專利名稱：擴(kuò)展真核生物遺傳密碼的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于真核細(xì)胞中的翻譯生物化學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明涉及在真核細(xì)胞中生產(chǎn)和組合正交tRNA、正交合成酶和它們配對(duì)的方法。本發(fā)明也涉及非天然氨基酸的組合物、蛋白質(zhì)和在真核細(xì)胞中生產(chǎn)包括非天然氨基酸的蛋白質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
從細(xì)菌到人類，每 個(gè)已知生物的遺傳密碼都編碼了相同的二十個(gè)普通氨基酸。這20個(gè)相同的天然氨基酸的不同組合構(gòu)成蛋白質(zhì)，進(jìn)行實(shí)際上所有的復(fù)雜生命過程，從光合作用到信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和免疫反應(yīng)。為了研究和修飾蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，科學(xué)家們?cè)噲D操縱遺傳密碼和蛋白質(zhì)的氨基酸序列。但是，難以去除由遺傳密碼強(qiáng)加的限制，即將蛋白質(zhì)限于二十個(gè)遺傳編碼的標(biāo)準(zhǔn)構(gòu)建(除了罕用的硒代半胱氨酸(參見，例如，A.Bock等，(1991)，Molecular Microbiology5:515-20)和卩比咯賴氨酸(參見，例如，G.Srinivasan,等，(2002)，Science296:1459-62)。在消除這些限制方面已經(jīng)取得了一些進(jìn)展，雖然該進(jìn)展已被限制而且合理控制蛋白結(jié)構(gòu)和功能的能力仍就處于萌芽狀態(tài)。例如，化學(xué)家已經(jīng)開發(fā)了合成和操縱小分子結(jié)構(gòu)的方法和策略(參見，例如，E.J.Corey和X.-M.Cheng，化學(xué)合成的邏輯(The Logicof Chemical Synthesis)(ffiIey-1nterscience, New York,1995))。全合成(參見，例如，B.Merrifield, (1986)，Science232:341-7 (1986))和半合成方法(參見，例如，D.Y.Jackson 等，(1994) Science266:243-7 和 P.E.Dawson 和 S.B.Kent, (2000)，AnnualReview of Biochemistry69:923-60)使合成肽和小蛋白成為可能,但是這些方法的使用在超過10千道爾頓(kDa)的蛋白質(zhì)中受到限制。誘變法雖然是強(qiáng)大的，但也限于有限數(shù)量的結(jié)構(gòu)改變。在很多情況下，可能在整個(gè)蛋白質(zhì)中競爭性摻入與普通氨基酸接近的結(jié)構(gòu)類似物。參見，例如，R.Furter, (1998), Protein Science7:419-26 ；K.Kirshenbaum,等，(2002)，ChemBioChem3:235-7 和 V.Doring 等，(2001)，Science292:501_4。在嘗試擴(kuò)展操縱蛋白結(jié)構(gòu)和功能的能力中，開發(fā)了用化學(xué)酰化正交tRNA的體外方法，該方法允許在體外響應(yīng)于無義密碼子將非天然氨基酸選擇性摻入(參見，例如，J.A.Ellman,等，(1992), Science255:197-200)。將具有新結(jié)構(gòu)和物理性質(zhì)的氨基酸選擇性摻入蛋白中，以研究蛋白折疊和穩(wěn)定性，以及生物分子識(shí)別和催化作用。參見，例如，D.Mendel,等，(1995), Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure24:435-462 和 V.W.Cornish,等(1995 年 3 月 31 日)，Angew Chem.1nt.Ed.Engl.，34:621_633。然而，該方法的化學(xué)計(jì)量性質(zhì)嚴(yán)重限制了可以產(chǎn)生的蛋白量。將非天然氨基酸顯微注射入細(xì)胞。例如，通過顯微注射化學(xué)錯(cuò)酰化嗜熱四膜蟲tRNA(例如，M.E.Saks,等(1996)，用于通過無義抑制將非天然氨基酸體內(nèi)摻入蛋白質(zhì)中的工程四膜蟲tRNAGln，J.Biol.Chem.271:23169-23175)和相應(yīng)的mRNA將非天然氨基酸引入爪蟾卵母細(xì)胞的煙酰乙酰膽堿受體中(例如，M.W.Nowak,等(1998)，將非天然氨基酸體內(nèi)摻入爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的離子通道中，酶學(xué)方法.293 =504-529)。這允許通過引入含有物理或化學(xué)性質(zhì)獨(dú)特的側(cè)鏈氨基酸，對(duì)卵母細(xì)胞內(nèi)的受體進(jìn)行詳細(xì)的生物物理研究。參見，例如，D.A.Dougherty (2000),作為蛋白結(jié)構(gòu)和功能探針的非天然氨基酸，Curr.0pin.Chem.Biol.4:645_652。不幸的是，該方法限于可顯微注射的細(xì)胞中的蛋白質(zhì)，因?yàn)橄嚓P(guān)的tRNA是體外化學(xué)酰化的，不能再酰化，所以蛋白產(chǎn)率很低。為克服這些限制，將新組分加入原核生物大腸桿菌的蛋白生物合成機(jī)器中(例如，L.Wang，等，(2001)，Science292:498-500)，這允許在體內(nèi)遺傳編碼非天然氨基酸。為響應(yīng)琥珀密碼子TAG，用該方法將具有新化學(xué)、物理或生物學(xué)性質(zhì)的一些新氨基酸，包括光親和標(biāo)記和可光致異構(gòu)的氨基酸、酮基氨基酸和糖基化氨基酸以高保真度有效摻入大腸桿菌的蛋白中。參見，例如，J.W.Chin 等，(2002), Journal of the American ChemicalSocietyl24:9026-9027 ；J.ff.Chin 和 P.G.Schultz, (2002)，ChemBioChemll:1135-1137 ；J.ff.Chin,等，(2002), PNAS United States of America99:11020-11024:和 L.Wang 和P.G.Schultz, (2002), Chem.Comm., 1_10。然而,原核細(xì)胞和真核細(xì)胞的翻譯機(jī)器并不是高度保守的；因此，加入大腸桿菌的生物合成機(jī)器的組分不能經(jīng)常用來將非天然氨基酸位點(diǎn)特異性地?fù)饺胝婧思?xì)胞的蛋白中。例如，大腸桿菌中使用的詹氏甲烷球菌酪氨酰-tRNA合成酶/tRNA對(duì)在真核細(xì)胞中是不正交的。此外，tRNA在真核細(xì)胞中，而非在原核細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄是通過RNA聚合酶III進(jìn)行的，這限制了可在真核細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的tRNA結(jié)構(gòu)基因的一級(jí)序列。而且，與原核細(xì)胞相反，真核細(xì)胞中的tRNA需要從轉(zhuǎn)錄它們的細(xì)胞核中輸出至胞質(zhì)，以在翻譯中起作用。最后，真核80S核糖體與70S原核核糖體不同。因此，需要開發(fā)改進(jìn)的生物合成機(jī)器組件，以擴(kuò)展真核生物遺傳密碼。本發(fā)明滿足了這些和其它需要，這在下面公開的綜述中顯而易見。
發(fā)明概要本發(fā)明提供了具有翻譯組件的真核細(xì)胞，例如，正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)對(duì)和正交tRNA (O-tRNA)，及它們的個(gè)別組件，它們用于真核蛋白生物合成機(jī)器，在真核細(xì)胞中將非天然氨基酸摻入生長的多肽鏈中。
本發(fā)明組合物包括含有正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)(例如，來源于非真核生物，如大腸桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌等)的真核細(xì)胞(例如，酵母細(xì)胞(如釀酒酵母細(xì)胞)，哺乳動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、藻類細(xì)胞、真菌細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞等)，其中O-RS在真核細(xì)胞中優(yōu)選地氨酰化具有至少一個(gè)非天然氨基酸的正交tRNA (O-tRNA)。任選地，在給定真核細(xì)胞中可以氨酰化兩種或多種OtRNA。在一個(gè)方面，O-RS氨酰化例如，至少40%、至少45%、至少50%、至少60%、至少75%、至少80%、或甚至90%或更多的具有非天然氨基酸的Ο-tRNA，與具有氨基酸序列，如SEQ ID N0.:86或45中所列序列的O-RS—樣有效。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的O-RS氨酰化具有非天然氨基酸的Ο-tRNA，比O-RS氨酰化具有天然氨基酸的O-tRNA的效率高例如，至少10倍、至少20倍、至少30倍等。在一個(gè)實(shí)施方式中，SEQ ID N0.:3_35 (例如，3_19、20_35或序列3_35的任何其它亞組)中所列任一個(gè)多核苷酸序列，或與其互補(bǔ)的多核苷酸序列編碼了 O-RS或它的一部分。在另一實(shí)施方式中，O-RS包含了 SEQ ID N0.:36-63 (例如，36_47、48_63或36-63的任何其它亞組)和/或86，或其保守變異的氨基酸序列。在另一實(shí)施方式中，O-RS包含氨基酸序列，即與天然產(chǎn)生的酪氨酰氨酰基-tRNA合成酶(TyrRS)例如、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或至少99.5%或更多相同，并包含來自A-E族的兩種或多種氨基酸。A族包括與大腸桿菌TyrRS的Tyr37相對(duì)應(yīng)位置上的纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸或蘇氨酸。B族包括與大腸桿菌TyrRS的Asnl26相對(duì)應(yīng)位置上的天冬氨酸。C族包括與大腸桿菌TyrRS的Aspl82相對(duì)應(yīng)位置上的蘇氨酸、絲氨酸、精氨酸、天冬酰胺或甘氨酸。D族包括與大腸桿菌TyrRS的Phel83相對(duì)應(yīng)位置上的甲硫氨酸、丙氨酸、纈氨酸或酪氨酸；E族包括與大腸桿菌TyrRS的Leul86相對(duì)應(yīng)位置上的絲氨酸、甲硫氨酸、纈氨酸、半胱氨酸、蘇氨酸或丙氨酸。任何這些族組合的亞組是本發(fā)明的特征。例如，在一個(gè)實(shí)施方式中，O-RS具有兩種或多種選自與大腸桿菌TyrRS的Tyr37相對(duì)應(yīng)位置上出現(xiàn)的纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、或蘇氨酸；與大腸桿菌TyrRS的Aspl82相對(duì)應(yīng)位置上的蘇氨酸、絲氨酸、精氨酸、或甘氨酸；與大腸桿菌TyrRS的Phel83相對(duì)應(yīng)位置上的甲硫氨酸、或酪氨酸；和與大腸桿菌TyrRS的Leul86相對(duì)應(yīng)位置上 的絲氨酸、或丙氨酸的氨基酸。在另一實(shí)施方式中，O-RS包括兩種或多種選自與大腸桿菌TyrRS的Tyr37相對(duì)應(yīng)位置上的甘氨酸、絲氨酸、或丙氨酸，與大腸桿菌TyrRS的Asnl26相對(duì)應(yīng)位置上的天冬氨酸，與大腸桿菌TyrRS的Aspl82相對(duì)應(yīng)位置上的天冬酰胺，與大腸桿菌TyrRS的Phel83相對(duì)應(yīng)位置上的丙氨酸或纈氨酸和/或和與大腸桿菌TyrRS的Leul86相對(duì)應(yīng)位置上的甲硫氨酸、纈氨酸、半胱氨酸、或蘇氨酸。在另一實(shí)施方式中，與天然氨基酸相比，O-RS對(duì)于非天然氨基酸具有一種或多種改進(jìn)或增強(qiáng)的酶性質(zhì)。例如，與天然氨基酸相比對(duì)非天然氨基酸的改進(jìn)或增強(qiáng)的性質(zhì)包括，例如，較高km、較低km、較高krat、較低krat、較低kMt/km、較高kMt/km等的任意一種。真核細(xì)胞也任選地包括非天然氨基酸。真核細(xì)胞任選地包括正交tRNA (O-tRNA)(例如，來自非真核生物，如大腸桿菌，嗜熱脂肪芽孢桿菌和/或類似物)，其中O-tRNA識(shí)別選擇密碼子，并優(yōu)選地由O-RS氨酰化具有非天然氨基酸的O-tRNA。在一個(gè)方面，0-tRNA介導(dǎo)非天然氨基酸摻入蛋白質(zhì)中，其效率相當(dāng)于包含SEQ ID N0.:65中所列多核苷酸序列或在該序列的細(xì)胞中加工的tRNA效率的例如，至少45%、至少50%、至少60%、至少75%、至少80%、至少90%、至少95%或99%。在另一方面，Ο-tRNA包含SEQ ID N0.:65的序列，O-RS包含選自SEQ ID N0.:36-63 (例如，36_47、48_63或36-63的任何其它亞組)和/或86和/或它們的保守變異中任意一個(gè)所列氨基酸序列的多肽序列。在另一實(shí)施方式中，真核細(xì)胞包含含有編碼感興趣多肽的多核苷酸的核酸，其中多核苷酸包含Ο-tRNA識(shí)別的選擇密碼子。在一個(gè)方面，包含非天然氨基酸的感興趣多肽的產(chǎn)率是從多核苷酸缺少選擇密碼子的細(xì)胞中獲得的天然產(chǎn)生的感興趣多肽的例如，至少
