中的液體培養基中培養40h，然后再向液體培養基中加入甘氨酸、琥珀酸和乙酰丙酸，每升培養基中加入量為甘氨酸30mmol,琥拍酸30 mmol,乙酰丙酸45mmol,繼續培養24h ;所述液體培養基為每升水中含有:葡萄糖9.0g,谷氨酸鈉3.Sg,磷酸氫二鉀0.5g，磷酸二氫鉀0.5g，硫酸銨0.Sg,硫酸鎂 0.2g，氯化鈣 0.053g，硫酸錳 1.2X10_3g，尼克酸 1.0X10_3g，VB1 1.0Xl(T3g，酵母膏2.0g，生物素1.0X10_5g ;所述培養的條件是在恒溫微孔快速振蕩器上，32°C，黑暗，振蕩170r/min 培養；
c.向每孔中加入0.1mlIM的醋酸鹽緩沖液和乙酰丙酮，乙酰丙酮在醋酸緩沖液中的質量濃度為1%，然后密封96孔板，100°C水浴15min,再置于冰上冷卻，冷卻之后加入Ehrlich顯色劑，室溫15min后檢測各孔菌液553nm分光光度值，數值最大的菌液為高產5-氨基乙酰丙酸突變菌株。實施例2:
a.將經過物理或(和)化學誘變處理(現有技術)的用以生產5-氨基乙酰丙酸的類球紅細菌如cter sphaeroides^ (CICC No: 10278)用生理鹽水洗滌，液體培養基重懸，32°C培養后稀釋制成IO3個/ml的菌懸液，涂平板靜置培養，32°C黑暗培養4天，平板上生成菌落；
b.挑取菌落大而光澤鮮亮的單菌落接種于96深孔板的96孔中的液體培養基中培養48h，然后再向液體培養基中加入甘氨酸、琥珀酸和乙酰丙酸，加入量為甘氨酸15mmol/L，琥拍酸20 mmol/L,乙酰丙酸30mmol/L,繼續培養24h ;所述液體培養基為每升水中含有:葡萄糖9.0g,谷氨酸鈉3.8g,磷酸氫二鉀0.5g,磷酸二氫鉀0.5g,硫酸銨0.8g,硫酸鎂0.2g,氯化鈣0.053g,硫酸錳1.2X 10_3g，尼克酸1.0X 10_3g，VB1 1.0X 10_3g，酵母膏2.0g,生物素1.0X 10_5g ;所述培養的條件是在恒溫微孔快速振蕩器上，32°C，黑暗，振蕩180r/min培養；
c.向每孔中加入0.1mlIM的醋酸鹽緩沖液和乙酰丙酮，乙酰丙酮在醋酸緩沖液中的質量濃度為1%，然后密封96孔板，100°C水浴15min,再置于冰上冷卻，冷卻之后加入Ehrlich顯色劑，室溫15min后檢測各孔菌液553nm分光光度值，數值最大的菌液為高產5-氨基乙酰丙酸突變菌株。實施例3:
a.將經過物理或(和)化學誘變處理(現有技術)的用以生產5-氨基乙酰丙酸的類球紅細菌GWotZo如cter sphaeroides^ (CICC No: 10278)用生理鹽水洗滌，液體培養基重懸，31°C培養后稀釋制成IO4個/ml的菌懸液，涂平板靜置培養，32°C黑暗培養4天，平板上生成菌落；
b.挑取菌落大而光澤鮮亮的單菌落接種于96深孔板96孔中的液體培養基中培養36h，然后再向液體培養基中加入甘氨酸、琥珀酸和乙酰丙酸，加入量為甘氨酸45mmol/L，琥拍酸40 mmol/L,乙酰丙酸60mmol/L,繼續培養24h ;所述液體培養基為每升水中含有:葡萄糖9.0g,谷氨酸鈉3.8g,磷酸氫二鉀0.5g,磷酸二氫鉀0.5g,硫酸銨0.8g,硫酸鎂0.2g,氯化鈣0.053g,硫酸錳1.2X 10_3g，尼克酸1.0X 10_3g，VB1 1.0X 10_3g，酵母膏2.0g,生物素
