專利名稱：一種綿羊肺炎支原體滅活疫苗的制備工藝的制作方法
技術領域：
本發明涉及獸用生物制品中綿羊肺炎支原體滅活疫苗，具體涉及綿羊肺炎支原體滅活疫苗的制備工藝。
背景技術：
綿羊肺炎支原體(Mycoplasma ovipneumoniae, MO)引起綿羊及山羊非典型肺炎，臨床上以流鼻涕、咳嗽、漸進性消瘦和增生性間質性肺炎為主要特征。1963年Mackay等首次從患肺炎的綿羊肺中分離得到MO，此后在其它多個國家和地區相繼報道MO感染引起綿羊和山羊發病。目前綿羊肺炎支原體在全球范圍內分布，近年來該病的發生率呈逐年上升趨勢，給養羊業造成巨大經濟損失。此外，羊只感染綿羊肺炎支原體后，對其它病原(如多殺性巴氏桿菌、溶血性曼氏桿菌及流感病毒)的易感性明顯增加([l]Dassanayake RP,Shanthalingam S， Herndo n CN, Subramaniam R, Lawrence PK, Bavananthasivam J,Cassirer EF, Haldorson GJ, Foreyt WJ, Rurangirwa FR, Knowles DP, Besser TE,Srikumaran S.Mycoplasma ovipneumoniae can predispose bighorn sheep to fatalMannheimia haemolytica pneumonia.Vet Microbiol., 2010, 145(3-4): 354-359.),從而使其危害性更為突出。綿羊肺炎支原體在我國流行同樣十分廣泛，危害嚴重([2]郭晗，儲岳峰，趙萍，高鵬程，賀英，馮曉明，樊祜卿，逯忠新.青海省綿羊肺炎支原體的血清學調查.安徽農業科學，2009，37(33): 16391-16409.[3]張萍慧，郝永清，張愛榮，范利霞，白龍.綿羊肺炎支原體的分離與鑒定.畜牧與飼料科學，2010，31(1):142-143.[4]王華，楊發龍，王永，湯承.四川省山羊支原體性肺炎流行病學調查，中國畜牧獸醫，2011，38(1): 210-213.)，對該病的綜合防治迫在眉睫。針對綿羊肺炎支原體，采用藥物治療可收到一定效果，但不易根治本病，且存在藥物殘留、對肉質的影響及用藥后易產生耐藥株等一系列問題。因此，研制安全有效的疫苗，實施預防免疫是防控MO感染最為有效的方法。在疫苗研制方面，由于支原體的基因組較小，生物合成能力較弱，免疫原性較差，在實際應用中保護率低，一直是生產中需要解決的問題。此外，影響疫苗免疫效果的關鍵在于疫苗的制備工藝，其中抗原內毒素的含量和佐劑的選用對疫苗質量的影響很大。為了提高疫苗的安全性，必須降低抗原內毒素的含量；為了提高抗原的免疫原性，必須在抗原中添加佐劑以增強其誘導免疫反應的能力([5]CuplaR K, Relyve E H, Lindblad E B, et al.Adjuvant balance between luxieity andadjuvanlicity[J].Vaccine, 1993，11: 293-306)。佐劑的種類很多，不同的佐劑免疫增強效力有所不同。目前未見制備綿羊肺炎支原體滅活疫苗去除抗原內毒素及不同佐劑免疫輔佐效力評價的報道。

發明內容
鑒于現有技術的不足，本發明的目的是改良綿羊肺炎支原體滅活疫苗的制備工藝，制備一種安全有效的綿羊肺炎支原體滅活疫苗。本發明使抗原內毒素含量大大降低，提高了疫苗安全性。另外，本發明還篩選到理想的綿羊肺炎支原體高效滅活疫苗佐劑。疫苗免疫羊只后，抗體產生早、效價高、持續時間長，可有效防控綿羊肺炎支原體感染。