2.5%、至少5%、至少10%、至少25%、至少30%、至少40%、50%或更多。在另一方面，細(xì)胞在沒有非天然氨基酸的情況下生產(chǎn)感興趣多肽的產(chǎn)率是在有非天然氨基酸的情況下多肽產(chǎn)率的例如，小于35%、小于30%、小于20%、小于15%、小于10%、小于5%、小于2.5%等。本發(fā)明也提供包含正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)、正交tRNA (Ο-tRNA)、非天然氨基酸和含有編碼感興趣多肽的多核苷酸的核酸的真核細(xì)胞。多核苷酸包含0-tRNA識(shí)別的選擇密碼子。此外，在真核細(xì)胞中O-RS優(yōu)選地氨酰化具有非天然氨基酸的正交tRNA (Ο-tRNA)，細(xì)胞在沒有非天然氨基酸的情況下生產(chǎn)感興趣多肽的產(chǎn)率是在有非天然氨基酸的情況下多肽產(chǎn)率的例如，小于30%、小于20%、小于15%、小于10%、小于5%、小于2.5%等。

包括含有正交tRNA (Ο-tRNA)的真核細(xì)胞的組合物也是本發(fā)明的特征。一般地，Ο-tRNA在體內(nèi)介導(dǎo)非天然氨基酸摻入蛋白質(zhì)中，該蛋白質(zhì)通過含有Ο-tRNA識(shí)別的選擇密碼子的多核苷酸編碼。在一個(gè)實(shí)施方式中，Ο-tRNA介導(dǎo)非天然氨基酸摻入蛋白質(zhì)中，其效率相當(dāng)于包含SEQ ID N0.:65中所列多核苷酸序列或在該序列的細(xì)胞中加工的tRNA效率的例如，至少45%、至少50%、至少60%、至少75%、至少80%、至少90%、至少95%或甚至99%或更高。在另一實(shí)施方式中，Ο-tRNA包含SEQ ID N0.:65中所列的多核苷酸序列或它的保守變異，或從該序列加工而來。在另一實(shí)施方式中，Ο-tRNA包含可循環(huán)的0-tRNA。在本發(fā)明的一個(gè)方面，Ο-tRNA是轉(zhuǎn)錄后修飾的。本發(fā)明也提供在真核細(xì)胞中編碼Ο-tRNA的核酸或它的互補(bǔ)多核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方式中，核酸包含A框和B框。本發(fā)明也表征了生產(chǎn)翻譯組件的方法,例如，O-RSs或0-tRNA/0-RS對(duì)(和這些方法生產(chǎn)的翻譯組件)。例如，本發(fā)明提供了生產(chǎn)正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)的方法，該酶在真核細(xì)胞中優(yōu)選地氨酰化具有非天然氨基酸的正交tRNA。該方法包括，例如，將第一種類的生物真核細(xì)胞的群體在非天然氨基酸存在下進(jìn)行正選擇，其中各真核細(xì)胞包含:i)氨酰基-tRNA合成酶(RS)文庫的一員、ii)正交tRNA (0-tRNA)、iii)編碼正選擇標(biāo)記的多核苷酸和iv)編碼負(fù)選擇標(biāo)記的多核苷酸；其中在正選擇下存活的細(xì)胞包含在非天然氨基酸存在下氨酰化正交tRNA (Ο-tRNA)的活性RS。在沒有非天然氨基酸的情況下將在正選擇下存活的細(xì)胞進(jìn)行負(fù)選擇，以去除氨酰化具有天然氨基酸的Ο-tRNA的活性RS。這提供了優(yōu)選地氨酰化具有非天然氨基酸的Ο-tRNA的0-RS。在某些實(shí)施方式中，將編碼正選擇標(biāo)記的多核苷酸可操作地連接到效應(yīng)元件上，細(xì)胞還包括a)編碼從效應(yīng)元件調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白(例如，真核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白等)和b)包含至少一種選擇密碼子的的多核苷酸。通過氨酰化具有非天然氨基酸的Ο-tRNA將非天然氨基酸摻入轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白中導(dǎo)致正選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄。在一個(gè)實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白是轉(zhuǎn)錄激活蛋白(例如，GAL4等)，選擇密碼子是琥珀終止密碼子，例如，其中琥珀終止密碼子位于或基本上接近編碼轉(zhuǎn)錄激活蛋白的DNA結(jié)合域的部分多核苷酸。正選擇標(biāo)記可以是各種分子中任意一種。在一個(gè)實(shí)施方式中，正選擇標(biāo)記包含生長營養(yǎng)補(bǔ)充劑，在缺少營養(yǎng)補(bǔ)充劑的培養(yǎng)基中進(jìn)行選擇。在另一實(shí)施方式中，編碼正選擇標(biāo)記的多核苷酸是例如，1^&3、16112、1782、1&02基因、1^83(例如，其中his3基因編碼咪唑甘油磷酸脫氫酶，由提供的3-氨基三唑(3-AT)和/或類似物檢測(cè)。在另一實(shí)施方式中，編碼正選擇標(biāo)記的多核苷酸包含選擇密碼子。如同正選擇標(biāo)記一樣，負(fù)選擇標(biāo)記也可以是各種分子中任意一種。在某些實(shí)施方式中，編碼負(fù)選擇標(biāo)記的多核苷酸可操作地連接到效應(yīng)元件上，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白從效應(yīng)元件介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄。通過氨酰化具有天然氨基酸的Ο-tRNA將天然氨基酸摻入轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白中導(dǎo)致負(fù)選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄。在一個(gè)實(shí)施方式中，編碼負(fù)選擇標(biāo)記的多核苷酸是例如，ura3基因，負(fù)選擇在含有5-氟乳清酸(5-F0A)的培養(yǎng)基中完成。在另一實(shí)施方式中，用于負(fù)選擇的培養(yǎng)基包含可以被負(fù)選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)化為可檢測(cè)物質(zhì)的選擇劑或篩選劑。在本發(fā)明的一個(gè)方面，可檢測(cè)物質(zhì)是有毒物質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方式中，編碼負(fù)選擇標(biāo)記的多核苷酸包括選擇密碼子。在某些實(shí)施方式中，正選擇標(biāo)記和/或負(fù)選擇標(biāo)記包含在合適反應(yīng)物的存在下使發(fā)光反應(yīng)發(fā)熒光或催化發(fā)光反應(yīng)的多肽。在本發(fā)明的一個(gè)方面，通過熒光激活細(xì)胞分選(FACS)或通過發(fā)光檢測(cè)正選擇標(biāo)記和/或負(fù)選擇標(biāo)記。在某些實(shí)施方式中，正選擇標(biāo)記和/或負(fù)選擇標(biāo)記包含基于親和力的篩選標(biāo)記或轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白。在一個(gè)實(shí)施方式中，同一多核苷酸編碼正選擇標(biāo)記和負(fù)選擇標(biāo)記。在一個(gè)實(shí)施方式中，編碼本發(fā)明正選擇標(biāo)記和/或負(fù)選擇標(biāo)記的多核苷酸可以包含至少兩個(gè)選擇密碼子，各自或兩者可以包含至少兩個(gè)不同的選擇密碼子或至少兩個(gè)相同的選擇密碼子。選擇/篩選嚴(yán)格性的附加水平也可用于本發(fā)明方法。在一個(gè)實(shí)施方式中，方法可包括，例如，在步驟(a)、(b)或(a)和(b)提供數(shù)量不等的失活合成酶，其中數(shù)量不等的失活合成酶提供附加水平的選擇或篩選嚴(yán)格性。在一個(gè)實(shí)施方式中，本方法用于生產(chǎn)O-RS的步驟(a)，(b)或步驟(a)和(b)包括不同的選擇或篩選嚴(yán)格性，例如，正和/或負(fù)選擇標(biāo)記的嚴(yán)格性。該方法任選地包括將優(yōu)選地氨酰化具有非天然氨基酸的Ο-tRNA的O-RS進(jìn)行附加選擇輪，例如，附加正選擇輪、附加負(fù)選擇輪或附加正和負(fù)選擇輪的組合。

在一個(gè)實(shí)施方式中，選擇/篩選包括一種或多種正或負(fù)選擇/篩選，它們選自，例如，氨基酸通透性的改變，翻譯效率的改變，翻譯保真度的改變等。一種或多種改變是基于編碼正交tRNA-tRNA合成酶對(duì)的組件的一種或多種多核苷酸中的突變被用來生產(chǎn)蛋白。一般地，RS文庫(例如，突變體RS文庫)包含來自至少一種例如，來自非真核生物的氨酰基-tRNA合成酶(RS)的RS。在一個(gè)實(shí)施方式中，RS文庫來自失活的RS，例如，其中失活RS通過突變活性RS而產(chǎn)生。在另一實(shí)施方式中，失活RS包含氨基酸結(jié)合口袋和一個(gè)或多個(gè)含有用一種或多種不同氨基酸取代結(jié)合口袋的氨基酸，例如，取代的氨基酸用丙氨酸取代。在某些實(shí)施方式中，生產(chǎn)O-RS的方法還包括在編碼RS的核酸上進(jìn)行隨機(jī)突變、位點(diǎn)特異性突變、重組、嵌合構(gòu)建或它們的任意組合，因此產(chǎn)生突變體RS文庫。在某些實(shí)施方式中，該方法還包括，例如，(c)分離編碼O-RS的核酸；(d)從核酸中產(chǎn)生一組編碼突變O-RS的多核苷酸(例如，通過隨機(jī)誘變、位點(diǎn)特異性誘變、嵌合構(gòu)建、重組或它們的任意組合)；和(e)重復(fù)步驟(a)和/或(b)，直到獲得優(yōu)選地氨酰化具有非天然氨基酸的0-tRNA的突變0-RS。在本發(fā)明的一個(gè)方面，步驟(c)-(e)至少進(jìn)行兩次。
生產(chǎn)0-tRNA/0-RS對(duì)的方法也是本發(fā)明的特征。在一個(gè)實(shí)施方式中，如上所述地獲得0-RS，通過將第一種類的真核細(xì)胞的群體進(jìn)行負(fù)選擇獲得Ο-tRNA，其中真核細(xì)胞包括tRNA文庫的一員，以去除包含被對(duì)真核細(xì)胞內(nèi)源性氨酰基-tRNA合成酶(RS)氨酰化的tRNA文庫的一員的細(xì)胞。這提供了與第一種類的真核細(xì)胞正交的tRNA庫。在本發(fā)明的一個(gè)方面，tRNA文庫包含來自至少一種例如，來自非真核生物的tRNA的tRNA。在本發(fā)明的另一方面，氨酰基-tRNA合成酶(RS)文庫包括來自至少一種例如，來自非真核生物的氨酰基-tRNA合成酶(RS)的RS。在本發(fā)明的另一方面，tRNA文庫包括來自至少一種來自第一種非真核生物的tRNA的tRNAs。氨酰基-tRNA合成酶(RS)文庫任選地包含來自至少一種來自第二種非真核生物的氨酰基-tRNA合成酶(RS)的RS。在一個(gè)實(shí)施方式中，第一種和第二種非真核生物是相同的。另外，第一種和第二種非真核生物可以是不同的。通過本發(fā)明方法生產(chǎn)的特異性0-tRNA/0-RS對(duì)也是本發(fā)明的特征。本發(fā)明的另一特征是在一種類中生產(chǎn)翻譯組件和將選擇/篩選的翻譯組件引入第二種類的方法。例如,在第一種類(例如,真核生物,如酵母等)中生產(chǎn)0-tRNA/0-RS對(duì)的方法還包括將編碼Ο-tRNA的核酸和編碼O-RS的核酸引入第二種類的真核細(xì)胞(例如，哺乳動(dòng)物、昆蟲、真菌、藻類、植物等)。第二種類可以在體內(nèi)用引入的翻譯組件將非天然氨基酸摻入生長的多肽鏈中，例如，在翻譯過程中。在另一實(shí)施例中，生產(chǎn)在真核細(xì)胞中優(yōu)選地氨酰化具有非天然氨基酸的正交tRNA的正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)的方法包括:(a)在非天然氨基酸存在下對(duì)第一種類的真核細(xì)胞群體(例如，真核生物，如酵母或類似物)進(jìn)行正選擇。