細胞培養物的制備方法和細胞培養物及其在藥物篩選中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種細胞培養物的制備方法，該細胞培養物包括細胞培養基底和生長在該細胞培養基底上的活細胞，其特征在于，該方法包括：（1）制備楊氏模量為0.1-3000kPa的細胞培養基底；（2）在所述基底上培養活細胞。本發明還公開了如上所述的制備方法制備的細胞培養物以及該細胞培養物在藥物篩選中的應用。采用本發明提供的細胞培養物用于藥物的篩選，可以在一定程度上縮小體內外藥效的差異性，并且，隨著所述細胞培養基底的楊氏模量與所培養的細胞來源的組織的楊氏模量的接近，這種差異性得到了進一步縮小。
【專利說明】細胞培養物的制備方法和細胞培養物及其在藥物篩選中的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種細胞培養物的制備方法，按照該制備方法制備的細胞培養物及其在藥物篩選中的應用。
【背景技術】
[0002]體外細胞水平的藥物篩選試驗是一些疾病如腫瘤、臟器纖維化以及糖尿病等藥物研發的關鍵步驟，傳統的藥物篩選試驗是基于包含塑料基底的多孔細胞培養板而完成的，但是采用這種方法的藥物篩選效率較低。以抗腫瘤藥物的篩選為例，經臨床三期的藥物篩選后，平均每一萬個候選藥物只能產生一到兩個臨床中真正有效的藥物。藥物篩選效率的低下造成了時間與資源上的浪費。新一代的體外藥物篩選平臺如三維組織培養體系以及植入免疫缺陷小鼠的新鮮的人體活檢組織樣本被用來模擬人體的生理微環境而進行藥物的篩選，然而該方法的成本較高，并且技術較不成熟。

【發明內容】

[0003]本發明的目的在于克服采用現有技術進行藥物篩選的過程中藥物篩選效率較低，并且成本較高以及技術不成熟的缺點，提供一種藥物篩選效率較高、成本較低且技術成熟的細胞培養物及其制備方法，以及該細胞培養物在藥物篩選中的應用。
[0004]本發明的發明人發現，采用現有技術進行藥物篩選的過程中藥物篩選效率較低的原因在于，藥物篩選體系對人體生理微環境的模擬僅限于化學組成、生物大分子以及微結構層次上，而忽略了生物力學因素。事實上，生理狀態下的力學微環境，例如硬度，對細胞行為的影響同樣重要。細胞培養基底的硬度不僅影響腫瘤細胞的增殖，而且還調節對抗腫瘤藥物的敏感性。因此在體外硬度較大的塑料平板培養體系中所篩選出的有效藥物并非能在體內硬度較小的微環境中表現出同樣的療效。因此，我們提出了生物力藥理學，它不僅關注藥物與生物力作為單一因素的藥理學效應，還關注藥物與生物力學因素的聯合藥理學效應。在生物力藥理學的基礎上，本發明的發明人通過以細胞培養板為載體，在其上修飾不同生理硬度的生物相容性材料，進而在修飾有不同生理硬度的生物相容性材料的細胞培養板中進行細胞的培養，從而對藥物進行篩選，取得了良好的效果。所述生物相容性材料是指無生物毒性并為生命體正常功能的正常發揮提供支持，同時在生命體環境中能夠保持其原有的物化、材料等特性的材料。
[0005]基于以上發現，一方面，本發明提供了一種細胞培養物的制備方法，該細胞培養物包括細胞培養基底和生長在該細胞培養基底上的活細胞，其中，該方法包括:
[0006](1)制備楊氏模量為0.l-3000kPa的細胞培養基底；
[0007](2)在所述基底上培養活細胞。 [0008]另一方面，提供了根據本發明提供的方法制備的細胞培養物。