圖1綿羊肺炎支原體滅活疫苗免疫羊血清抗體效價
具體實施例方式本發明的目的是通過以下技術方案實現的，一種綿羊肺炎支原體滅活疫苗的制備工藝，包括以下步驟:
1.抗原制備
(I)培養基的制備
采用改良Thiaucourt’ S培養基。培養基成分如下:PPLO肉湯21.0 g，新鮮酵母浸出液100 mL,滅活馬血清200 mL, 0.5g/ml的葡萄糖2ml, 0.5g/mL的丙酮酸鈉8 ml, 0.5%酹紅3.2 ml，10000U/mL青霉素10 ml，醋酸鉈0.1 g，用去離子水補足到1000 mL，調節pH值7.6 7.8，經0.22Mm細菌濾器過濾除菌后分裝，于4°C保存備用。(2)綿羊肺炎支原體的增殖
取綿羊肺炎支原體凍干菌種加入I mL改良Thiaucourt’ s培養基溶解，將I mL菌液接入10 mL改良Thiaucourt’ s培養基，37 C。160 rpm搖床培養48 h (培養基顏色由紅色逐漸變成橙黃色，菌液澄清透亮、無菌膜、無混濁現象)時收獲；將第一代培養物按3%接種量接種于改良Thiaucourt’ s培養基，置于37 °C條件下160 r/min空氣浴搖床培養20h,連續傳代至第4代,測定其活菌滴度即顏色變化單位(color chang unite, (XU) ([5]Loens K, Mackay W G，Scott C，et al.Amulticenter pilot external quality assessmentprogramme to assess the quality of molecular detection of Chlamydophilapneumonia and Mycoplasma pneumonia.J Microbiol Meth.2010)。

(3)綿羊肺炎支原體培養物的濃縮
取綿羊肺炎支原體培養物12000rpm離心30min，菌體用pH7.2 0.15mol/L的PBS重懸，將濃度調整至IO9 CCU/mL。(4)抗原滅活及內毒素的去除
將濃縮后的培養物置60 °C水浴I h，加入0.05%甲醛(v/v)及終濃度0.02%的重鉻酸鉀溶液，置37 0C 160 r/min空氣浴搖床24h，進行滅活和去除內毒素。(5)滅活檢驗
隨機抽樣滅活的綿羊肺炎支原體，分別接種改良Thiaucourt’s培養基2支，置37 V，160 r/min空氣浴搖床培養3日，無支原體生長者為滅活完全。2.疫苗配制
采用一步乳化法，制備成油包水型乳劑疫苗
水相成分:向綿羊肺炎支原體滅活抗原中加入萬分之一的硫柳汞溶液。水相成分占疫苗總量的30% 35%。油相成分:ISA_760油佐劑，油相成分占疫苗總量的65% 70%。乳化方法:將ISA-760佐劑在高速攪拌器中緩慢攪拌乳化1_2 min，然后再取抗原緩慢加入，快速攪拌直至乳化完全，疫苗抗原終濃度為IO9 CCU/mL，乳化成粘性的油包水油乳劑滅活苗。3.疫苗的物理性狀檢驗及無菌檢驗該疫苗為油包水型，外觀呈乳白色，3000rpm離心15min不分層。用出口內徑為1.2mm的ImL細管，吸取25°C的疫苗lmL，令其垂直自然流出0.4mL的時間為4秒。無菌檢驗按中華人民共和國獸藥典(2005版)附錄15頁進行，均無細菌生長。4.比較試驗證實ISA-760佐劑制備的滅活疫苗比白油佐劑、ISA-206佐劑及Buonavoglial’s佐劑制備的滅活疫苗的免疫抗體及達到高峰時間均提早一周,抗體水平高I 2個滴度，且持續時間長(詳見實施例2)。因此，ISA-760是理想的綿羊肺炎支原體高效滅活疫苗佐劑。實施例1抗原內毒素的測定、疫苗安全檢驗及效力檢驗 (O內毒素的測定