各第一種類的真核細(xì)胞包括:i)氨酰基-tRNA合成酶(RS)文庫的 一員，ii)正交tRNA (0-tRNA)，iii)編碼正選擇標(biāo)記的多核苷酸，和iv)編碼負(fù)選擇標(biāo)記的多核苷酸。能夠在正選擇下存活的細(xì)胞包含在非天然氨基酸存在下氨酰化正交tRNA (Ο-tRNA)的活性RS。將在正選擇下存活的細(xì)胞在沒有非天然氨基酸的情況下進(jìn)行負(fù)選擇，以去除氨酰化具有天然氨基酸的Ο-tRNA的活性RS，因此提供優(yōu)選地氨酰化具有非天然氨基酸的Ο-tRNA的0-RS。將編碼Ο-tRNA的核酸和編碼O-RS的核酸引入第二種類的真核細(xì)胞(例如，哺乳動(dòng)物、昆蟲、真菌、藻類、植物和/或類似物)。當(dāng)這些組件在第二種類中翻譯時(shí)，這些組件可以用來將非天然氨基酸摻入第二種類中感興趣的蛋白或多肽。在一個(gè)實(shí)施方式中，將Ο-tRNA和/或O-RS引入第二種類的生物真核細(xì)胞中。在某些實(shí)施方式中，通過將第一種類真核細(xì)胞的群體進(jìn)行負(fù)選擇獲得Ο-tRNA，其中真核細(xì)胞包含tRNA文庫的一員，以去除被對(duì)真核細(xì)胞內(nèi)源性氨酰基-tRNA合成酶(RS)氨酰化的tRNA文庫的一員的細(xì)胞。這提供了與第一種類和第二種類的真核細(xì)胞正交的tRNA 庫。在一個(gè)方面，本發(fā)明包括含有一種蛋白的組合物，其中該蛋白包含至少一種非天然氨基酸和至少一個(gè)翻譯后修飾，其中至少一個(gè)翻譯后修飾是將含有第二活性基團(tuán)的分子通過[3+2]環(huán)加成附著到含有第一活性基團(tuán)的至少一種非天然氨基酸上。因此，具有至少一種非天然氨基酸的蛋白(或感興趣多肽)也是本發(fā)明的特征。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，具有至少一種非天然氨基酸的蛋白包括至少一個(gè)翻譯后修飾。在一個(gè)實(shí)施方式中，至少一個(gè)翻譯后修飾是將含有第二活性基團(tuán)的分子(例如，染料、聚合物如聚乙二醇的衍生物、光交聯(lián)劑、細(xì)胞毒化合物、親和標(biāo)記、生物素的衍生物、樹脂、第二種蛋白或多肽、金屬螯合劑、輔因子、脂肪酸、碳水化合物、多核苷酸(例如、DNA、RNA等)等)通過[3+2]環(huán)加成附著到含有第一活性基團(tuán)的至少一種非天然氨基酸上。例如，第一活性基團(tuán)是炔基部分(例如，非天然氨基酸中對(duì)-炔丙基氧基苯丙氨酸)(該基團(tuán)有時(shí)也稱為乙炔部分)，第二活性基團(tuán)是疊氮基部分。在另一個(gè)實(shí)施例中，第一活性基團(tuán)是疊氮基部分(例如，非天然氨基酸中對(duì)-疊氮基-L-苯丙氨酸)，第二活性基團(tuán)是炔基部分。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的蛋白包括至少一種含有至少一個(gè)翻譯后修飾的非天然氨基酸(例如，酮式非天然氨基酸)，其中至少一個(gè)翻譯后修飾是糖部分。在某些實(shí)施方式中，在真核細(xì)胞中體內(nèi)進(jìn)行翻譯后修飾。
在某些實(shí)施方式中，蛋白包括至少一個(gè)通過真核細(xì)胞體內(nèi)進(jìn)行的翻譯后修飾，其中翻譯后修飾并不是通過原核細(xì)胞進(jìn)行的。翻譯后修飾的例子包括但不限于乙酰化、酰化、脂質(zhì)-修飾、棕櫚酰化、棕櫚酸酯加成、磷酸化、糖脂-連接修飾等。在一個(gè)實(shí)施方式中，翻譯后修飾包括將寡糖通過GlcNAc-天冬酰胺連接附著到天冬酰胺上(例如，其中寡糖包括(GlcNAc-Man)2-Man-GlcNAc-GlcNAc等)。在另一實(shí)施方式中，翻譯后修飾是將寡糖(例如，Gal-GalNAc,Gal-GlcNAc 等)通過 GalNAc-絲氛酸、GalNAc-蘇氛酸、GlcNAc-絲氛酸或GlcNAc-蘇氨酸連接附著到絲氨酸或蘇氨酸上。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的蛋白或多肽可包含分泌或定位序列、表位標(biāo)記、FLAG標(biāo)記、聚組氨酸標(biāo)記、GST融合蛋白和/或類似物。
一般地，蛋白與任意可用蛋白(例如，治療蛋白、診斷蛋白、工業(yè)酶或它們的一部分和/或類似物)的例如，至少60%、至少 70%、至少75%、至少80%、至少90%、至少95%或甚至至少99%或更多相同，它們包含一種或多種非天然氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明組合物包括感興趣的蛋白或多肽和賦形劑(例如，緩沖液、藥學(xué)上可接受的賦形劑等)。
感興趣的蛋白或多肽可含有至少一個(gè)、至少兩個(gè)、至少三個(gè)、至少四個(gè)、至少五個(gè)、至少六個(gè)、至少七個(gè)、至少八個(gè)、至少九個(gè)、或十個(gè)或更多非天然氨基酸。非天然氨基酸可以是相同或不同的，例如，在包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多不同的非天然氨基酸的蛋白中可以有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多不同位點(diǎn)。在某些實(shí)施方式中，蛋白質(zhì)天然產(chǎn)生形式中存在的至少一種，但少于全部的具體氨基酸被非天然氨基酸取代。
一種蛋白(或感興趣多肽)的例子包括但不限于，例如，細(xì)胞因子、生長因子、生長因子受體、干擾素、白介素、炎癥分子、癌基因產(chǎn)物、肽激素、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子、留類激素受體、促紅細(xì)胞生成素(EPO)、胰島素、人生長激素、α-1抗胰蛋白酶、血管生成抑制素、抗溶血因子、抗體、載脂蛋白、脫輔蛋白質(zhì)、心鈉素、心房鈉尿多肽、心房肽、C-X-C趨化因子、Τ39765、NAP-2、ENA-78、Gro_a、Gro_b、Gro_c、IP-10、GCP-2、NAP-4、SDF-1、PF4、MIG、降鈣素、c-kit配體、細(xì)胞因子、CC趨化因子、單核細(xì)胞趨化蛋白-1、單核細(xì)胞趨化蛋白-2、單核細(xì)胞趨化蛋白-3、單核細(xì)胞炎癥蛋白-1 α、單核細(xì)胞炎癥蛋白-1 β、RANTES, 1309、R83915、R91733、HCC1、Τ58847、D31065、Τ64262、CD40、CD40 配體、C-kit 配體、膠原、集落刺激因子(CSF)、補(bǔ)體因子5a、補(bǔ)體抑制劑、補(bǔ)體受體1、細(xì)胞因子、DHFR、上皮嗜中性粒細(xì)胞激活肽_78、GR0a /MGSA, GRO β , GRO y , MIP-1 a、MIP-1 δ、MCP-1、表皮生長因子(EGF)、上皮嗜中性粒細(xì)胞激活肽、促紅細(xì)胞生成素(EPO)、剝脫性毒素、因子IX、因子VI1、因子VII1、因子X、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)、纖維蛋白原、纖連蛋白、G-CSF、GM-CSF、葡糖腦苷脂酶、促性腺素、生長因子、生長因子受體、Hedgehog蛋白、血紅蛋白、肝細(xì)胞生長因子(HGF)、水蛭素、人血清白蛋白、ICAM-1、ICAM-1受體、LFA-1、LFA-1受體、胰島素、胰島素-樣生長因子(IGF)、IGF-1、IGF-11、干擾素、IFN- α、IFN- β、IFN- y、白介素、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-1U IL-12、角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子(KGF)、乳鐵蛋白、白血病抑制因子、熒光素酶、Neurturin、嗜中性粒細(xì)胞抑制因子(NIF)、制瘤素M、成骨蛋白、癌基因產(chǎn)物、甲狀旁腺激素、PD-ECSF, TOGF、肽激素、人生長激素、多效營養(yǎng)因子、蛋白A、蛋白G、熱源性外毒素A、B或C、松弛素、腎素、SCF、可溶性補(bǔ)體受體1、可溶性1-CAM1、可溶性白介素受體、可溶性TNF受體、生長調(diào)節(jié)素、促生長素抑制素、促生長素、鏈激酶、超抗原、葡萄球菌腸毒素、SEA、SEB、SECl、SEC2、SEC3、SED、SEE、留類激素受體、超氧化物歧化酶(SOD)、中毒性休克綜合征毒素、胸腺素α 1、組織纖溶酶原激活物、腫瘤生長因子(TGF)、TGF-α、TGF-β、腫瘤壞死因子、腫瘤壞死因子α、腫瘤壞死因子β、腫瘤壞死因子受體(TNFR)、VLA-4蛋白、VCAM-1 蛋白、血管內(nèi)皮生長因子(VEGEF)、尿激酶、Mos、Ras、Raf、Met ;p53、Tat、Fos、Myc、Jun> Myb> Rel、雌激素受體、孕酮受體、睪酮受體、醛固酮受體、LDL受體、SCF/c_Kit、CD40L/CD40、VLA-4/VCAM-l、ICAM-1/LFA-1、透明質(zhì)酸苷(hyalurin)/CD44、皮質(zhì)酮、Genebank 或其它可用數(shù)據(jù)庫中存在的蛋白等，和/或它們的一部分。在一個(gè)實(shí)施方式中，感興趣多肽包括轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白(例如，轉(zhuǎn)錄激活蛋白(如GAL4)，或轉(zhuǎn)錄抑制蛋白等)或它們的一部分。
真核細(xì)胞中的GAL4蛋白或其部分的組合物也是本發(fā)明的特征。一般地，GAL4蛋白或其一部分包含至少一種非天然氨基酸。
本發(fā)明的真核細(xì)胞提供了合成含大有用量非天然氨基酸的蛋白的能力。例如，生產(chǎn)含有非天然氨基酸的蛋白在細(xì)胞抽提物、緩沖液、藥學(xué)上可接受的賦形劑和/或類似物中的蛋白濃度是，例如，至少10微克/升、至少50微克/升、至少75微克/升、至少100微克/升、至少200微克/升、至少250微克/升、或至少500微克/升或更高。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明組合物包括，例如，至少10微克、至少50微克、至少75微克、至少100微克、至少200微克、至少250微克、或至少500微克或更多含有非天然氨基酸的蛋白。
在某些實(shí)施方式中，核酸編碼感興趣的蛋白或多肽(或它們的一部分)。一般地，該核酸包含至少一個(gè)選擇密碼子、至少兩個(gè)選擇密碼子、至少三個(gè)選擇密碼子、至少四個(gè)選擇密碼子、至少五個(gè)選擇密碼子、至少六個(gè)選擇密碼子、至少七個(gè)選擇密碼子、至少八個(gè)選擇密碼子、至少九個(gè)選擇密碼子、或甚至十個(gè)或更多選擇密碼子。
本發(fā)明也提供在真核細(xì)胞中生產(chǎn)至少一種含有至少一個(gè)非天然氨基酸的蛋白質(zhì)(以及用這種方法生產(chǎn)的蛋白) 的方法。方法包括，例如，在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)含有一種核酸的真核細(xì)胞，該核酸包含至少一個(gè)選擇密碼子并編碼該蛋白。真核細(xì)胞也含有細(xì)胞中有功能且能識(shí)別選擇密碼子的正交tRNA(O-tRNA)，以及優(yōu)選地氨酰化具有非天然氨基酸的Ο-tRNA的正交氨酰基tRNA合成酶(O-RS)，培養(yǎng)基含有非天然氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方式中，O-RS氨酰化具有非天然氨基酸的Ο-tRNA相當(dāng)于具有如SEQ ID N0.:86或45中所列氨基酸序列的O-RS的效率的例如，至少45%、至少50%、至少60%、至少75%、至少80%、至少90%、至少95%、或甚至99%或更高。在另一實(shí)施方式中，Ο-tRNA包括SEQ ID N0.:64或65或其互補(bǔ)多核苷酸序列，或從該序列加工而來，或由該序列編碼。在另一實(shí)施方式中，O-RS包含SEQ ID N0.:36-63 (例如，36_47、48_63或36-63的任意其它亞組)和/或86中任一個(gè)所列氨基酸序列。
在一個(gè)實(shí)施方式中，該方法還包括將非天然氨基酸摻入該蛋白中，其中非天然氨基酸包含第一活性基團(tuán)；并將該蛋白與含有第二活性基團(tuán)的分子(例如，染料、聚合物、例如、聚乙二醇的衍生物、光交聯(lián)劑、細(xì)胞毒化合物、親和標(biāo)記、生物素的衍生物、樹脂、第二種蛋白或多肽、金屬螯合劑、輔因子、脂肪酸、碳水化合物、多核苷酸(例如、DNA、RNA等)等)接觸。第一活性基團(tuán)與第二活性基團(tuán)反應(yīng)，將該分子通過[3+2]環(huán)加成附著到非天然氨基酸上。在一個(gè)實(shí)施方式中，第一活性基團(tuán)是炔基或疊氮基部分，第二活性基團(tuán)是疊氮基或炔基部分。例如，第一活性基團(tuán)是炔基部分(例如，非天然氨基酸中對(duì)-炔丙基氧基苯丙氨酸)，第二活性基團(tuán)是疊氮基部分。在另一實(shí)施例中，第一活性基團(tuán)是疊氮基部分(例如，非天然氨基酸中對(duì)-疊氮基-L-苯丙氨酸)，第二活性基團(tuán)是炔基部分.