[0009]再一方面，本發明提供了所述細胞培養物在藥物篩選中的應用。[0010]由實施例和對比例的比較可以看出，采用本發明提供的細胞培養物用于藥物的篩選，可以在一定程度上縮小體內外藥效的差異性，并且，隨著所述細胞培養基底的楊氏模量與所培養的細胞來源的組織的楊氏模量的接近，這種差異性得到了進一步縮小。
[0011]本發明的其他特征和優點將在隨后的【具體實施方式】部分予以詳細說明
【具體實施方式】
[0012]以下對本發明的【具體實施方式】進行詳細說明。應當理解的是，此處所描述的【具體實施方式】僅用于說明和解釋本發明，并不用于限制本發明。
[0013]一方面，本發明提供了一種細胞培養物的制備方法，該細胞培養物包括細胞培養基底和生長在該細胞培養基底上的活細胞，其中，該方法包括:
[0014](I)制備楊氏模量為0.l-3000kPa的細胞培養基底；
[0015](2)在所述基底上培養活細胞。
[0016]根據本發明，術語“楊氏模量(Young’s modulus)”是描述固體材料抵抗形變能力的物理量，此處用于表示細胞培養基底或細胞來源組織的硬度，可以按照 The promotion of neuronal maturation on soft substrates, Biomaterials
(A.1.Teixeira, S.1lkhanizadeh, J.A.ffigenius, J.K.Duckworth, 0.1nganas and
0.Hermanson, 30 (2009 )，4567-4572.)中公開的方法進行測定，具體的，利用壓痕儀或原子力顯微鏡對細胞培養基底或細胞來源組織的硬度進行測定。通過繪制壓痕曲線，然后利用赫茲模型計算細胞培養基底的楊氏模量，公式如下:
[001 7] B = JyJP
[0018]其中，E為楊氏模量，F為加載力，U為泊松比，h為壓痕深度，R為壓痕儀末端或原子力顯微鏡微懸臂末端小球的半徑。
[0019]根據本發明，本發明的目的在于在利用細胞進行藥物的篩選時，縮小細胞體內外生長力學微環境，例如，硬度之間的差距，以提高體外藥物篩選的效率，從而使篩選的藥物成為臨床中真正有效的藥物。由于細胞來源的組織不同，其所適應生長的力學微環境，例如，硬度也有所不同，通常情況下，細胞來源組織的楊氏模量為0.l-3000kPa，因此，本發明所制備的細胞培養基底的楊氏模量為0.l-3000kPa。
[0020]根據本發明，盡管在本發明提供的細胞培養基底上培養細胞以獲得細胞培養物，并利用該細胞培養物進行藥物的篩選即可實現本發明的目的，即，提高藥物的篩選效率并降低成本。但當制備的細胞培養基底的楊氏模量和所要培養的細胞的來源組織的楊氏模量相同或基本相同時，可以更好的實現本發明的目的。因此，優選的，所述細胞培養基底的楊氏模量為所述細胞的來源組織的楊氏模量的0.9-1.2倍，更優選為0.95-1.05倍，進一步優選為 0.99-1.01 倍。
[0021]根據本發明，細胞培養物基底的制備方法不受特別的限制，例如，可以在用于細胞培養的培養器皿中修飾硬度可調的生物相容性材料，例如，聚丙烯酰胺凝膠和/或聚二甲基硅氧烷(PDMS)凝膠，然后再用細胞外基質蛋白修飾所述凝膠。