采用動態濁度法測定綿羊肺炎支原體滅活抗原內毒素含量，結果顯示重鉻酸鉀處理后，抗原內毒素含量大大下降。未用重鉻酸鉀處理的抗原內毒素含量為912 EU/mL，經重鉻酸鉀處理的抗原內毒素含量僅為38 EU/mL,也就是說,經重絡酸鉀處理后,抗原內毒素含量降低了 24倍，提高了疫苗的安全性。(2)安全檢驗
5月齡左右健康成都麻羊5只(用MO間接血凝診斷試劑盒測定其無抗體，用鼻腔棉拭子提取DNA，PCR鑒定無MO)，頸部肌肉注射疫苗6ml/只。觀察30日，無食欲減退、精神沉郁、體溫反應、注射部位炎癥等不良反應，且全部健活。(3)效力檢驗
12月齡健康山羊10只，分別檢測MO抗原和抗體均為陰性，隨機分為兩組，免疫組和對照組各5只。免疫組頸部肌肉注射疫苗3mL/只，對照組頸部肌肉注射生理鹽水3mL/只。免疫后30日，免疫組和對 照組山羊氣管注射MO培養物IOmL/只，觀察30日。對照組全部發病，免疫羊保護4只。實施例2疫苗佐劑的篩選
選取滅活疫苗常用的佐劑:白油佐劑、ISA-206佐劑、Buonavoglial’ s佐劑及ISA-760佐劑分別與滅活抗原配制成疫苗，免疫健康成年家兔，通過檢測其血清抗體水平，評價佐劑對疫苗的輔佐效力，篩選出理想的滅活疫苗佐劑。方法:
1.抗原制備:抗原的制備按照具體實施方式
所述的方法進行。2.滅活疫苗的配制:
(I)白油佐劑滅活疫苗的制備:按抗原體積加入終濃度為3%的滅菌吐溫-80，邊加邊攪拌，至完全溶解，制成滅活疫苗水相。水相與白油佐劑的體積比為1:1。將白油佐劑在高速攪拌器中緩慢攪拌乳化I 2 min，然后再取相同體積的水相緩慢加入，直至乳化完全。(2)ISA_206佐劑滅活疫苗的制備:將抗原和佐劑在33°C孵育15 min之后，將ISA-206佐劑在磁力攪拌器中進行攪拌，再將抗原按質量比1:1加入佐劑中進行乳化，加速攪拌10 min，乳化成水包油包水型雙向油乳劑滅活疫苗。(3) Buonavoglial’ s佐劑滅活疫苗的制備:按Domenico等([6])介紹的方法配制。(4) ISA-760佐劑滅活疫苗的制備:按照具體實施方式
所述的疫苗配制方法進行。以上4種佐劑疫苗的抗原終濃度均為IO9 (XU/mL。疫苗物理性狀檢驗和無菌檢驗按《中國獸藥典》進行。結果顯示，這4種佐劑制備的滅活疫苗其物理外觀、粘稠度、穩定性、無菌檢驗等指標均符合要求。3.免疫接種及血清抗體檢測:每種疫苗免疫家兔3只，每只家兔頸背部皮下分2點注射，每點注射2mL。在免疫后1、2、3、4、5、6、7、8、9周分別經耳緣靜脈采血，分離血清，采用MO正向間接血凝診斷試劑盒測定血清抗體水平。結果:
用MO間接血凝試劑盒測定MO滅活疫苗免疫家兔后的血清效價，抗體消長規律見表I。ISA-206佐劑和白油佐劑制備滅活疫苗免疫家兔后第4周達到抗體高峰(4.33 lg2±0.57lg2, 5.00 lg2±0.00 lg2)，免疫后第 9 周下降約 I 個滴度;ISA_760 和 Buonavoglial’ s 佐劑制備的滅活疫苗免疫家兔后第3周到達抗體高峰(5.67 lg2±0.70 lg2，6.00 lg2±0.00lg2)，免疫后第9周維持抗體高峰(6.00 lg2±0.00 lg2,6.00 lg2±1.00 lg2)。利用統計軟件SPSS 18.0對4種佐劑MO滅活疫苗對MO免疫輔佐效力的影響進行統計分析，結果顯示，ISA-206佐劑和白油佐劑、ISA-760佐劑、Buonavoglial’s佐劑制備的MO滅活疫苗對MO免疫輔佐效力的影響差異顯著Gd < 0.05)；ISA-206佐劑和白油佐劑制備的兩種MO滅活疫苗對MO免疫輔佐效力影響差異不顯著Gd > 0.05) ；ISA-760佐劑和Buonavoglial’ s佐劑制備的兩種MO滅活疫苗對MO免疫輔佐效力的影響差異顯著Gd < 0.05);綜上所述，ISA-760佐劑為制備MO滅活疫苗的理想佐劑。