在某些實(shí)施方式中，編碼蛋白包含治療蛋白、診斷蛋白、工業(yè)酶或它們的一部分。在一個(gè)實(shí)施方式中，通過非天然氨基酸進(jìn)一步修飾該方法生產(chǎn)的蛋白。例如，通過如親核-親電子反應(yīng)，經(jīng)由[3+2]環(huán)加成等修飾非天然氨基酸。在另一實(shí)施方式中，通過至少一個(gè)翻譯后修飾(例如，N-糖基化，O-糖基化，乙酰化，酰化，脂質(zhì)-修飾，棕櫚酰化，棕櫚酸酯加成，磷酸化，糖脂-連接修飾等)體內(nèi)修飾該方法生產(chǎn)的蛋白質(zhì)。
也提供了生產(chǎn)篩選或選擇轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白的方法(以及用這種方法生產(chǎn)的篩選或選擇轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白)。方法包括，例如，選擇第一個(gè)多核苷酸序列，其中多核苷酸序列編碼核酸結(jié)合域；將第一個(gè)多核苷酸序列突變，以包括至少一種選擇密碼子。這提供了篩選或選擇多核苷酸序列。方法也包括，例如，選擇第二個(gè)多核苷酸序列，其中第二個(gè)多核苷酸序列編碼轉(zhuǎn)錄激活域；提供構(gòu)建物，它包含可操作地連接于第二個(gè)多核苷酸序列的篩選或選擇多核苷酸序列；和，將構(gòu)建物非天然氨基酸、正交tRNA合成酶(O-RS)和正交tRNA(0-tRNA)引入細(xì)胞。用這些組件，響應(yīng)于篩選或選擇多核苷酸序列中的選擇密碼子，O-RS優(yōu)選地氨酰化具有非天然氨基酸的0-tRNA，Ο-tRNA識(shí)別選擇密碼子并將非天然氨基酸摻入核酸結(jié)合域中。這提供了篩選或選擇轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白。
在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的組合物和方法包括真核細(xì)胞。本發(fā)明的真核細(xì)胞包括，例如，哺乳動(dòng)物細(xì)胞、酵母細(xì)胞、真菌細(xì)胞、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞等的任意一種。本發(fā)明的翻譯組件可以來自各種生物，例如，非真核生物，如原核生物(例如，大腸桿菌，嗜熱脂肪芽孢桿菌等)，或古細(xì)菌，或例如，真核生物。
本發(fā)明的選擇密碼子擴(kuò)展了真核蛋白生物合成機(jī)器的遺傳密碼子構(gòu)架。本發(fā)明中可以使用各種選擇密碼子的任意一種，包括終止密碼子(例如，琥珀密碼子、赭石密碼子或乳白終止密碼子)、無義密碼子、罕用密碼子、四(或更多)堿基密碼子和/或類似物。
可用于本文描述的組合物和方法的非天然氨基酸的例子包括(但不限于):對(duì)-乙酰基-L-苯丙氨酸、對(duì)-碘代-L-苯丙氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、對(duì)-炔丙基氧基苯丙氨酸、對(duì)-炔丙基-苯丙氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、0-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、三-氧-乙酰基-GlcNAc β -絲氨酸、L-多巴、氟化苯丙氨酸、異丙基-L-苯丙氨酸、對(duì)-疊氮基-L-苯丙氨酸、對(duì)-酰基-L-苯丙氨酸、對(duì)-苯甲酰基-L-苯丙氨酸、L-磷酸絲氨酸、膦酰基絲氨酸、膦酰基酪氨酸、對(duì)-溴苯丙氨酸、對(duì)-氨基-L-苯丙氨酸、異丙基-L-苯丙氨酸、酪氨酸氨基酸的非天然類似物；谷氨酰胺氨基酸的非天然類似物；苯丙氨酸氨基酸的非天然類似物；絲氨酸氨基酸的非天然類似物；蘇氨酸氨基酸的非天然類似物；烷基、芳基、酰基、疊氮基、氰基、齒素、肼、酰肼、羥基、鏈烯基、炔基、醚、硫醇、磺酰基、硒、酯、硫代酸、硼酸、硼酸鹽、磷酰基、膦酰基、膦、雜環(huán)、烯酮、亞 胺、醛、羥胺、酮基或氨基取代的氨基酸或它們的任意組合；具有可光敏化的交聯(lián)劑的氨基酸；自旋標(biāo)記的氨基酸；熒光氨基酸；金屬結(jié)合氨基酸；含金屬的氨基酸；放射性氨基酸；光籠蔽(photocaged)和/或可光致異構(gòu)的氨基酸；含有生物素或生物素_類似物的氨基酸；含酮氨基酸；含有聚乙二醇或聚醚的氨基酸；重原子取代的氨基酸；可化學(xué)切割或可光切割的氨基酸；具有延長側(cè)鏈的氨基酸；含有毒基團(tuán)的氨基酸；糖取代的氨基酸；含有碳-連接糖的氨基酸；具有氧化還原活性的氨基酸；含α -羥基的酸；氨基硫代酸；α，α雙取代的氨基酸；β-氨基酸；除脯氨酸或組氨酸外的環(huán)氨基酸，除苯丙氨酸，酪氨酸或色氨酸外的芳族氨基酸，和/或類似物。
本發(fā)明也提供多肽(O-RS)和多核苷酸，例如，Ο-tRNA，編碼O-RS或其一部分(例如，合成酶的活性位點(diǎn))的多核苷酸，用于構(gòu)建氨酰基-tRNA合成酶突變體的寡核苷酸，編碼含有一種或多種選擇密碼子的感興趣的蛋白或多肽的多核苷酸等。例如，本發(fā)明的多肽包括包含SEQ ID N0.:36-63 (例如，36_47、48_63或36-63的任意其它亞組)和/或86中任一個(gè)所列氨基酸序列的多肽，包含由SEQ ID N0.:3-35 (例如，3_19、20_35或序列3-35的任何其它亞組)中任一個(gè)所列多核苷酸序列編碼的氨基酸序列的多肽，和具有抗體特異免疫活性的多肽，該抗體對(duì)包含SEQ ID N0.:36-63(例如，36-47、48-63或36-63的任意其它亞組)和/或86中任一個(gè)所列氨基酸序列的多肽或包含SEQ ID N0.:3_35 (例如，3_19、20-35或序列3-35的任何其它亞組)中任一所列多核苷酸序列編碼的氨基酸序列的多肽特巳
本發(fā)明的多肽也包括與天然產(chǎn)生的酪氨酰氨酰基-tRNA合成酶(TyrRS)(例如，SEQ ID N0.:2)具有至少90%相同氨基酸序列的多肽，和包含A-E族(上述)中兩種或多種氨基酸的多肽。類似地，本發(fā)明多肽也任選地包括含有SEQ ID N0.:36-63(例如，36-47、48-63或36-63的任意其它亞組)和/或86中任意一個(gè)的至少20個(gè)連續(xù)氨基酸的多肽，和如A-E族中所述的兩個(gè)或多個(gè)氨基酸取代。含有任一上述多肽的保守變異的氨基酸序列也作為本發(fā)明的多肽包括在內(nèi)。
在一個(gè)實(shí)施方式中，組合物包括本發(fā)明的多肽和賦形劑(例如，緩沖液、水、藥學(xué)上可接受的賦形劑等)。本發(fā)明也提供與本發(fā)明多肽具有特異免疫活性的抗體或抗血清。
本發(fā)明中也提供了多核苷酸。本發(fā)明的多核苷酸包括那些用一種或多種選擇密碼子編碼本發(fā)明感興趣的蛋白或多肽的多核苷酸。此外，本發(fā)明的多核苷酸包括，例如，含有SEQ ID N0.:3-35(例 如，3-19、20-35或序列3-35的任意其它亞組)>64-85中任意一個(gè)所列核苷酸序列的多核苷酸；與該多核苷酸序列互補(bǔ)或編碼該多核苷酸序列的多核苷酸；和/或編碼含有SEQ ID N0.:36-63(例如，36-47、48-63或36-63的任意其它亞組)和/或86中任意一個(gè)所列氨基酸序列或其保守變異的多肽的多核苷酸。本發(fā)明的多核苷酸也包括編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸。類似地，在高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下與上述多核苷酸基本上全長雜交的核酸是本發(fā)明的多核苷酸。
本發(fā)明的多核苷酸也包括編碼多肽的多核苷酸，該多肽包含與天然產(chǎn)生的酪氨酰氨酰基-tRNA合成酶(TyrRS)(例如，SEQ ID N0.:2)至少90%相同的氨基酸序列，和包含A-E族(上述)中兩個(gè)或多個(gè)突變。與上述多核苷酸和/或含有任一上述多核苷酸的保守變異的多核苷酸至少70% (或至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%或更多)相同的多核苷酸也包括在本發(fā)明的多核苷酸中。
在某些實(shí)施方式中，載體(例如，質(zhì)粒、粘粒、噬菌體、病毒等)包含本發(fā)明的多核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方式中，載體是表達(dá)載體。在另一實(shí)施方式中，表達(dá)載體包括可操作地連接于一種或多種本發(fā)明的多核苷酸的啟動(dòng)子。在另一實(shí)施方式中，細(xì)胞含有包括本發(fā)明的多核苷酸的載體。
在另一方面，本發(fā)明提供了化合物的組合物和生產(chǎn)所述化合物的方法。例如，化合物包括，例如，非天然氨基酸(如對(duì)_(炔丙基氧基)_苯丙氨酸(例如，

圖11中的1)，疊氮基染料(如化學(xué)結(jié)構(gòu)4和化學(xué)結(jié)構(gòu)6中所示)，炔基聚乙二醇(例如化學(xué)結(jié)構(gòu)7中所示)，其中η是例如，50和10，000,75和5，000、100和2，000、100和I, 000等之間的整數(shù)等。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，炔基聚乙二醇的分子量為，例如約5，000至約100，OOODa、約20，000至約 50，OOODa、約 20，000 至約 10，OOODa (例如，20，OOODa)。
權(quán)利要求
1.一種含有正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)的真核細(xì)胞，其中，O-RS在真核細(xì)胞中優(yōu)選地氨酰化帶有至少一個(gè)非天然氨基酸的正交tRNA (Ο-tRNA)。
2.如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞，其特征在于，O-RS氨酰化具有至少一個(gè)非天然氨基酸的Ο-tRNA的效率至少相當(dāng)于具有SEQ ID N0.:86中所列氨基酸序列的O-RS的50%。
3.如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞，其特征在于，所述至少一個(gè)非天然氨基酸包括兩種或多種非天然氨基酸。
4.如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞，其特征在于，所述O-RS或其部分由SEQID N0.:3_19中任一所列多核苷酸序列或它們的互補(bǔ)多核苷酸序列編碼。
5.如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞，其特征在于，所述O-RS包含SEQID N0.:36-47或86中所列氨基酸序列或它們的保守變異。
6.如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞，其特征在于，所述O-RS氨酰化具有至少一個(gè)非天然氨基酸的Ο-tRNA比O-RS氨酰化具有天然氨基酸的Ο-tRNA至少更有效10倍。
