本發明屬于食品免疫檢測領域，主要涉及局域表面等離子體共振(Localized Surface Plasmon Resonance technology，LSPR)技術篩選到一條特異結合SA的核酸適配體及其應用。

背景技術：

核酸適配體(Aptamer)是一類長度小于100nt的單鏈DNA或RNA序列，其是應用新型組合化學技術—指數富集配體系統進化技術(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX)體外從隨機寡核苷酸文庫中篩選得到能夠與靶標物高靈敏和特異性地結合的適配體。當目標分子存在時，適配體通過自身特殊而穩定的三維折疊形成特異性的靶物質結合位點，這使得適配體可以區分出在結構上僅有細微差異的結構相似的物質。核酸適配體又稱為“人工抗體”，其親和力強、穩定性好、無免疫原性，而且易于修飾和標記，已被廣泛用于檢測、分離純化和醫療三大領域。

局域表面等離子體共振(LSPR)是一種全新的、高靈敏度的蛋白及分子互作分析方法。由于生物分子易在納米顆粒表面沉積，通常將1～100nm的超細粒子—納米金顆粒(AuNPs)作為LSPR傳感層固定在金屬薄膜表面。LSPR的納米金傳感器(1.5mm²)比傳統SPR使用的持續金膜小，其在可見光范圍內可產生很強的共振吸收峰，使得顆粒周圍的局域折射率高度敏感，因此LSPR具有更短的響應時間和更高的檢測靈敏度。LSPR不僅能用于無標記實時監測許多種類生物分子之間的反應，還可以準確、靈敏、快速地檢測出各種生化指標。鑒于LSPR技術的一系列卓越性能，它可以廣泛地應用到食品、環境和分子生物學等領域，將直接成為實時觀測生物分子間相互作用的主導技術。

技術實現要素：

本發明借助LSPR-SELEX技術，利用設計構建的寡核苷酸文庫進行兩輪篩選，最終得到可特異結合SA的適配體克隆株，挑選其克隆株進行序列測定，其適配體序列的總長度為114bp，并結合CE技術表征，結果證明LSPR-SELEX技術篩選的SBA與SA有良好的結合能力。借助本發明SBA序列，可用于對SA進行定量和定性的檢測。

為了實現上述目的，本發明所采用的技術方案是：

借助LSPR-SELEX方法篩選的特異結合鏈霉親和素的核酸適配體序列，所述的核酸適配體序列為：

AACTGAACGGTGACTGATGGGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCAGATGACGACCGACTGACTTC。

所述的核酸適配體序列的結構見圖2。

所述的借助LSPR-SELEX方法篩選的特異結合鏈霉親和素的核酸適配體序列，包括以所述的核酸適配體序列為核心，任何對該核酸適配體序列的延長和修飾，修飾材料包括但不局限于納米材料、熒光材料、酶類、生物素及特定的蛋白質。

一種所述的核酸適配體序列在SA的定量和定性檢測中的應用。

本發明的有益效果：

(1)本發明借助LSPR-SELEX技術，經過兩輪對靶標物的核酸適配體篩選，得到可特異結合SA靶標物的多克隆株。挑選其克隆株進行序列測定，其適配體序列的總長度為114bp；結合CE實驗進行親和力表征，結果證明，此序列可與SA靶標物有很好的結合。

(2)本發明創建的LSPR-SELEX技術，利用固體芯片在檢測過程中無需標記物，最大限度地保持了核酸適配體的空間結構和生物活性，且樣品檢測范圍濃度低(0.1nM-1mM)。

(3)與傳統的核酸適配體篩選方法相比，本發明創建的LSPR-SELEX傳感技術操作簡單、靈敏度高、耗時短(15min)、響應速度快，最大的優勢在于相互作用數據實時在線的呈現，能快速準確地獲悉每一輪分子間的親和力。

(4)本發明借助LSPR傳感器芯片的再生性能好，可重復利用80～100次，極大降低實驗成本。

附圖說明

圖1：LSPR-SELEX篩選的適配體和靶標物的親和力鑒定結果。其中，縱坐標代表傳感器所檢測到的信號值；橫坐標代表樣品在傳感器中相互作用的時間。

A圖為第一輪篩選的核酸適配體和靶標物的親和力鑒定結果；圖中，從上到下各曲線對應的核酸適配體濃度逐漸降低(6μM、3μM、1.5μM、0.75μM、0.375μM)。

B圖為第二輪篩選的核酸適配體和靶標物的親和力鑒定結果。圖中，從上到下各曲線對應的核酸適配體濃度逐漸降低(10μM、5μM、2.5μM、1.25μM、0.625μM)。

圖2：SBA的空間結構。

圖3：CE-SELEX表征SBA適配體。

A：SA(250μg/mL)的電泳遷移；B：SBA(150μg/mL)的電泳遷移；C：SBA(75μg/mL)+SA(125μg/mL)的電泳遷移；D：BSA(250μg/mL)的電泳遷移；E：BSA(125μg/mL)+SBA(75μg/mL)的電泳遷移。