權利要求
1.一種綿羊肺炎支原體滅活疫苗的制備工藝，其特征在于操作步驟如下: A.抗原制備 (1)培養基的制備 采用改良Thiaucourt’ s培養基；培養基成分如下:PPL0肉湯21.0 g，新鮮酵母浸出液100 mL,滅活馬血清200 mL, 0.5g/ml的葡萄糖2ml, 0.5g/mL的丙酮酸鈉8 ml, 0.5%酹紅3.2 ml，10000U/mL青霉素10 ml，醋酸鉈0.1 g，用去離子水補足到1000 mL，調節pH值.7.6 7.8，經0.22Mm細菌濾器過濾除菌后分裝，于4°C保存備用； (2)綿羊肺炎支原體的增殖 取綿羊肺炎支原體凍干菌種加入I mL改良Thiaucourt’s培養基溶解，將I mL菌液接Λ 10 mL改良Thiaucourt’ s培養基，37°C 160 rpm搖床培養48 h (培養基顏色由紅色逐漸變成橙黃色，菌液澄清透亮、無菌膜、無混濁現象)時收獲；將第一代培養物按3%接種量接種于改良Thiaucourt’ s培養基，置于37 °C條件下160 r/min空氣浴搖床培養20 h，連續傳代至第4代,測定其活菌滴度即顏色變化單位(color chang unite, (XU)； (3)綿羊肺炎支原體培養物的濃縮 取綿羊肺炎支原體培養物12000rpm離心30min，菌體用pH7.2 0.15mol/L的PBS重懸，將濃度調整至109(XU/mL ； (4)抗原滅活及內毒素的去除 將濃縮后的培養物置60 °C水浴I h，加入0.05%甲醛(v/v)及終濃度0.02%的重鉻酸鉀溶液，置37 0C 160 r/min空氣浴搖床24h，進行滅活和去除內毒素； (5)滅活檢驗 隨機抽樣滅活的綿羊肺炎支原體，分別接種改良Thiaucourt’s培養基2支，置37 V,.160 r/min空氣浴搖床培養3日，無支原體生長者為滅活完全； B.疫苗配制 采用一步乳化法，制備成油包水型乳劑疫苗 水相成分:向綿羊肺炎支原體滅活抗原中加入萬分之一的硫柳汞溶液，水相成分占疫苗總量的30% 35% ； 油相成分:ISA-760油佐劑，油相成分占疫苗總量的65% 70% ； 乳化方法:將ISA-760佐劑在高速攪拌器中緩慢攪拌乳化1-2 min，然后再取抗原緩慢加入，快速攪拌直至乳化完全，疫苗抗原終濃度為IO9 CCU/mL，乳化成粘性的油包水油乳劑滅活苗； C.疫苗的物理性狀檢驗及無菌檢驗 該疫苗為油包水型，外觀呈乳白色，3000rpm離心15min不分層；用出口內徑為1.2mm的ImL細管，吸取25°C的疫苗lmL，令其垂直自然流出0.4mL的時間為4秒； 無菌檢驗按中華人民共和國獸藥典(2005版)附錄15頁進行，均無細菌生長。
全文摘要
本發明一種綿羊肺炎支原體滅活疫苗的制備工藝，改良了綿羊肺炎支原體滅活疫苗的制備工藝，提供了一種綿羊肺炎支原體滅活疫苗的制備方法。本發明所述的方法篩選到理想的綿羊肺炎支原體高效滅活疫苗佐劑，并使抗原內毒素含量大大降低，提高了疫苗安全性。疫苗免疫羊只后，抗體產生早、效價高、持續時間長，可有效防控綿羊肺炎支原體感染。
文檔編號C12N1/36GK103110583SQ20131006838
公開日2013年5月22日 申請日期2013年3月5日 優先權日2013年3月5日
發明者湯承, 岳華, 費磊 申請人:西南民族大學