7.如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞，其特征在于，所述O-RS包含與天然產(chǎn)生的酪氨酰氨酰基-tRNA合成酶(TyrRS)的氨基酸序列至少90%相同的氨基酸序列，并包含兩種或多種選自下組的氨基酸: A)與大腸桿菌TyrRS的Tyr37相對(duì)應(yīng)位置上的纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸或蘇氨酸； B)與大腸桿菌TyrRS的Aspl82相對(duì)應(yīng)位置上的蘇氨酸、絲氨酸、精氨酸或甘氨酸； D)與大腸桿菌TyrRS的Phel83相對(duì)應(yīng)位置上的甲硫氨酸或酪氨酸；和 E)與大腸桿菌TyrRS的Leul86相對(duì)應(yīng)位置上的絲氨酸或丙氨酸。
8.如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞，其特征在于，所述O-RS來自非真核生物。
9.如權(quán)利要求8所述的細(xì)胞，其特征在于，所述非真核生物是大腸桿菌或嗜熱脂肪芽孢桿菌。
10.如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞，其特征在于，所述真核細(xì)胞是酵母細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、藻類細(xì)胞、真菌細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞。
11.如權(quán)利要求10所述的細(xì)胞，其特征在于，所述細(xì)胞是釀酒酵母細(xì)胞。
12.如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞，其特征在于，與天然氨基酸相比，所述O-RS對(duì)于至少一個(gè)非天然氨基酸具有一種或多種改進(jìn)或增強(qiáng)的酶性質(zhì)，該性質(zhì)選自:較高Km、較低Km、較高krat、較低 kMt、較低 kcat/km、較高 kcat/km0
13.如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞，其中，所述至少一個(gè)非天然氨基酸選自:對(duì)-乙酰基-L-苯丙氨酸、對(duì)-碘代-L-苯丙氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、對(duì)-炔丙基氧基苯丙氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、0-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、三-O-乙酰基-GlcNAc β -絲氨酸、L-多巴、氟化苯丙氨酸、異丙基-L-苯丙氨酸、對(duì)-疊氮基-L-苯丙氨酸、對(duì)-酰基-L-苯丙氨酸、對(duì)-苯甲酰基-L-苯丙氨酸、L-磷酸絲氨酸、膦酰基絲氨酸、膦酰基酪氨酸、對(duì)-溴苯丙氨酸、對(duì)-氨基-L-苯丙氨酸、異丙基-L-苯丙氨酸、酪氨酸氨基酸的非天然類似物；谷氨酰胺氨基酸的非天然類似物；苯丙氨酸氨基酸的非天然類似物；絲氨酸氨基酸的非天然類似物；蘇氨酸氨基酸的非天然類似物；烷基、芳基、酰基、疊氮基、氰基、鹵素、肼、酰肼、羥基、鏈烯基、炔基、醚、硫醇、磺酰基、硒、酯、硫代酸、硼酸、硼酸鹽、磷酰基、膦酰基、膦、雜環(huán)、烯酮、亞胺、醛、羥胺、酮基或氨基取代的氨基酸或它們的任意組合；具有可光敏化的交聯(lián)劑的氨基酸；自旋標(biāo)記的氨基酸；熒光氨基酸；金屬結(jié)合氨基酸；含金屬的氨基酸；放射性氨基酸；光籠蔽和/或可光致異構(gòu)的氨基酸；含有生物素或生物素-類似物的氨基酸；含酮氨基酸；含有聚乙二醇或聚醚的氨基酸；重原子取代的氨基酸；可化學(xué)切割或可光切割的氨基酸；具有延長側(cè)鏈的氨基酸；含有毒基團(tuán)的氨基酸；糖取代的氨基酸；含有碳-連接糖的氨基酸；具有氧化還原活性的氨基酸；含α -羥基的酸；氨基硫代酸；α，α雙取代的氨基酸；β -氨基酸；除脯氨酸或組氨酸外的環(huán)氨基酸，除苯丙氨酸，酪氨酸或色氨酸外的芳族氨基酸。
14.如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞，其特征在于，還包含至少一個(gè)非天然氨基酸。
15.如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞，還包含正交tRNA(O-tRNA)，其特征在于，O-tRNA識(shí)別選擇密碼子并優(yōu)選地由O-RS氨酰化具有至少一個(gè)非天然氨基酸。
16.如權(quán)利要求15所述的細(xì)胞，其特征在于，所述O-tRNA來自下組的生物非真核生物。
17.如權(quán)利要求16所述的細(xì)胞，其特征在于，所述非真核生物是大腸桿菌或嗜熱脂肪芽孢桿菌。
18.如權(quán)利要求15所述的細(xì)胞，其特征在于，所述O-tRNA介導(dǎo)將至少一個(gè)非天然氨基酸摻入蛋白質(zhì)，其效率相當(dāng)于細(xì)胞加工包含SEQ ID N0.:65中所列多核苷酸序列的核酸而產(chǎn)生tRNA效率的至少50%。
19.如權(quán) 利要求15所述的細(xì)胞，其特征在于，所述O-tRNA在細(xì)胞中通過細(xì)胞加工與SEQID N0.:65相對(duì)應(yīng)的核酸產(chǎn)生，所述O-RS包含選自下組的多肽序列:SEQ ID N0.=36-47,86和它們的保守變異。
20.如權(quán)利要求15所述的細(xì)胞，還包含含有編碼感興趣多肽的多核苷酸的核酸，其中所述多核苷酸含有O-tRNA識(shí)別的選擇密碼子。
21.如權(quán)利要求20所述的細(xì)胞，其特征在于，含有至少一個(gè)非天然氨基酸的感興趣多肽的產(chǎn)率是從多核苷酸缺少選擇密碼子的細(xì)胞獲得感興趣的天然產(chǎn)生多肽產(chǎn)率的至少5%感興趣多妝。
22.如權(quán)利要求20所述的細(xì)胞，其特征在于，所述細(xì)胞在沒有至少一種非天然氨基酸的情況下產(chǎn)生感興趣多肽的產(chǎn)率是至少一種非天然氨基酸存在下多肽產(chǎn)率的小于30%。
23.如權(quán)利要求22所述的細(xì)胞，其特征在于，所述在沒有至少一種非天然氨基酸的情況下生產(chǎn)感興趣多肽的產(chǎn)率是至少一種非天然氨基酸存在下多肽產(chǎn)率的小于5%。
24.如權(quán)利要求20所述的細(xì)胞，其特征在于，所述感興趣多肽包括治療蛋白、診斷蛋白、工業(yè)酶或其部分。
25.如權(quán)利要求24所述的細(xì)胞，其特征在于，所述感興趣多肽包括選自:細(xì)胞因子、生長因子、生長因子受體、干擾素、白介素、炎癥分子、癌基因產(chǎn)物、肽激素、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子、甾類激素受體、促紅細(xì)胞生成素(EPO)、胰島素、人生長激素、α-1抗胰蛋白酶、血管生成抑制素、抗溶血因子、抗體、載脂蛋白、脫輔蛋白質(zhì)、心鈉素、心房鈉尿多肽、心房肽、C-X-C趨化因子、Τ39765、NAP-2、ΕΝΑ-78、Gro_a、Gro_b、Gro_c、IP-10、GCP-2、NAP-4、SDF-U PF4、MIG、降鈣素、c-kit配體、細(xì)胞因子、CC趨化因子、單核細(xì)胞趨化蛋白-1、單核細(xì)胞趨化蛋白_2、單核細(xì)胞趨化蛋白-3、單核細(xì)胞炎癥蛋白-1a、單核細(xì)胞炎癥蛋白-1β、RANTES, 1309、R83915、R91733、HCC1、Τ58847、D31065、Τ64262、CD40、CD40 配體、C-kit 配體、膠原、集落刺激因子(CSF)、補(bǔ)體因子5a、補(bǔ)體抑制劑、補(bǔ)體受體1、細(xì)胞因子、DHFR、上皮嗜中性粒細(xì)胞激活肽-78、GROa/MGSA、GRO β , GRO y , MIP-1 α、ΜΙΡ_1 δ、MCP-1、表皮生長因子(EGF)、上皮嗜中性粒細(xì)胞激活肽、促紅細(xì)胞生成素(EPO)、剝脫性毒素、因子IX、因子VI1、因子VII1、因子X、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)、纖維蛋白原、纖連蛋白、G-CSF、GM-CSF、葡糖腦苷脂酶、促性腺素、生長因子、生長因子受體、Hedgehog蛋白、血紅蛋白、肝細(xì)胞生長因子(HGF)、水蛭素、人血清白蛋白、ICAM-1、ICAM-1受體、LFA-1、LFA-1受體、胰島素、胰島素-樣生長因子(IGF)、IGF-1、IGF-11、干擾素、IFN-a、IFN-β、IFN-Y、白介素、IL-U IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL_8、IL_9、IL-10、IL-1U IL-12、角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子(KGF)、乳鐵蛋白、白血病抑制因子、熒光素酶、Neurturin、嗜中性粒細(xì)胞抑制因子(NIF)、制瘤素Μ、成骨蛋白、癌基因產(chǎn)物、甲狀旁腺激素、PD-ECSF、H)GF、肽激素、人生長激素、多效營養(yǎng)因子、蛋白A、蛋白G、熱源性外毒素A、B或C、松弛素、腎素、SCF、可溶性補(bǔ)體受體1、可溶性1-CAM1、可溶性白介素受體、可溶性TNF受體、生長調(diào)節(jié)素、促生長素抑制素、促生長素、鏈激酶、超抗原、葡萄球菌腸毒素、SEA、SEB、SECU SEC2、SEC3、SED、SEE、留類激素受體、超氧化物歧化酶(S0D)、中毒性休克綜合征毒素、胸腺素α 1、組織纖溶酶原激活物、腫瘤生長因子(TGF)、TGF-a、TGF-β、腫瘤壞死因子、腫瘤壞死因子α、腫瘤壞死因子β、腫瘤壞死因子受體(TNFR)、VLA-4蛋白、VCAM-1蛋白、血管內(nèi)皮生長因子(VEGEF)、尿激酶、Mos、Ras、Raf、Met ；卩53、1&1:、？08、]\^0、扣11、]\^13、1^1、雌激素受體、孕酮受體、睪酮受體、醛固酮受體、0^受體、SCF/c-Kit、CD40L/CD40、VLA-4/VCAM-l、ICAM-1/LFA-1、透明質(zhì)酸苷 /CD44 和皮質(zhì)酮的蛋白或蛋白的一部分。
26.如權(quán)利要求20所述的細(xì)胞，其特征在于，還包含由所述核酸編碼的感興趣多肽或其部分。
27.如權(quán)利要求20所述的細(xì)胞，其特征在于，所述感興趣多肽包含轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白或其部分。
28.如權(quán)利要求27所述的細(xì)胞，其特征在于，所述轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白是轉(zhuǎn)錄激活蛋白。
29.如權(quán)利 要求28所述的細(xì)胞，其特征在于，轉(zhuǎn)錄激活蛋白是GAL4。
30.如權(quán)利要求27所述的細(xì)胞，其特征在于，所述轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白是轉(zhuǎn)錄抑制蛋白。
31.一種真核細(xì)胞，它包含正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)、正交tRNA (O-tRNA)、非天然氨基酸和含有編碼感興趣多肽的多核苷酸的核酸，其中所述多核苷酸含有O-tRNA識(shí)別的選擇密碼子，其中O-RS在真核細(xì)胞中優(yōu)選地氨酰化具有非天然氨基酸的正交tRNA (O-tRNA)，其中所述細(xì)胞在沒有非天然氨基酸的情況下產(chǎn)生感興趣多肽的產(chǎn)率是在非天然氨基酸存在下多肽產(chǎn)率的小于30%。
