專利名稱：抗乙型肝炎病毒人工miRNA及其組合的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學與生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及抑制乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)的人工miRNA(articifical miRNA,amiRNA)表達序列及其組合在治療HBV感染疾病中的應用。
背景技術(shù)：
HBV感染是當前威脅人類健康嚴重的傳染病之一，與HBV感染相關(guān)的肝衰竭、肝硬化和原發(fā)性肝細胞癌每年約導致100多萬人死亡。我國是HBV感染大國屬于高流行區(qū)，HBV感染不僅危害我國人民的健康，給患者及其家庭造成巨大的經(jīng)濟和精神負擔，而且給國家造成了巨大的勞動力和經(jīng)濟損失，乃至導致嚴重的就業(yè)等社會問題。目前臨床有效的治療HBV藥物主要包括干擾素和核苷類藥物。干擾素治愈率有限，副作用較多，核苷類藥物存在容易引起HBV突變耐藥和停藥后易復發(fā)，因此新型抗HBV藥物的研發(fā)具有重要的社會和經(jīng)濟價值。miRNA是一種大小約22nt的非編碼小分子單鏈RNA，由一段具有發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)的長度約為70-80nt的單鏈RNA前體剪切后生成。miRNA序列靠近5'端的I 7個核苷酸種子區(qū)是靶基因結(jié)合的區(qū)域，當miRNA與mRNA不完全互補時，miRNA結(jié)合到mRNA的3 ^端非翻譯區(qū)抑制其翻譯，當miRNA與mRNA完全互補時，會導致靶mRNA降解。在保持發(fā)夾狀miRNA莖環(huán)前體的結(jié)構(gòu)和能量特征不變的條件下改變堿基，可產(chǎn)生與自然miRNA具有相同長度、但與自然miRNA序列完全無關(guān)的小RNA，這種小RNA分子就是amiRMA。amiRNA利用內(nèi)源miRNA前體人工合成具有靶向任何基因的miRNA并以此下調(diào)該特定基因的表達。這種通過amiRNA技術(shù)實現(xiàn)的特異基因高效穩(wěn)定沉默是RNAi發(fā)展過程中的又一重大突破，已經(jīng)成為分子生物學和藥物研發(fā)的有力工具。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供治療HBV感染的amiRNA表達序列及其組合，其使用方式及攜帶其的表達載體。具體地說，本發(fā)明涉及具有抑制HBV病毒復制能力的amiRNA表達序列及其組合在制備治療HBV感染引起的相關(guān)疾病的藥物中的應用。本發(fā)明提供的靶向HBV的amiRNA表達序列可抑制HBV的復制和病毒基因的表達。本發(fā)明提供的amiRNA表達序列是通過以下方法獲得的:選擇設(shè)計可靶向HBV病毒基因保守區(qū)的RNA干擾靶點序列，將該靶點序列及其的反向互補序列替換鼠源pre-miRNA155的miRNA成熟區(qū)，并克隆入amiRNA表達載體ρΟΚ-basic (生物技術(shù)通訊，2012，23 (6):91-95.)獲得相應的amiRNA表達質(zhì)粒,將該質(zhì)粒分別與HBV感染性克隆質(zhì)粒進行共轉(zhuǎn)染實驗，通過檢測上清中HBsAg和HBeAg的表達水平獲得有效的amiRNA表達序列。抑制HBV表達的amiRNA表達序列,該序列選自:(1)SEQ ID NO:1_17中任何一個所示的序列，或者(2)與(1)中序列具有至少70% (優(yōu)選至少80%、85%、90%、95%、98%或更高)一致性的序列，或者(3)上述序列的片段或者互補序列本發(fā)明還提供包含抑制HBV表達的amiRNA表達序列的組合，已達到防止病毒變異引起的逃逸并提高病毒抑制效果的目的。本發(fā)明還涉及了含有amiRNA表達序列及其組合的重組表達載體或病毒載體。本發(fā)明還涉及在基因組中或者基因組外攜帶本發(fā)明涉及的amiRNA表達序列及其組合的細胞，包含原核細胞和真核細胞(如細菌細胞、真菌細胞、植物細胞、動物細胞，優(yōu)選哺乳動物如人的細胞，優(yōu)選肝細胞和干細胞)。本發(fā)明還涉及本發(fā)明amiRNA表達序列及其組合、載體和細胞用于治療HBV感染或者HBV患者的用途。本發(fā)明的實施對嚴重危害人類健康的乙型肝炎及其相關(guān)疾病的治療具有重要的社會效益和經(jīng)濟效益。


