專利名稱：一種用精液蛋白基因檢測昆蟲卵孵化率的方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種用精液蛋白基因檢測昆蟲卵孵化率的方法。
背景技術：
害蟲生物防治在農林業可持續發展中發揮著不可替代的重要作用。天敵昆蟲的大量生產更是生物防治中最基礎也是最重要的環節。捕食性天敵昆蟲躅蝽(Armachinensis)可以控制來自鱗翅目、鞘翅目、半翅目、同翅目、膜翅目等多種農林害蟲，尤其是它還可以控制重大外來入侵害蟲馬鈴薯甲蟲和美國白蛾，因此躅蝽是一種應用前景很好的天敵昆蟲商品。作為商品，大量減少生產成本是人們追求利潤最大化的一個途徑。在天敵昆蟲躅蝽生產中就可以應用不同的食物來生產躅蝽，例如，不同的昆蟲獵物、含昆蟲成分的人工飼料和不含昆蟲成分的人工飼料，進而減少生產成本。但是應用不同的食物生產出來的躅蝽的生物學特性參差不齊，有些釋放后能達到很好的控制害蟲的作用，有的則在釋放后效果不顯著。由于不同食物飼喂的躅蝽在表型上很難區分，因此這些天敵昆蟲在釋放前是很難評估它們的生物學特性的。躅蝽成蟲的卵孵化率是評價天敵昆蟲生物學特性的一個很重要的指標。有較高卵孵化率的躅蝽種群繁殖快，倍增時間短，可以在短期內迅速控制住害蟲。這可以大大減少防治害蟲的成本，增加利潤率。相反，卵孵化率較低的躅蝽由于卵孵化少、繁殖慢，倍增時間延長，因此控制住害蟲的時間會相對滯后，這就大大增加了防治成本，減少了利潤。目前，對于不同食物來源或不同商家的商品躅蝽卵孵化率的檢測方法仍舊是在產卵期或人為規定的時間內測試其卵孵 化率的多少，這種方法費時費力費錢。因此需要一種快速檢測天敵昆蟲商品生物學特性-卵孵化率的方法。昆蟲體內，精液蛋白(seminal fluid protein CSSFP066)產生于雄蟲附腺中，它可以刺激精子的儲存、延遲精子的替代和競爭、顯著地增加雄蟲的適切性。

發明內容
本發明的一個目的是提供用于檢測精液蛋白CSSFP066編碼基因表達量的物質用途。本發明提供的用于檢測精液蛋白CSSFP066編碼基因表達量的物質在檢測昆蟲卵孵化率中的應用；所述精液蛋白CSSFP066的氨基酸序列為序列表中的序列2。上述應用中，所述昆蟲為昆蟲個體或昆蟲種群；所述昆蟲種群具體為取食不同物質昆蟲種群；所述取食不同物質昆蟲種群進一步具體為取食人工飼料的昆蟲種群或取食獵物的昆蟲種群；所述精液蛋白CSSFP066編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列I或序列表中的序列I自5’末端第1-312位核苷酸。所述昆蟲具體為躅蝽。上述人工飼料按照如下方法制備生豬肝60g、大豆粉10g、水100ml、雞蛋20ml、干酪素2g、鹿糖8g、VCO. 2g、氯化膽堿0. 4g、泛酸韓8mg、葉酸0. lmg、煙酰胺0. 2mg、慶大霉素
3.9mg ;具體飼喂方法見實施例2 ；上述獵物為昨蠶(Antheraea pernyi)蛹；具體飼喂方法見實施例2。上述應用中，所述用于檢測精液蛋白CSSFP066編碼基因表達量的物質為如下I) -3)中任意一種I)引物對A :所述引物對由引物I和引物2組成；所述引物I的核苷酸序列為序列表中序列3 ;所述引物2的核苷酸序列為序列表中序列4 ；2 )含有所述弓I物對A的RT-PCR試劑；3)含有所述引物對A或所述RT-PCR試劑的試劑盒。上述應用中，所述R T-PCR試劑由水、RT-PCR擴增緩沖液、鎂離子、dNTPs、所述的弓I物對A、熒光染料和Taq酶組成；所述引物對A中的各條引物在所述RT-PCR試劑中的終濃度具體為0. 2-1 U M，所述引物對A中的各條引物在所述RT-PCR試劑中的終濃度進一步具體為0. 25iiM ;所述試劑盒還包括內參引物對B，所述內參引物對B由引物3和引物4組成；所述引物3的核苷酸序列為序列表中的序列6 ;所述引物4的核苷酸序列為序列表中的序列7。