32.—種真核細(xì)胞，它包含正交tRNA (O-tRNA)，其中所述O-tRNA介導(dǎo)將非天然氨基酸摻入蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)由含有在體內(nèi)O-tRNA識(shí)別的選擇密碼子的多核苷酸編碼。
33.如權(quán)利要求32所述的細(xì)胞，其特征在于，所述O-tRNA介導(dǎo)非天然氨基酸摻入蛋白質(zhì)中，其效率相當(dāng)于與由細(xì)胞加工包含SEQ ID N0.:65中所列序列的多核苷酸而產(chǎn)生的tRNA效率的至少50%。
34.如權(quán)利要求32所述的細(xì)胞，其特征在于，所述O-tRNA包含SEQID N0.:65中所列多核苷酸序列、其細(xì)胞加工形式或它們的保守變異。
35.如權(quán)利要求32所述的細(xì)胞，其特征在于，所述O-tRNA是轉(zhuǎn)錄后修飾的。
36.編碼權(quán)利要求32所述的O-tRNA或其互補(bǔ)多核苷酸的核酸。
37.如權(quán)利要求36所述的核酸，其特征在于，所述核酸含有A框和B框。
38.一種在真核細(xì)胞中包含GAL4蛋白或其部分的組合物，其中所述GAL4蛋白或其部分含有至少一個(gè)非天然氨基酸。
39.一種包含蛋白的組合物，其中所述蛋白包含至少一個(gè)含有至少一個(gè)翻譯后修飾的非天然氨基酸，其中所述至少一個(gè)翻譯后修飾包含一個(gè)糖部分。
40.如權(quán)利要求39所述的組合物，其特征在于，所述至少一個(gè)非天然氨基酸是酮基非天然氨基酸。
41.如權(quán)利要求39所述的組合物，其特征在于，所述至少一個(gè)翻譯后修飾是在體內(nèi)真核細(xì)胞中進(jìn)行的。
42.一種包含蛋白的組合物，其中所述蛋白包含至少一個(gè)非天然氨基酸和至少一個(gè)由真核細(xì)胞在體內(nèi)進(jìn)行的翻譯后修飾，其中所述翻譯后修飾不是由原核細(xì)胞天然進(jìn)行的。
43.如權(quán)利要求42所述的組合物，其特征在于，所述翻譯后修飾包括通過GlcNAc-天冬酰胺連接將寡糖附著到天冬酰胺上。
44.如權(quán)利要求43所述的組合物,其特征在于,所述寡糖是(GlcNAc-Man)2-Man-GlcNAc-GlcNAco
45.如權(quán)利要求42所述的組合物，其特征在于，所述翻譯后修飾包括通過GalNAc-絲氨酸、GalNAc-蘇氨酸、GlcNAc-絲氨酸或GlcNAc-蘇氨酸連接將寡糖附著到絲氨酸或蘇氨酸上。
46.如權(quán)利要求45所述的組合物，其特征在于，所述寡糖包括Gal-GalNAc或Gal-GlcNAc。
47.如權(quán)利要求42所述的組合物，其特征在于，所述翻譯后修飾選自:乙酰化、酰化、月旨質(zhì)-修飾、棕櫚酰化、棕櫚酸酯加成、磷酸化和糖脂-連接修飾。
48.如權(quán)利要求42所述的組合物，其特征在于，所述蛋白含有與治療蛋白、診斷蛋白、工業(yè)酶或其部分的序列至少75%相同的氨基酸序列。
49.如權(quán)利要求48所述的組合物，其特征在于，至少一種，但少于全部的具體氨基酸被非天然氨基酸取代，該具體氨基酸存在于天然產(chǎn)生型的蛋白中。
50.如權(quán)利要求42所述的組合物，其特征在于，所述蛋白含有至少兩個(gè)非天然氨基酸。
51.如權(quán)利要求50所述的組合物，其特征在于，所述蛋白含有至少兩個(gè)不同的非天然氨基酸。
52.如權(quán)利要求42所述的組合物，其特征在于，所述蛋白含有至少三個(gè)非天然氨基酸。
53.如權(quán)利要求42所述的組合物，其特征在于，所述蛋白含有四個(gè)或更多非天然氨基酸。
54.如權(quán)利要求42所述的組合物，其特征在于，所述組合物還包含藥學(xué)上可接受的賦形劑。
55.如權(quán)利要求42所述的組合物，其特征在于，所述組合物包含至少100微克蛋白質(zhì)。
56.如權(quán)利要求42所述的組合物，其特征在于，所述組合物包含至少50微克/升的蛋白。
57.如權(quán)利要求42所述的組合物，其特征在于，所述蛋白含有分泌或定位序列、表位標(biāo)記、FLAG標(biāo)記、聚組氨酸標(biāo)記或GST融合蛋白。
58.—種多肽,它選自:a)包含SEQID N0.:36-47或86中任一所不氨基酸序列的多肽； (b)包含由SEQID N0.:3-19中任一所示多核苷酸序列編碼的氨基酸序列的多肽； (c)與(a)或(b)的多肽的特異性抗體發(fā)生特異性免疫反應(yīng)的多肽； (d)包含與天然產(chǎn)生的酪氨酰氨酰基-tRNA合成酶(TyrRS)的序列至少90%相同的氨基酸序列并含有兩個(gè)或多個(gè)選自下組的氨基酸的多肽:與大腸桿菌TyrRS的Tyr37相對(duì)應(yīng)位置上的纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸或蘇氨酸；與大腸桿菌TyrRS的Aspl82相對(duì)應(yīng)位置上的蘇氨酸、絲氨酸、精氨酸或甘氨酸；與大腸桿菌TyrRS的Phel83相對(duì)應(yīng)位置上的甲硫氨酸或酪氨酸；和與大腸桿菌TyrRS的Leul86相對(duì)應(yīng)位置上的絲氨酸或丙氨酸； (e)包含SEQID N0.:36-47或86中至少20個(gè)連續(xù)氨基酸和兩個(gè)或多個(gè)選自下組的氨基酸取代的多肽:與大腸桿菌TyrRS的Tyr37相對(duì)應(yīng)位置上的纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸或蘇氨酸；與大腸桿菌TyrRS的Aspl82相對(duì)應(yīng)位置上的蘇氨酸、絲氨酸、精氨酸或甘氨酸；與大腸桿菌TyrRS的Phel83相對(duì)應(yīng)位置上的甲硫氨酸或酪氨酸；和與大腸桿菌TyrRS的Leul86相對(duì)應(yīng)位置上的絲氨酸或丙氨酸,其中氨基酸編號(hào)方式與大腸桿菌TyrRS的編號(hào)方式一致；和， (f)包含(a)、(b)、(c)、⑷或(e)的保守變異的氨基酸序列。
59.—種包含權(quán)利要求58所述的多肽和賦形劑的組合物。
60.一種與權(quán)利要求58所述的多肽特異地免疫反應(yīng)的抗體或抗血清。
61.—種多核苷酸,它選自: (a)包括SEQID N0.:3_19或64-85中任一所列的核苷酸序列的多核苷酸； (b)與(a)的多核苷酸序列互補(bǔ)或編碼(a)的多核苷酸序列的多核苷酸； (c)編碼含有SEQID N0.:36-47或86中所列氨基酸序列或其保守變異的多肽的多核苷酸； (d)編碼權(quán)利要求58所述多肽的多核苷酸； (e)基本上以全長核酸與(a)、(b)、(c)或(d)的多核苷酸在高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的核酸； (f)編碼多肽的多核苷酸，所述多肽包含與天然產(chǎn)生的酪氨酰氨酰基-tRNA合成酶(TyrRS)的序列至少90%相同的氨基酸序列并含有兩個(gè)或多個(gè)選自下組的突變:與大腸桿菌TyrRS的Tyr37相對(duì)應(yīng)位置上的纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸或蘇氨酸；與大腸桿菌TyrRS的Aspl82相對(duì)應(yīng)位置上的蘇氨酸、絲氨酸、精氨酸或甘氨酸；與大腸桿菌TyrRS的Phel83相對(duì)應(yīng)位置上的甲硫氨酸或酪氨酸；和與大腸桿菌TyrRS的Leul86相對(duì)應(yīng)位置上的絲氨酸或丙氨酸； (g)與(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)的多核苷酸至少98%相同的多核苷酸;和， (h)包含(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)或(g)的保守變異的多核苷酸。
62.—種包含權(quán)利要求61所述的多核苷酸的載體。
63.如權(quán)利要求62所述的載體，其特征在于，所述載體包括質(zhì)粒、粘粒、噬菌體或病毒。
64.如權(quán)利要求62所述的載體，其特征在于，所述載體是表達(dá)載體。
65.—種包含權(quán)利要求62所述載體的細(xì)胞。
66.一種生產(chǎn)在真核細(xì)胞中優(yōu)選氨酰化具有非天然氨基酸的正交tRNA的正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)的方法，該方法包括:(a)將第一種類真核細(xì)胞群體在非天然氨基酸存在下進(jìn)行正選擇，其中真核細(xì)胞各包括:i)氨酰基-tRNA合成酶(RS)文庫的一員，ii)正交tRNA (O-tRNA)，iii)編碼正選擇標(biāo)記的多核苷酸，和iv)編碼負(fù)選擇標(biāo)記的多核苷酸；其中正選擇中存活的細(xì)胞包含在非天然氨基酸存在下氨酰化正交tRNA (O-tRNA)的活性RS ;和， (b)將正選擇中存活的細(xì)胞在沒有非天然氨基酸的情況下進(jìn)行負(fù)選擇，以清除氨酰化具有天然氨基酸的O-tRNA的活性RS，從而提供了優(yōu)選地氨酰化具有非天然氨基酸的O-tRNA 的 O-RS。
67.如權(quán)利要求66所述的方法，其特征在于，所述編碼正選擇標(biāo)記的多核苷酸可操作地連接于效應(yīng)元件，細(xì)胞還包含:a)編碼從效應(yīng)元件調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白和b)包含至少一個(gè)選擇密碼子的多核苷酸； 其特征還在于，通過氨酰化具有非天然氨基酸的O-tRNA將非天然氨基酸摻入轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白中，導(dǎo)致正選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄。
68.如權(quán)利要求67所述的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白是真核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白。
69.如權(quán)利要求67所述的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白是轉(zhuǎn)錄激活蛋白，所述選擇密碼子是琥珀終止密碼子。
70.如權(quán)利要求69所述的方法，其特征在于，所述琥珀終止密碼子位于編碼轉(zhuǎn)錄激活蛋白的DNA結(jié)合域的部分多核苷酸中或基本上在其附近。
71.如權(quán)利要求69所述的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)錄激活蛋白是GAL4。
72.如權(quán)利要 求66所述的方法，其特征在于，所述正選擇標(biāo)記為生長提供營養(yǎng)添加劑，在缺乏營養(yǎng)添加劑的培養(yǎng)基中進(jìn)行選擇。
73.如權(quán)利要求72所述的方法，其特征在于，所述編碼正選擇標(biāo)記的多核苷酸是his3、ura3> leu2、lys2 或 IacZ 基因。