為了更好的理解本發(fā)明的實質(zhì)，下面將結(jié)合附圖來對本發(fā)明進行更詳細的說明。圖1為pOK-basic載體圖譜，用于amiRNA的構(gòu)建和表達。圖2顯示了靶向17個amiRNA表達序列質(zhì)粒在與HBV感染性克隆質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染H印G2細胞后顯示出的抑制HBV表達的能力，可抑制H印G2細胞中HBsAg和HBeAg的表達。圖3顯示了含有串聯(lián)amiRNA表達序列(組合)的質(zhì)粒在與HBV感染性克隆質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HepG2細胞后顯示出的抑制HBV表達的能力，可抑制HepG2細胞中HBsAg和HBeAg的表達。圖4顯示了含有串聯(lián)amiRNA表達序列(組合)的質(zhì)粒與HBV感染性克隆質(zhì)粒水動力注射小鼠尾靜脈后，分別在2、5、9和14天尾靜脈取血，合適比例稀釋后檢測的HBsAg含量。串聯(lián)amiRNA表達序列(組合)在體內(nèi)顯示出較強抑制HBV復制的能力，可抑制HBV感染性克隆質(zhì)粒的表達，降低血清中HBsAg的水平。圖5顯示了含有串聯(lián)amiRNA表達序列(組合)的質(zhì)粒與HBV感染性克隆質(zhì)粒水動力注射小鼠尾靜脈后，分別在2、5、9和14天尾靜脈取血，合適比例稀釋后檢測的HBeAg含量。串聯(lián)amiRNA表達序列(組合)在體內(nèi)顯示出較強抑制HBV復制的能力，可抑制HBV感染性克隆質(zhì)粒的表達，降低血清中HBeAg的水平。
具體實施例方式本發(fā)明提供了一種通過amiRNA表達序列及其組合進行抗HBV治療的新方法，以下通過實例對本發(fā)明做進一步的詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實例僅僅用于解釋本發(fā)明，除非特別說明，本發(fā)明的術(shù)語具有本領(lǐng)域通常使用的含義。本發(fā)明提供了可靶向HBV的amiRNA表達序列，包含如下序列或與其至少有70%(優(yōu)選至少80%、85%、90%、95%、98%或更高)一致性的序列中的任何一個或幾個序列:SEQ ID NO:1-17。—致性(identity)可以按照本領(lǐng)域公知的方法計算。適合于確定序列一致性和序列相似性百分數(shù)的算法的一個優(yōu)選例子是BLAST和BLAST2.0算法。執(zhí)行BLAST分析的軟件可以通過國立生物技術(shù)信息中心為公眾所獲得。依據(jù)本發(fā)明amiRNA表達序列指的是通過設(shè)計表達或設(shè)計合成等方式得到的靶向HBV的序列。當其通過質(zhì)粒形式進行表達時使用的啟動子可以是任何適于在細胞中表達目的基因的啟動子。可以是組成型的，也可以是誘導性的。實施例一靶向HBV的amiRNA表達載體質(zhì)粒的設(shè)計與構(gòu)建靶向HBV的amiRNA表達序列的設(shè)計:以HBV參考序列為靶序列，選擇設(shè)計可靶向HBV病毒基因保守區(qū)的RNA干擾靶點序列，將該靶點序列及其的反向互補序列替換鼠源pre-miRNA155的miRNA成熟區(qū)，并克隆入amiRNA表達載體pOK-basic (圖例I)獲得相應的amiRNA表達質(zhì)粒。實施例二共轉(zhuǎn)染實驗篩選可抑制HBV的amiRNA表達序列材料與方法1.細胞培養(yǎng)所用 細胞為為肝癌細胞H印G2，用含5%胎牛血清(FBS，Hyclone)的DMEM細胞培養(yǎng)液37°C、5% C02條件下培養(yǎng)。2.ρΟΚ-basic-amiRNA質(zhì)粒由本發(fā)明提供；HBV復制型質(zhì)粒pHBVl.31含1.31拷貝HBV DNA并有完整復制單元，其能在轉(zhuǎn)染H印G2細胞內(nèi)完成病毒的復制，細胞培養(yǎng)液上清中可檢測到HBV表面抗原(HBsAg)和e抗原(HBeAg)的分泌，細胞內(nèi)及細胞上清可檢測到病毒復制中間體。3.細胞轉(zhuǎn)染HepG2細胞在含5% FBS的DMEM培養(yǎng)液中，于37°C、5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。