具體實施方式

以下結合實施例對本發明的具體實施方式作進一步詳細說明。

實施例1 LSPR-SELEX的篩選方法

(1)將寡核苷酸文庫(兩側各含有20bp的上下游引物的固定序列，中間為80nt的隨機序列)高速離心1min。再用ddH₂O將其稀釋成100μM的原液。寡核苷酸文庫進行熱變性(95℃10min)以破壞核酸分子間形成的聚合物，冰浴5min，避免核酸發生聚合。試驗中所用溶液使用前用0.22μm的微孔濾膜過濾。

(2)實驗儀器：Open-SPR(Nicoya，Ca)，采用鏈霉親和素(SA)包被的納米金芯片，開始以150μL/min的流速運行10mM的PBS緩沖液(NaCl 4g、Na₂HPO₄·12H₂O 1.45g、KCl 0.1g、KH₂PO₄ 0.1g、ddH₂O定容至0.5L，pH7.4)，至到達穩定的信號基線。

(3)將100μM的寡核苷酸文庫原液，用PBS緩沖液稀釋至終濃度為10μM，作為樣品。首先，注入250μL的寡核苷酸樣品，以20μL/min的流速進樣，與傳感器相互作用5min，一旦相互作用時間結束，立即通入PBS緩沖液，以150μL/min的流速，高速沖洗系統5min，以清洗除去結合力弱或未結合的寡核苷酸分子；然后，用水沖洗進樣系統，并用空氣排空，防止樣品在樣品管內壁吸附；最后注入250μL的NaOH再生緩沖液(稱取NaOH 0.4g，ddH₂O定容至1L)，在20μL/min低流速下與傳感器芯片相互作用5min，洗脫回收與靶標物特異性結合的核苷酸分子。

實施例2 PCR擴增及單鏈的制備

(1)將洗脫回收的核苷酸分子作為次級文庫，進行PCR富集。引物序列為：P1：5’-TTGACTTGCCACTGACTACC-3’(SEQ ID NO.1)，P2：5’-GATGACGACCGACTGACTTC-3’(SEQ ID NO.2)。優化PCR的反應體系和程序如下：50μL的反應體系為：20μM P1 2μL、20μM P2 2μL、2×Taq Master Mix 25μL、次級文庫21μL；PCR程序為：95℃預變性5min；94℃變性30s，61.7℃退火30s，72℃延伸30s，30個循環；最后72℃延伸2min，4℃保存。擴增產物用2％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，鑒定正確后進行純化，其產物作為制備單鏈次級庫的模板。

(2)優化制備單鏈次級庫的不對稱PCR，50μL的反應體系為：20μM P2 4μL、2×Taq Master Mix 25μL、ddH₂O 19μL、模板2μL；PCR程序為：95℃預變性5min；94℃變性30s，61.7℃退火30s，72℃延伸30s，35個循環；最后72℃延伸2min，4℃保存。擴增產物用2％瓊脂糖凝膠電泳，110V 30min，鑒定正確后對PCR產物進行純化，以此進行下一輪篩選。同時以同樣條件將PCR產物進行純化、復性。每一輪篩選后，采用TraceDrawer數據處理分析軟件進行KD的計算。

結果表明，第一輪LSPR-SELEX篩選的核酸適配體與靶標物的KD值為107μM(見圖1A)。第二輪LSPR-SELEX篩選的核酸適配體與靶標物的KD值為98nM(見圖1B)。這說明，LSPR-SELEX技術僅需兩輪篩選就能獲得親和力為98nM的核酸適配體。

實施例3克隆與測序

將第二輪LSPR-SELEX篩選得到的寡核苷酸序列連接到T載體上，進行克隆、測序，從而得到不同序列的適配體克隆株。最終以親和力最高、特異性最強的序列作為理想的適配體進行研究，命名為SBA(測序結果如SEQ ID NO.3所示)，結果見圖2。

實施例4毛細管電泳法表征(CE)

(1)利用毛細管電泳法對LSPR-SELEX過程進行表征。實驗儀器：G7100A(Agilent Technologies，USA)；熔融石英毛細管內徑50μM，長度56cm；運行緩沖液及樣品稀釋液均為PBS緩沖液(NaCl 8.5g、Na₂HPO₄ 2.2g、NaH₂PO₄ 0.1g、ddH₂O定容至1L，pH 7.6)

(2)使用前用1M NaOH(稱取NaOH 4g，ddH₂O定容至0.1L)、ddH₂O依次沖洗5min、20min兩遍，然后PBS緩沖液運行一次查看基線，待基線平穩后，進行樣品分離。

(3)每個樣品不少于200μL，分別上樣SA、SBA、SA與SBA的結合物(室溫孵育30min)、BSA、BSA與SBA的結合物(室溫孵育30min)，進樣壓力為50mbar×10s，分離電壓為20KV；樣品分離20min。

通過毛細管電泳法表征，結果表明，SA+SBA混合孵育后有復合物峰的出現，證實了SA和SBA存在相互作用(見圖3A-C)。對照組BSA+SBA混合孵育后無復合物峰的出現，說明BSA和SBA不反應(見圖3B、D-E)。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南省農業科學院

<120> 借助LSPR-SELEX方法篩選的特異結合鏈霉親和素的核酸適配體序列及其應用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

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