74.如權(quán)利要求73所述的方法，其特征在于，所述his3基因編碼咪唑甘油磷酸脫氫酶，通過提供3-氨基三唑(3-AT)檢測(cè)脫氫酶。
75.如權(quán)利要求67所述的方法，其特征在于，所述正選擇標(biāo)記在合適的反應(yīng)物的存在下發(fā)熒光或催化發(fā)光反應(yīng)。
76.如權(quán)利要求75所述的方法，其特征在于，通過熒光激活細(xì)胞分選(FACS)或通過發(fā)光檢測(cè)正選擇標(biāo)記的產(chǎn)物。
77.如權(quán)利要求66所述的方法，其特征在于，所述正選擇標(biāo)記包含基于親和力的篩選 T 己 O
78.如權(quán)利要求66所述的方法，其特征在于，所述編碼正選擇標(biāo)記的多核苷酸包含選擇密碼子。
79.如權(quán)利要求67所述的方法，其特征在于，所述編碼負(fù)選擇標(biāo)記的多核苷酸可操作地連接于效應(yīng)元件，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白從該效應(yīng)元件介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄； 其特征還在于，通過氨酰化具有天然氨基酸的O-tRNA將天然氨基酸摻入轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白中，導(dǎo)致負(fù)選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄。
80.如權(quán)利要求66所述的方法，其特征在于，所述編碼負(fù)選擇標(biāo)記的多核苷酸包含ura3基因，在含有5-氟乳清酸(5-F0A)的培養(yǎng)基上完成負(fù)選擇。
81.如權(quán)利要求66所述的方法，其特征在于，用于負(fù)選擇的所述培養(yǎng)基含有選擇或篩選劑，可以被負(fù)選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)化為可檢測(cè)的物質(zhì)。
82.如權(quán)利要求81所述的方法，其特征在于，所述可檢測(cè)物質(zhì)是有毒物質(zhì)。
83.如權(quán)利要求66所述的方法，其特征在于，所述負(fù)選擇標(biāo)記在合適的反應(yīng)物的存在下發(fā)熒光或催化發(fā)光反應(yīng)。
84.如權(quán)利要求83所述的方法，其特征在于，通過熒光激活細(xì)胞分選(FACS)或通過發(fā)光檢測(cè)負(fù)選擇標(biāo)記的產(chǎn)物。
85.如權(quán)利要求66所述的方法，其特征在于，所述負(fù)選擇標(biāo)記包含基于親和力的篩選 T 己 O
86.如權(quán)利要求66所述的方法，其特征在于，所述編碼負(fù)選擇標(biāo)記的多核苷酸包含選擇密碼子。
87.如權(quán)利要求86所述的方法，其特征在于，所述選擇密碼子包括琥珀密碼子、赭石密碼子或乳白終止密碼子。
88.如權(quán)利要求66所述的方法，其特征在于，相同多核苷酸編碼正選擇標(biāo)記和負(fù)選擇 標(biāo)記。
89.如權(quán)利要求66所述的方法，其特征在于，所述編碼正選擇標(biāo)記的多核苷酸包含至少兩個(gè)選擇密碼子。
90.如權(quán)利要求66所述 的方法，其特征在于，所述編碼負(fù)選擇標(biāo)記的多核苷酸包含至少兩個(gè)選擇密碼子。
91.如權(quán)利要求66所述的方法，其特征在于，所述編碼正選擇標(biāo)記和負(fù)選擇標(biāo)記的多核苷酸之一或二者各自包含至少兩個(gè)不同的選擇密碼子。
92.如權(quán)利要求66所述的方法，其特征在于，所述編碼正選擇標(biāo)記和負(fù)選擇標(biāo)記的多核苷酸之一或二者各自包含至少兩個(gè)相同的選擇密碼子。
93.如權(quán)利要求66所述的方法，其特征在于，所述非天然氨基酸選自:對(duì)-乙酰基-L-苯丙氨酸、對(duì)-碘代-L-苯丙氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、對(duì)-炔丙基氧基苯丙氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、0-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、三-O-乙酰基-GlcNAc β -絲氨酸、L-多巴、氟化苯丙氨酸、異丙基-L-苯丙氨酸、對(duì)-疊氮基-L-苯丙氨酸、對(duì)-酰基-L-苯丙氨酸、對(duì)-苯甲酰基-L-苯丙氨酸、L-磷酸絲氨酸、膦酰基絲氨酸、膦酰基酪氨酸、對(duì)-溴苯丙氨酸、對(duì)-氨基-L-苯丙氨酸、異丙基-L-苯丙氨酸、酪氨酸氨基酸的非天然類似物；谷氨酰胺氨基酸的非天然類似物；苯丙氨酸氨基酸的非天然類似物；絲氨酸氨基酸的非天然類似物；蘇氨酸氨基酸的非天然類似物；烷基、芳基、酰基、疊氮基、氰基、鹵素、肼、酰肼、羥基、鏈烯基、炔基、醚、硫醇、磺酰基、硒、酯、硫代酸、硼酸、硼酸鹽、磷酰基、膦酰基、膦、雜環(huán)、烯酮、亞胺、醛、羥胺、酮基或氨基取代的氨基酸或它們的任意組合；具有可光敏化的交聯(lián)劑的氨基酸；自旋標(biāo)記的氨基酸；熒光氨基酸；金屬結(jié)合氨基酸；含金屬的氨基酸；放射性氨基酸；光籠蔽和/或可光致異構(gòu)的氨基酸；含有生物素或生物素-類似物的氨基酸；含酮氨基酸；含有聚乙二醇或聚醚的氨基酸；重原子取代的氨基酸；可化學(xué)切割或可光切割的氨基酸；具有延長側(cè)鏈的氨基酸；含有毒基團(tuán)的氨基酸；糖取代的氨基酸；含有碳-連接糖的氨基酸；具有氧化還原活性的氨基酸；含α -羥基的酸；氨基硫代酸；α，α雙取代的氨基酸；β -氨基酸；除脯氨酸或組氨酸外的環(huán)氨基酸，除苯丙氨酸，酪氨酸或色氨酸外的芳族氨基酸。
94.如權(quán)利要求66所述的方法，其特征在于，所述步驟(a)、(b)或(a)和(b)還包括提供數(shù)量不等的失活合成酶，其中數(shù)量不等提供附加水平的選擇或篩選嚴(yán)格性。
95.如權(quán)利要求66所述的方法，還包括將優(yōu)選地氨酰化具有非天然氨基酸的O-tRNA的O-RS進(jìn)行附加正選擇輪。
96.如權(quán)利要求66所述的方法，其特征在于，所述步驟(a)、(b)或(a)和(b)包括可變的選擇或篩選嚴(yán)格性。
97.如權(quán)利要求66所述的方法，其特征在于，所述RS文庫包含來自至少一種非真核生物的氨酰基-tRNA合成酶(RS)的RS。
98.如權(quán)利要求66所述的方法，其特征在于，所述RS文庫來自失活RS。
99.如權(quán)利要求98所述的方法，其特征在于，通過突變活性RS產(chǎn)生所述失活RS。
100.如權(quán)利要求99所述的方法，其特征在于，所述失活RS包含氨基酸結(jié)合口袋和一個(gè)或多個(gè)含有用一種或多種不同氨基酸取代結(jié)合口袋的氨基酸。
101.如權(quán)利要求100所述的方法，其特征在于，所述取代氨基酸是丙氨酸取代的。
102.如權(quán)利要求66所述的方法，其特征在于，所述RS文庫包含突變體RS文庫。
103.如權(quán)利要求102所述的方法，還包括在編碼RS的核酸上進(jìn)行隨機(jī)突變、位點(diǎn)特異性突變、重組、嵌合構(gòu)建或它們的任意組合，從而產(chǎn)生突變體RS文庫。
104.如權(quán)利要求66所述的方法，還包括: (c)分離編碼O-RS的核酸； (d)從核酸中產(chǎn)生一組編碼突變O-RS的多核苷酸；和， (e)重復(fù)步驟(a)和/或(b)，直到獲得優(yōu)選地氨酰化具有非天然氨基酸的O-tRNA的突變O-RS。
105.如權(quán)利要求104所述的方法，還包括步驟(c)-(e)至少進(jìn)行兩次。
106.如權(quán)利要求104所述的方法，其特征在于，步驟(d)包括隨機(jī)誘變、位點(diǎn)特異性誘變、嵌合構(gòu)建、重組或它們的任意組合。
107.由權(quán)利要求66所述的方法產(chǎn)生的0-RS。
108.如權(quán)利要求66所述的方法，其特征在于，通過將第一種類真核細(xì)胞的群體進(jìn)行負(fù)選擇獲得所述Ο-tRNA，其中真核細(xì)胞包含tRNA文庫的一員，以去除含有被對(duì)真核細(xì)胞內(nèi)源性氨酰基-tRNA合成酶(RS)氨酰化的tRNA文庫一員的細(xì)胞，從而提供與第一種類真核細(xì)胞正交的tRNA庫。
109.如權(quán)利要求108所述的方法，其特征在于，所述tRNA文庫包含來自至少一種非真核生物tRNA的tRNA。
110.如權(quán)利要求108所述的方法，其特征在于，所述氨酰基-tRNA合成酶(RS)文庫包含來自至少一種非真核生物的氨酰基-tRNA合成酶(RS)的RS。
111.如權(quán)利要求108所述的方法，其特征在于，所述tRNA文庫包含來自至少一種第一種非真核生物tRNA的tRNA，其特征還在于，所述氨酰基-tRNA合成酶(RS)文庫包含來自至少一種第二種非真核生物的氨酰基-tRNA合成酶(RS)的RS。
112.如權(quán)利要求111所述的方法，其特征在于，所述第一種和第二種非真核生物相同。
113.如權(quán)利要求111所述的方法，其特征在于，所述第一種和第二種非真核生物不同。
114.如權(quán)利要求108所述的方法，其特征在于，所述方法還包括將編碼O-tRNA的核酸和編碼O-RS的核酸引入第二種類真核細(xì)胞中。
115.如權(quán)利要求114所述的方法，其特征在于，所述第一種類是酵母。
116.如權(quán)利要求114所述的方法，其特征在于，所述第二種類選自哺乳動(dòng)物、昆蟲、真菌、藻類和植物。
117.由權(quán)利要求108所述的方法產(chǎn)生的0-tRNA/0-RS對(duì)。
118.如權(quán)利要求66或108所述的方法，其特征在于，所述選擇或篩選包括一種或多種正或負(fù)選擇或篩選，它們選自:氨基酸通透性的改變、翻譯效率的改變和翻譯忠實(shí)性的改變，其特征還在于所述一種或多種改變是基于生物體中一種或多種基因中的突變，在該生物體中正交tRNA-tRNA合成酶對(duì)用于生產(chǎn)蛋白。
119.一種生產(chǎn)在真核細(xì)胞中優(yōu)選地氨酰化具有非天然氨基酸的正交tRNA的正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)的方法，該方法包括: (a)將第一種類真核細(xì)胞群體在非天然氨基酸存在下進(jìn)行正選擇，其中真核細(xì)胞各包括:i)氨酰基-tRNA合成酶(RS)文庫的一員，ii)正交tRNA (O-tRNA)，iii)編碼正選擇標(biāo)記的多核苷酸，和iv)編碼負(fù)選擇標(biāo)記的多核苷酸；其中正選擇中存活的細(xì)胞包含在非天然氨基酸存在下氨酰化正交tRNA (O-tRNA)的活性RS ； (b)將正選擇中存活的細(xì)胞在沒有非天然氨基酸的情況下進(jìn)行負(fù)選擇，以清除氨酰化具有天然氨基酸的O-tRNA的活性RS，從而提供了優(yōu)選地氨酰化具有非天然氨基酸的O-tRNA 的 O-RS, 其中通過將第一種類真核細(xì)胞的群 體進(jìn)行負(fù)選擇獲得所述Ο-tRNA，其中真核細(xì)胞包含tRNA文庫的一員，以去除被對(duì)真核細(xì)胞內(nèi)源性氨酰基-tRNA合成酶(RS)氨酰化的tRNA文庫一員的細(xì)胞，從而提供與第一種類真核細(xì)胞正交的tRNA庫； (c)將編碼所述O-tRNA的核酸和編碼所述O-RS的核酸引入第二種類真核細(xì)胞中， 其中所述第一種類是酵母，所述第二種類選自哺乳動(dòng)物、昆蟲、真菌、藻類和植物。