[0022]其中，聚丙烯酰胺凝膠和聚二甲基硅氧烷凝膠的制備為本領域技術人員所公知。例如，聚丙烯酰胺凝膠的制備方法為:在引發劑的存在下，將丙烯酰胺單體水溶液和二甲基丙烯酰胺的單體水溶液進行混合并聚合，即可得到聚丙烯酰胺凝膠。其中，所述引發劑的種類和加入量也為本領域技術人員所公知，例如，引發劑可以為過硫酸銨(APS)和四甲基乙=K(TEMED),以上述兩種單體水溶液的總體積為基準，質量分數為8-12%的APS水溶液的加入量為0.25-0.35體積％，TEMED的加入量為0.1-0.16體積％。聚二甲基硅氧烷凝膠的制備方法為:將聚二甲基硅氧烷(PDMS)單體(base)與固化劑(curing agent)混合,并在70-900C的溫度下聚合，得到聚二甲基硅氧烷凝膠。其中，所述PDMS單體為二甲基乙烯化的和三甲基化的二氧化硅、四(三甲基甲硅烷氧基)硅烷和乙基苯；所述固化劑為二甲基乙烯化的和三甲基化的二氧化硅和八甲基環四硅氧烷。所述PDMS單體和固化劑可以通過商購獲得，例如，從道康寧(Dow Corning)公司購買的PDMS試劑盒中即含有上述配制好的PDMS單體和固化劑。
[0023]其中，所述“硬度可調”是指可以調節修飾的生物相容性材料中各成分的比例和/或各成分的濃度以使所制備的生物相容性材料的楊氏模量與所要培養的細胞的來源組織的楊氏模量相同或基本相同。例如，當所述細胞來源組織的楊氏模量為0.1-1kPa時，例如所述組織的來源可以為腦、肺泡，將1-3重量％的丙烯酰胺單體和0.01-0.1重量％的二甲基丙烯酰胺單體的水溶液進行混合并聚合；或者將PDMS單體與固化劑按90-100:1的質量比進行混合并聚合。當所述細胞來源組織的楊氏模量大于IkPa到至多IOkPa時，例如所述組織的來源可以為乳腺、肝臟，將大于3重量％到至多8重量％的丙烯酰胺單體和大于0.1重量％到至多0.3重量％的二甲基丙烯酰胺單體的水溶液進行混合并聚合；或者將PDMS單體與固化劑按70:1到小于90:1的質量比進行混合并聚合。當所述細胞來源組織的楊氏模量大于IOkPa到至多IOOkPa時，例如所述組織來源可以為肌肉、骨膠原，將大于8重量％到至多10重量％的丙烯酰胺單體和大于0.3重量％到至多0.5重量％的二甲基丙烯酰胺單體的水溶液進行聚合；或者將PDMS單體與固化劑按30:1到小于70:1的質量比進行混合并聚合。當所述細胞來源組織的楊氏模量為大于100到至多3000kPa時，例如所述組織的來源可以軟骨，將二甲基硅氧烷與固化劑按5:1到小于30:1的質量比進行混合并聚合。需要指出的是，上述描述的配制不同楊氏模量的凝膠的方法僅為本發明優選的實施方式，實際并不限于此。只要通過調節生物相容性材料中各成分的比例和/或各成分的濃度能夠配制出上述范圍的楊氏模量的凝膠同樣為本發明的范圍。
[0024]當修飾的生物相容性材料為聚丙烯酰胺凝膠時，根據本發明一種優選的實施方式，所述含有聚丙烯酰胺凝膠的細胞培養基底的制備方法為:將厚度為1.5-2.5mm、長為
12.8-13.2mm,寬為 8.5-8.7mm 的玻璃板 A 與厚度為 1.5-2.5mm、長為 13.8-14.2mm,寬為
8.9-9.1mm玻璃板B泡酸(重鉻酸鉀63克；濃硫酸1000ml ;蒸餾水200ml。)過夜，依次自來水沖洗8-10次，蒸餾水沖洗3-4次，超純水沖洗1-2次后烘干；然后使用等離子體清洗儀處理玻璃板A4-6分鐘，并在其表面均勻涂抹一層親和硅烷(購自拜爾迪公司)，靜置8-10分鐘后再將其浸入0.4-0.6體積％的戊二醛溶液中25-35分鐘。