本發明的另一個目的是提供一種檢測昆蟲卵孵化率的方法。本發明提供的方法，包括如下步驟用所述的引物對A或所述的RT-PCR試劑或所述的試劑盒對待測的昆蟲A和B進行RT-PCR擴增；若所述昆蟲A的精液蛋白CSSFP066基因的表達量高于所述昆蟲B，則所述昆蟲A卵孵化率高于所述昆蟲B。上述方法中，所述昆蟲為昆蟲個體或昆蟲種群；所述RT-PCR擴增的模板為昆蟲的cDNA ；所述昆蟲具體為躅蝽。在本發明的實施例中，所述昆蟲A為取食獵物的昆蟲種群；所述昆蟲B為取食人工飼料的昆蟲種群。本發明的實驗證明，本發明所提供的檢測方法可以通過檢測精液蛋白CSSFP066基因表達量來檢測不同種群的昆蟲卵孵化率，特別是不同營養源的躅蝽的卵孵化率。實驗證明，用本發明的檢測方法檢測昆蟲的卵孵化率僅需2-3天。而用傳統的生物學方法需要30-60天左右。本發明的檢測方法涉及的材料來源廣，易購買，操作簡單，省時，省力，適合于在昆蟲商品檢驗檢測中推廣應用。


圖1為躅蝽beta-actin內參擴增曲線圖2為躅蝽beta-actin內參融解曲線圖3為躅蝽精液蛋白CSSFP066基因擴增曲線圖4為躅蝽精液蛋白CSSFP066基因融解曲線
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。實施例1、檢測昆蟲卵孵化率的精液蛋白CSSFP066及其編碼基因的發現和專用引物的設計研究發現，精液蛋白基因是一種檢測昆蟲卵孵化率的很好的分子標記，因此本發明通過檢測躅蝽的精液蛋白(seminal fluid protein CSSFP066)編碼基因的表達來檢測躅蝽的卵孵化率。躅蝽的精液蛋白CSSFP066編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列I或序列表中的序列I自5’末端第1-312位核苷酸，該蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2。根據躅蝽的精液蛋白CSSFP066編碼基因設計用于擴增該編碼基因的引物如下上游引物TCACCAGTCCTTGCTTCGAC(序列 3 );下游引物TGCACTCGTAGGGAnTTGTC(序列 4)。實施例2、精液蛋白CSSFP066或編碼基因或專用引物在檢測躅蝽卵孵化率中的應用下述實驗中米用的螞疇(Armachinensis,記載在 Taxonomic and bionomicnotes onArma chinensis (Fallou) (Hemiptera:Pentatomidae:Asopinae, Zootaxa,3382:41-52, 2012，公眾可從中國農業科學院植物保護研究所獲得)根據取食物質的不同分為兩組，每組50只 取食人工飼料組躅蝽飼喂人工飼料的躅蝽(27 ±1° C，16:8(L:D)，75±5%RH)每天每頭成蟲飼喂160 Ul人工飼料，一直到躅蝽自然死亡；取食獵物組躅蝽飼喂獵物的躅蝽(27±1° C，16:8(L:D)，75±5%RH)每對成蟲飼喂一頭獵物，每隔7-15天根據獵物被取食情況更換一次獵物，一直到躅蝽自然死亡；人工飼料為生豬肝60g、大豆粉IOgjjC 100ml、雞蛋20ml、干酪素2g、鹿糖8g、VCO. 2g、氯化膽堿0. 4g、泛酸I丐8mg、葉酸0. lmg、煙酰胺0. 2mg、慶大霉素3. 9mg ；獵物為昨蠶(Antheraea pernyi )蛹(可商購)。一、躅蝽cDNA的獲得1、躅蝽RNA抽提步驟如下將各組躅蝽樣品移入加入適量液氮的研缽中，快速、用力研磨成勻漿，移至1. 5ml