觀察細胞生長狀態(tài)良好，培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，將H印G2細胞接種24孔板，8 X IO4細胞/孔，37°C，5% C02孵育24-36小時，待長至70% -90%細胞匯合后，采用GenJet轉(zhuǎn)染試劑并參照說明書操作轉(zhuǎn)染，同時設(shè)克隆有不靶向任何人和小鼠的amiRNA隨機序列的載體作為對照。4.HBsAg、HBeAg 檢測轉(zhuǎn)染后48h收集細胞培養(yǎng)液，將收集好的細胞培養(yǎng)液，按照HBsAg，HBeAg定量ELISA檢測試劑盒(鄭州安圖綠科生物工程有限公司)說明書操作步驟檢測，得到轉(zhuǎn)染有不同amiRNA的上清中含有的HBsAg和HBeAg濃度。結(jié)果以共轉(zhuǎn)染了對照amiRNA表達質(zhì)粒和HBV感染性克隆質(zhì)粒的H印G2細胞的培養(yǎng)上清中的HBsAg、HBeAg蛋白作為對照，計算各轉(zhuǎn)染amiRNA上清中HBsAg、HBeAg蛋白的相對水平。實施例三靶向HBV的串聯(lián)amiRNA在小鼠模型體內(nèi)對HBV的抑制作用。材料與方法1.動物造模SPF級C57小鼠，16±18g，購自軍事醫(yī)學科學院動物實驗中心。以小鼠尾靜脈快速注射大容量體積質(zhì)粒的方式造模，分別將6 μ g的amiRNA表達質(zhì)粒與6 μ gpHBVl.18 (含
1.18拷貝HBV DNA)共溶于小鼠體重1/10體積的PBS中，5_8秒內(nèi)勻速注射完畢。 2.HBsAg、HBeAg 檢測造模后第2、5、9和14天小鼠尾靜脈取血，合適比例稀釋后HBsAg和HBeAg按照ELISA定量檢測試劑盒(鄭州安圖綠科生物工程有限公司)說明書操作步驟檢測。結(jié)果結(jié)果如圖4、圖5所示。由圖中可見，本發(fā)明構(gòu)建的串聯(lián)ami RNA表達質(zhì)粒小鼠體內(nèi)均可顯著抑制HBsAg 和HBeAg的表達水平。
權(quán)利要求
1.制HBV的amiRNA表達序列，該序列選自: 1.1SEQ ID NO:1-17中任何一個所示的序列，或者 1.2與1.1中序列具有至少70% (優(yōu)選至少80%、85%、90%、95%、98%或更高)一致性的序列，或者 1.3上述序列的片段或者互補序列。
2.制HBV的amiRNA表達序列組合，其特征在于所述組合含有權(quán)利要求1所述的amiRNA表達序列。
3.一種基因治療載體，該載體可以是質(zhì)粒載體或病毒載體，其特征在于所述載體含有權(quán)利要求1和權(quán)利要求2所述的amiRNA表達序列及其組合。
4.一種改造的細 胞，其特征是該細胞可表達或含有權(quán)利要求1和權(quán)利要求2所述的amiRNA表達序列及其組合或含有權(quán)利要求3中所述的基因治療載體。
5.一種治療乙肝病毒感染相關(guān)疾病的治療藥物及其組合物，其特征在于含有權(quán)利要求1和權(quán)利要求2所述的amiRNA表達序列及其組合或權(quán)利要求3中所述的基因治療載體或權(quán)利要求4中所述的一種改造的細胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及分子生物學與生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及針對乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)的人工miRNA(articifical miRNA，amiRNA)及其組合在治療HBV感染疾病中的應用。本發(fā)明利用生物信息學和分子生物學的方法針對HBV不同基因型的保守區(qū)分別設(shè)計和構(gòu)建了amiRNA及其真核表達載體，通過體內(nèi)外篩選發(fā)現(xiàn)了17條可顯著抑制HBV復制的amiRNA及其不同的amiRNA組合。因此，本發(fā)明涉及的amiRNA及其組合有望成為治療乙型肝炎病毒相關(guān)疾病的新型治療藥物和手段。
文檔編號C12N15/113GK103088026SQ20131003956
公開日2013年5月8日 申請日期2013年2月1日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月1日
發(fā)明者王升啟, 王學軍, 李英, 黃海, 張秀娟, 謝佩雯 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所