在玻璃板B表面均勻涂抹一層二甲基二氯硅烷(DCM)，靜置8-10分鐘；將玻璃板A從戊二醛溶液中取出，吸去表面殘余水分；并將兩玻璃板拼合在一起，中間隔一層380-420微米厚的U形塑料墊片，并利用夾子固定；向5-6毫升按照不同比例配制好的丙烯酰胺與二甲基丙烯酰胺水溶液中加入12-14微升 8-12重量％的APS與6-8微升TEMED，混合均勻后迅速加入由玻璃板與墊片組裝的模具中直至充滿；待聚合后，拆掉模具，聚合的聚丙烯酰胺凝膠附著在玻璃板A上，將玻璃板A浸泡于超純水中22-26小時后；將細胞培養器皿底面用打孔器打通并倒扣在修飾有聚丙烯酰胺凝膠的玻璃板A上，利用夾子進行固定進而得到本發明的細胞培養基底。其中，超純水是指25°C下電阻率大于18ΜΩ.αιι或接近18.2ΜΩ.cm極限值的水。
[0025]根據本發明，使用細胞外基質蛋白修飾所述凝膠的方法為本領域技術人員所公知，例如，將所述凝膠與磺化的苯基疊氮化物交聯劑(suIfo-SANPAH)接觸，得到磺化的苯基疊氮化物交聯劑接觸的凝膠；將磺化的苯基疊氮化物交聯劑接觸的凝膠與細胞外基質蛋白接觸。
[0026]其中，將所述凝膠與sulfo-SANPAH接觸的條件的可選范圍較寬，例如，溫度可以為20-40°C，紫外光強度可以為180-220W，時間可以為10-20分鐘，磺化的苯基疊氮化物交聯劑的用量可以為10-20 μ g/平方厘米凝膠^fsulfo-SANPAH接觸的凝膠與細胞外基質蛋白接觸的條件的可選范圍也較寬:例如，溫度為可以30-40°C，時間可以為10-20小時，細胞外基質蛋白的用量可以為3-5 μ g/平方厘米凝膠。其中，所述細胞外基質蛋白的種類沒有特別的限制，只要在后續細胞培養的過程中可以輔助細胞貼壁即可，所述細胞外基質蛋白可以包括膠原蛋白、纖連蛋白和層粘連蛋白。
[0027]由于本發明的發明點在于制備硬度可調的細胞培養基底，所以在所述基底上培養細胞的方法沒有特別的限制，可以根據本領域技術人員公知的方法進行培養，在這里不再詳細贅述。
[0028]第二方面，本發明還提供了如上所述的制備方法制備的細胞培養物。
[0029]第三方 面，本發明還提供了如上所述的細胞培養物在藥物篩選中的應用。
[0030]以下將通過實施例對本發明進行詳細描述。以下實施例中和對比例中:
[0031]楊氏模量通過壓痕實驗測得:儀器為原子力顯微鏡，(購自安捷倫公司型號為5500)，選擇彈性系數為0.lN/m左右的原子力顯微鏡微懸臂，微懸臂末端粘附有直徑15微米左右的玻璃材質微球，在大氣中做壓痕實驗，將所得的力-位移作用曲線通過如下公式計算出楊氏模量。
【權利要求】
1.一種細胞培養物的制備方法，該細胞培養物包括細胞培養基底和生長在該細胞培養基底上的活細胞，其特征在于，該方法包括: (O制備楊氏模量為0.l-3000kPa的細胞培養基底； (2)在所述基底上培養活細胞。
2.根據權利要求1所述的制備方法，其中，所述細胞培養基底的楊氏模量為所述細胞的來源組織的楊氏模量的0.9-1.2倍，優選為0.95-1.05倍，更優選為0.99-1.01倍。
3.根據權利要求1或2所述的制備方法，其中，所述細胞的來源組織的楊氏模量為.0.1-lkPa，所述細胞培養基底的制備方法包括: (1)在引發劑的存在下，將1-3重量％的丙烯酰胺單體和0.01-0.1重量％的二甲基丙烯酰胺單體的水溶液進行混合并聚合，得到凝膠； 或者，將聚二甲基硅氧烷單體與固化劑按90-100:1的質量比進行混合，并在70-90°C的溫度下聚合，得到凝膠；所述單體為二甲基乙烯化的和三甲基化的二氧化硅、四(三甲基甲硅烷氧基)硅烷和乙基苯；所述固化劑為二甲基乙烯化的和三甲基化的二氧化硅和八甲基環四硅氧烷； (2)用細胞外基質蛋白修飾所述凝膠。