120.一種在真核細(xì)胞中生產(chǎn)至少一種含有至少一個(gè)非天然氨基酸的蛋白質(zhì)的方法，該方法包括: 在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)含有核酸的真核細(xì)胞，該核酸包含至少一個(gè)選擇密碼子并編碼該蛋白；其中所述培養(yǎng)基含有非天然氨基酸，所述真核細(xì)胞包含: 在細(xì)胞中起作用并識(shí)別選擇密碼子的正交tRNA (O-tRNA);和 優(yōu)選地氨酰化具有非天然氨基酸的O-tRNA的正交氨酰基tRNA合成酶(O-RS)。
121.如權(quán)利要求120所述的方法，其特征在于，所述O-RS氨酰化具有非天然氨基酸的O-tRNA的效率相當(dāng)于具有SEQ ID N0.:86中所列氨基酸序列的O-RS效率的至少50%。
122.如權(quán)利要求120所述的方法，其特征在于，所述O-tRNA包含SEQID N0.:64或65或它們的互補(bǔ)多核苷酸序列，或由細(xì)胞加工而來，或由SEQ ID N0.:64或65編碼。
123.如權(quán)利要求120所述的方法，其特征在于，所述O-RS包含SEQID N0.:36-48或86。
124.如權(quán)利要求120所述的方法，其特征在于，所述非天然氨基酸選自:對(duì)-乙酰基-L-苯丙氨酸、對(duì)-碘代-L-苯丙氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、對(duì)-炔丙基氧基苯丙氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、0-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、三-O-乙酰基-GlcNAc β -絲氨酸、L-多巴、氟化苯丙氨酸、異丙基-L-苯丙氨酸、對(duì)-疊氮基-L-苯丙氨酸、對(duì)-酰基-L-苯丙氨酸、對(duì)-苯甲酰基-L-苯丙氨酸、L-磷酸絲氨酸、膦酰基絲氨酸、膦酰基酪氨酸、對(duì)-溴苯丙氨酸、對(duì)-氨基-L-苯丙氨酸、異丙基-L-苯丙氨酸、酪氨酸氨基酸的非天然類似物；谷氨酰胺氨基酸的非天然類似物；苯丙氨酸氨基酸的非天然類似物；絲氨酸氨基酸的非天然類似物；蘇氨酸氨基酸的非天然類似物；烷基、芳基、酰基、疊氮基、氰基、齒素、肼、酰肼、羥基、鏈烯基、炔基、醚、硫醇、磺酰基、硒、S旨、硫代酸、硼酸、硼酸鹽、磷酰基、膦酰基、膦、雜環(huán)、烯酮、亞胺、醛、羥胺、酮基或氨基取代的氨基酸或它們的任意組合；具有可光敏化的交聯(lián)劑的氨基酸；自旋標(biāo)記的氨基酸；熒光氨基酸；金屬結(jié)合氨基酸；含金屬的氨基酸；放射性氨基酸；光籠蔽和/或可光致異構(gòu)的氨基酸；含有生物素或生物素-類似物的氨基酸；含酮氨基酸；含有聚乙二醇或聚醚的氨基酸；重原子取代的氨基酸；可化學(xué)切割或可光切割的氨基酸；具有延長側(cè)鏈的氨基酸；含有毒基團(tuán)的氨基酸；糖取代的氨基酸；含有碳-連接糖的氨基酸；具有氧化還原活性的氨基酸；含α -羥基的酸；氨基硫代酸；α，α雙取代的氨基酸；β -氨基酸；除脯氨酸或組氨酸外的環(huán)氨基酸，除苯丙氨酸，酪氨酸或色氨酸外的芳族氨基酸。
125.如權(quán)利要求120所述的方法，其特征在于，所述蛋白包括治療蛋白、診斷蛋白、工業(yè)酶或其部分。
126.如權(quán)利要求120所述的方法，其特征在于，所述蛋白包括選自:細(xì)胞因子、生長因子、生長因子受體、干擾素、白介素、炎癥分子、癌基因產(chǎn)物、肽激素、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子、留類激素受體、促紅細(xì)胞生成素(EPO)、胰島素、人生長激素、α-1抗胰蛋白酶、血管生成抑制素、抗溶血因子、抗體、載脂蛋白、脫輔蛋白質(zhì)、心鈉素、心房鈉尿多肽、心房肽、C-X-C趨化因子、Τ39765、NAP-2、ΕΝΑ-78、Gro_a、Gro_b、Gro_c、IP-10、GCP-2、NAP-4、SDF-1、PF4、MIG、降鈣素、c-kit配體、細(xì)胞因子、CC趨化因子、單核細(xì)胞趨化蛋白-1、單核細(xì)胞趨化蛋白-2、單核細(xì)胞趨化蛋白-3、單核細(xì)胞炎癥蛋白-1 α、單核細(xì)胞炎癥蛋白-1 β、RANTES、I309、R83915、R91733、HCCU T58847、D31065、T64262、CD40、CD40 配體、C-kit 配體、膠原、集落刺激因子(CSF)、補(bǔ)體因子5a、補(bǔ)體抑制劑、補(bǔ)體受體1、細(xì)胞因子、DHFR、上皮嗜中性粒細(xì)胞激活肽-78、GROa/MGSA、GROP、GRO Y、MIP-1a ,MIP-1 δ、MCP-1、表皮生長因子(EGF)、上皮嗜中性粒細(xì)胞激活肽、促紅細(xì)胞生成素(ΕΡ0)、剝脫性毒素、因子IX、因子VI1、因子VII1、因子X、成纖維細(xì)胞生長因子 (FGF)、纖維蛋白原、纖連蛋白、G-CSF、GM-CSF、葡糖腦苷脂酶、促性腺素、生長因子、生長因子受體、Hedgehog蛋白、血紅蛋白、肝細(xì)胞生長因子(HGF)、水蛭素、人血清白蛋白、ICAM-1、ICAM-1受體、LFA-1、LFA-1受體、胰島素、胰島素-樣生長因子(IGF)、IGF-1, IGF-11、干擾素、IFN-a、IFN-β、IFN-Y、白介素、IL-U IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL_8、IL_9、IL-10、IL-1U IL-12、角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子(KGF)、乳鐵蛋白、白血病抑制因子、熒光素酶、Neurturin、嗜中性粒細(xì)胞抑制因子(NIF)、制瘤素Μ、成骨蛋白、癌基因產(chǎn)物、甲狀旁腺激素、PD-ECSF、H)GF、肽激素、人生長激素、多效營養(yǎng)因子、蛋白A、蛋白G、熱源性外毒素A、B或C、松弛素、腎素、SCF、可溶性補(bǔ)體受體1、可溶性1-CAM1、可溶性白介素受體、可溶性TNF受體、生長調(diào)節(jié)素、促生長素抑制素、促生長素、鏈激酶、超抗原、葡萄球菌腸毒素、SEA、SEB、SECU SEC2、SEC3、SED、SEE、留類激素受體、超氧化物歧化酶(S0D)、中毒性休克綜合征毒素、胸腺素a 1、組織纖溶酶原激活物、腫瘤生長因子(TGF)、TGF-a、TGF-β、腫瘤壞死因子、腫瘤壞死因子α、腫瘤壞死因子β、腫瘤壞死因子受體(TNFR)、VLA-4蛋白、VCAM-1蛋白、血管內(nèi)皮生長因子(VEGEF)、尿激酶、Mos、Ras、Raf、Met ；卩53、1&1:、？08、]\^0、扣11、]\^13、1^1、雌激素受體、孕酮受體、睪酮受體、醛固酮受體、0^受體、SCF/c-Kit、CD40L/CD40、VLA-4/VCAM-l、ICAM-1/LFA-l、透明質(zhì)酸苷 /CD44 和皮質(zhì)酮的蛋白或蛋白的一部分。
127.如權(quán)利要求120所述的方法，其特征在于，所述蛋白是轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白或其部分。
128.如權(quán)利要求127所述的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白是轉(zhuǎn)錄激活蛋白。
129.如權(quán)利要求128所述的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)錄激活蛋白是GAL4。
130.如權(quán)利要求127所述的方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白是轉(zhuǎn)錄抑制蛋白。
131.由權(quán)利要求120所述的方法生產(chǎn)的蛋白。
132.如權(quán)利要求131所述的蛋白，其特征在于，所述蛋白通過非天然氨基酸進(jìn)一步修飾。
133.如權(quán)利要求131所述的蛋白，其特征在于，至少一個(gè)翻譯后修飾在體內(nèi)修飾所述蛋白，其中所述翻譯后修飾選自:N-糖基化、O-糖基化、乙酰化、酰化、脂質(zhì)-修飾、棕櫚酰化、棕櫚酸酯加成、磷酸化和糖脂-連接修飾。
134.一種生產(chǎn)篩選或選擇轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白的方法，該方法包括: 選擇第一多核苷酸序列，其中該多核苷酸序列編碼核酸結(jié)合域； 將所述第一多核苷酸序列突變?yōu)榘ㄖ辽僖粋€(gè)選擇密碼子，從而提供篩選或選擇多核苷酸序列； 選擇第二多核苷酸序列，其中所述第二多核苷酸序列編碼轉(zhuǎn)錄激活域； 提供包含可操作地連接于第二個(gè)多核苷酸序列的所述篩選或選擇多核苷酸序列的構(gòu)建物；和， 將構(gòu)建物、非天然氨基酸、正交tRNA合成酶(O-RS)和正交tRNA (O-tRNA)引入細(xì)胞中，其中O-RS優(yōu)選地氨酰化具有非天然氨基酸的0-tRNA，O-tRNA響應(yīng)于篩選或選擇多核苷酸序列中的選擇密碼子，識(shí)別選擇密碼子并將非天然氨基酸摻入核酸結(jié)合域中，從而提供篩選或選擇轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白。
135.權(quán)利要求134生產(chǎn)的篩選或選擇轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白。
136.—種在細(xì)胞中生產(chǎn)含有至少一個(gè)非天然氨基酸的蛋白的試劑盒，該試劑盒包括:含有編碼O-tRNA的多核苷酸序列和編碼O-RS或O-RS的多核苷酸序列的容器。
137.如權(quán)利要求136所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括至少一種非天然氨基酸。
138.如權(quán)利要求136所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括生產(chǎn)蛋白的說明材料。
全文摘要
本發(fā)明是擴(kuò)展真核生物遺傳密碼。提供了生產(chǎn)翻譯組件的組合物和方法，該組件擴(kuò)展了在真核細(xì)胞中遺傳編碼氨基酸的數(shù)量。組件包括正交tRNA、正交氨酰基-tRNA合成酶，tRNA/合成酶的正交對(duì)和非天然氨基酸。也提供了在真核細(xì)胞中用非天然氨基酸生產(chǎn)蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)和方法。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103215228SQ20131006834
公開日2013年7月24日 申請(qǐng)日期2004年4月16日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月17日
發(fā)明者J·W·欽, A·T·克羅普, C·安德森, P·G·舒爾茨 申請(qǐng)人:斯克利普斯研究院