離心管中。加1000 u ITri zol到1. 5ml離心管中，靜置5分鐘。加200 U I氯仿，旋渦振蕩10秒，靜置5分鐘，放入離心機中，12，000g4°C離心15分鐘。將上清液轉移至新的1. 5ml離心管中，加入等體積的異丙醇，振蕩混勻，_20°C放置I小時，室溫靜置10分鐘。放入離心機中，12，000g，4°C離心10分鐘。棄上清液，將異丙醇除盡，加入Iml75%的無水乙醇，12，000g，4°C離心5分鐘。
棄上清液，待沉淀干燥后加入DEPC處理水，_80°C保存，得到RNA。2、反轉錄米用SuperscripttOReverse Transcriptasekit 試劑盒(Invitrogenl8080044)進行反轉錄a)取一滅菌的無RNA酶的印pendorf管，每個樣本加入如下表I所示的組分得到mixl ；表I為反轉錄加入組分I
權利要求
1.用于檢測精液蛋白CSSFP066編碼基因表達量的物質在檢測昆蟲卵孵化率中的應用； 所述精液蛋白CSSFP066的氨基酸序列為序列表中的序列2。
2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于所述昆蟲為昆蟲個體或昆蟲種群； 所述精液蛋白CSSFP066編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列I或序列表中的序列I自5’末端第1-312位核苷酸； 所述昆蟲具體為躅蝽。
3.根據權利要求1或2所述的應用，其特征在于所述用于檢測精液蛋白CSSFP066編碼基因表達量的物質為如下I) -3)中任意一種 1)引物對A:所述引物對由引物I和引物2組成；所述引物I的核苷酸序列為序列表中序列3 ;所述引物2的核苷酸序列為序列表中序列4 ； 2)含有所述引物對A的RT-PCR試劑； 3)含有所述引物對A或所述RT-PCR試劑的試劑盒。
4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于 所述RT-PCR試劑由水、RT-PCR擴增緩沖液、鎂離子、dNTPs、所述的引物對A、熒光染料和Taq酶組成； 所述弓I物對A中的各條弓I物在所述RT-PCR試劑中的終濃度具體為0. 2-1 ii M,所述弓I物對A中的各條引物在所述RT-PCR試劑中的終濃度進一步具體為0. 25uM ； 所述試劑盒還包括內參引物對B，所述內參引物對B由引物3和引物4組成；所述引物3的核苷酸序列為序列表中的序列6 ;所述引物4的核苷酸序列為序列表中的序列7。
5.一種檢測昆蟲卵孵化率的方法，包括如下步驟用權利要求3或4應用中所述的引物對A或所述的RT-PCR試劑或所述的試劑盒對待測的昆蟲A和B進行RT-PCR擴增； 若所述昆蟲A的精液蛋白CSSFP066基因的表達量高于所述昆蟲B，則所述昆蟲A的卵孵化率高于所述昆蟲B。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于所述昆蟲為昆蟲個體或昆蟲種群； 所述RT-PCR擴增的模板為昆蟲的cDNA ； 所述昆蟲具體為躅蝽。
全文摘要
本發明公開了一種用精液蛋白基因檢測昆蟲卵孵化率的方法。本發明提供了用于檢測取食不同物質的昆蟲種群的精液蛋白CSSFP066編碼基因表達量的物質在檢測取食不同物質的昆蟲種群卵孵化率中的應用；所述精液蛋白CSSFP066的氨基酸序列為序列表中的序列2。本發明的實驗證明，本發明所提供的檢測方法可以用于檢測昆蟲卵孵化率，特別是不同營養源的蠋蝽的卵孵化率，用本發明的檢測方法檢測昆蟲的卵孵化率僅需2-3天。而用傳統的生物學方法需要30-60天左右。本發明的檢測方法涉及的材料來源廣，易購買，操作簡單，省時，省力，適合于在昆蟲商品檢驗檢測中推廣應用。
文檔編號C12Q1/68GK103060465SQ20131003140
公開日2013年4月24日 申請日期2013年1月28日 優先權日2013年1月28日
發明者鄒德玉, 陳紅印, 張禮生, 王樹英, 陳長風, 王孟卿, 劉晨曦 申請人:中國農業科學院植物保護研究所