4.根據權利要求1或2所述的制備方法，其中，所述細胞來源組織的楊氏模量為大于IkPa到至多IOkPa,所述細胞培養基底的制備方法包括: (1)在引發劑的存在下，將大于3重量％到至多8重量％的丙烯酰胺單體和大于0.1重量％到至多0.3重量％的二甲基丙烯酰胺單體的水溶液進行混合并聚合，得到凝膠； 或者，將聚二甲基硅氧烷單體與固化劑按70:1到小于90:1的質量比進行混合，并在70-90°C的溫度下聚合，得到凝膠；所述單體為二甲基乙烯化的和三甲基化的二氧化硅、四(二甲基甲娃烷氧基)硅烷和乙基苯；所述固化劑為二甲基乙稀化的和二甲基化的二氧化娃和八甲基環四硅氧烷； (2)用細胞外基質蛋白修飾所述凝膠。
5.根據權利要求1或2所述的制備方法，其中，所述細胞來源組織的楊氏模量為大于IOkPa到至多IOOkPa,所述細胞培養基底的制備方法包括: (1)在引發劑的存在下，將大于8重量％到至多10重量％的丙烯酰胺單體和大于0.3重量％到至多0.5重量％的二甲基丙烯酰胺單體的水溶液進行混合并聚合，得到凝膠； 或者，將聚二甲基硅氧烷單體與固化劑按30:1到小于70:1的質量比進行混合，并在70-90°C的溫度下聚合，得到凝膠；所述單體為二甲基乙烯化的和三甲基化的二氧化硅、四(二甲基甲娃烷氧基)硅烷和乙基苯；所述固化劑為二甲基乙稀化的和二甲基化的二氧化娃和八甲基環四硅氧烷； (2)用細胞外基質蛋白修飾所述凝膠。
6.根據權利要求1或2所述的制備方法，其中，所述細胞來源組織的楊氏模量為大于IOOkPa到至多3000kPa，所述細胞培養基底的制備方法包括: (I)將聚二甲基硅氧烷單體與固化劑按5:1到小于30:1的質量比進行混合，并在70-90°C的溫度下聚合，得到凝膠；所述單體為二甲基乙烯化的和三甲基化的二氧化硅、四(二甲基甲娃烷氧基)硅烷和乙基苯；所述固化劑為二甲基乙稀化的和二甲基化的二氧化娃和八甲基環四硅氧烷；(2)用細胞外基質蛋白修飾所述凝膠。
7.根據權利要求3-6中任意一項所述的制備方法，其中，用細胞外基質蛋白修飾所述凝膠的方法包括: (1)將所述凝膠與磺化的苯基疊氮化物交聯劑接觸，得到磺化的苯基疊氮化物交聯劑接觸的凝膠； (2)將磺化的苯基疊氮化物交聯劑接觸的凝膠與細胞外基質蛋白接觸。
8.根據權利要求7所述的制備方法，其中，步驟(1)中，將所述凝膠與磺化的苯基疊氮化物交聯劑接觸的條件包括:溫度為20-40°C，紫外光強度為180-220W，時間為10-20分鐘，磺化的苯基疊氮化物交聯劑的用量為10-20 μ g/平方厘米凝膠；步驟(2)中，將磺化的苯基疊氮化物交聯劑接觸的凝膠與細胞外基質蛋白接觸的條件包括:溫度為30-40°C，時間為10-20小時，細胞外基質蛋白的用量為3-5 μ g/平方厘米凝膠；所述細胞外基質蛋白包括膠原蛋白、纖連蛋白和層粘連蛋白。
9.權利要求1-8中任意一項所述的制備方法制備的細胞培養物。
10.權利要求9所 述的細胞培養物在藥物篩選中的應用。
【文檔編號】C12N5/00GK103966152SQ201310033792
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2013年1月29日 優先權日:2013年1月29日
【發明者】馮建濤, 唐勇, 韓東 申請人:國家納米科學中心