1.0X 10_5g ;所述培養的條件是在恒溫微孔快速振蕩器上，30°C，黑暗，振蕩150r/min培養；
c.向每孔中加入0.1ml IM的醋酸鹽緩沖液和乙酰丙酮，乙酰丙酮在醋酸緩沖液中的體積濃度為1%，然后密封96孔板，100°C水浴15min,再置于冰上冷卻，冷卻之后加入Ehrlich顯色劑，室溫15min后檢測各孔菌液553nm分光光度值，數值最大的菌液為高產5-氨基乙酰丙酸突變菌株。Ehrlich顯色劑為現有技術，即2%的對-二甲氨基苯甲醛的醋酸溶液和0.1ml質量濃度16%的高氯酸。本發明實施例1的96深孔板篩選直方圖如圖1所示，從圖1中可以看出，G12菌液的553nm分光光度值為0.340，為96孔菌液中的最大值。將96孔中菌液配制成相同濃度，按照現有技術方法生產5-氨基乙酰丙酸，結果表明G12菌液所生產ALA濃度為33.1 mg/L,為高產5-氨基乙酰丙酸誘變菌株。以G組為例，G組的12株菌液試驗如表1:
表I G組12株菌產5-氨基乙酰丙酸的濃度(單位:mg/L)
權利要求
1.一種快速高效篩選高產5-氨基乙酰丙酸突變菌株的方法，依次按照如下步驟進行: a.將經過誘變處理的用以生產5-氨基乙酰丙酸的類球紅細菌iRhodobactersphaeroides) (CICC No: 10278)用生理鹽水洗滌，液體培養基重懸，32°C培養后稀釋制成IO3^lO4個/ml的菌懸液，涂平板培養至生成菌落； b.挑取菌落大而光澤鮮亮的單菌落接種于深孔板各孔中的液體培養基中培養·36 48h，然后再向液體培養基中加入甘氨酸、琥珀酸和乙酰丙酸，加入量分別為甘氨酸·15 45mmol/L,琥拍酸20 40 mmol/L,乙酰丙酸30 60mmol/L,繼續培養24h ;所述液體培養基為每升水中含有:葡萄糖9.0g,谷氨酸鈉3.Sg,磷酸氫二鉀0.5g，磷酸二氫鉀·0.5g，硫酸銨0.8g，硫酸鎂0.2g，氯化鈣0.053g,硫酸錳1.2X 10_3g，尼克酸1.0X 10_3g，VB1 1.0X 10_3g，酵母膏2.0g,生物素1.0X 10_5g ;所述培養是在恒溫微孔快速振蕩器上，·30 32°C，黑暗，振蕩15(Tl80r/min培養； c.向每孔中加入0.1mlIM的醋酸鹽緩沖液和乙酰丙酮，乙酰丙酮在醋酸緩沖液中的質量濃度為1%，然后密封孔板，100°C水浴15min，再置于冰上冷卻，冷卻之后加入Ehrlich顯色劑，室溫15min后檢測各孔菌液553nm分光光度值，數值最大的菌液為高產5-氨基乙酰丙酸突變菌株?！ぁ?br>
全文摘要
本發明公開一種可保證篩選準確度、減少篩選工作量，提高篩選效率的快速高效篩選高產5-氨基乙酰丙酸突變菌株的方法，是將一株類球紅細菌通過物理或化學方法誘變處理后，無菌生理鹽水洗滌，液體培養基重懸，32℃培養后，稀釋菌懸液涂平板；從平板上挑單個菌落到無菌的96孔深孔板的對應孔中，32℃，黑暗，振蕩培養48h，加前體和琥珀酸，再培養24h；ALA微量顯色法(深孔板法)檢測各孔菌液553nm分光光度值，數值最大的菌液為高產5-氨基乙酰丙酸突變菌株。
文檔編號C12N15/01GK103232993SQ20131003091
公開日2013年8月7日 申請日期2013年1月28日 優先權日2013年1月28日
發明者莊國宏, 宋濤, 張琪 申請人:大連三儀動物藥品有限公司