專利名稱：以赤石脂為載體的固定化脂肪酶的制備方法
技術領域：
本發明涉及固定化脂肪酶技術領域，特別涉及以赤石脂為載體的固定化脂肪酶的制備方法。
背景技術：
脂肪酶(lipase，EC3.1.1.3)是一類特殊的?；饷福軌蛟谟?水界面上催化酯水解、酯合成、酯交換等化學反應及高聚物合成和立體異構拆分等有機合成反應，并且在強烈脫水和有機體系中能保持高活性、高穩定性和高區域、立體選擇性，因此被廣泛應用于油脂水解、油脂改性、皮革加工、造紙工業、洗滌劑工業、制藥工業、食品加工、生物能源等方面有著很大的應用潛力，是目前被廣泛研究的一種酶催化劑。然而，在實際使用過程中，游離酶即使在最適反應條件下也存在易失活、催化反應不穩定、與產物分離困難或分離成本高等缺點。另外，脂肪酶酶制劑一般是通過微生物發酵產生，或者是從動物、植物體內提取的，分離純化成本高，導致酶的生產價格較高，加上游離酶很難重復利用，導致酶制劑的使用成本提高，從而限制了游離酶在工業生產中大規模的應用。固定化酶指經物理或化學方法處理后，使酶變成不易隨水流失即運動受限制，而又能發揮催化作用的酶制劑。與游離酶相比，固定化酶的優點有:可多次使用，且酶的穩定性提高；反應完成后，固定化酶易與底物和產物分離，而且酶活力降低較少，這樣就降低了生產成本；反應條件易于控制，有利于自動化生產。固定化酶通常所用的載體有活性炭、硅藻土、高嶺土、大孔樹脂、層狀硅酸鹽、改性硅膠、氧化鋁、殼聚糖、纖維素、聚乙烯醇、聚乙烯丙烯膠、卡拉膠、海藻酸納、磁性淀粉微球、分子篩以及復合二氧化硅等。酶的固定化方法常 用的是:吸附法、共價結合法、交聯法和包埋法。在此基礎上還出現了上述方法的結合法等。吸附法制備的固定化酶，酶的活性中心不易被破壞而且酶高級結構變化較少，能較好的保持酶的催化活力，但酶與載體之間的結合力較弱，酶容易從載體上脫落下來，而包埋法 采用的凝膠聚合物的網格可以阻止酶的泄漏，同時能讓基質滲入和產物擴散出來，通過吸附-包埋法制備固定化酶不僅可以有效保持酶活力，還能提升酶的穩定性。酶固定化研究中，良好的載體是固定化酶成功的關鍵。所以在酶固定化領域，作為固定化載體的篩選和制備就成為了主要研究方向。赤石脂為硅酸鹽類礦物多水高嶺石族多水高嶺石，主要成分為水化硅酸鋁，尚含相當多的氧化鐵等物質，其組成如下:硅42.93%、鋁36.58%、氧化鐵及錳4.85%、鎂及鈣
0.94%、水分14.75%。赤石脂與高嶺土極其相似，具有很強吸附能力。由于目前赤石脂作為一種傳統中藥材，主要在中醫中使用，而利用其作為固定化載體國內外還沒人研究，所以利用赤石脂作為固定化載體固定脂肪酶具有較大的理論和實踐意義；而本方法研究的目的是開發赤石脂的應用領域，并可以增強赤石脂在工業、醫學、環境保護等領域的應用。

發明內容
本發明的目的是提供一種以赤石脂為載體的固定化脂肪酶的制備方法，該方法工藝簡單，操作成本低、穩定性好，具有較高催化活力以及酶活回收率。為了解決上述技術問題，本發明通過下述技術方案得以解決:
(1)赤石脂載體的羥基化處理:按每克赤石脂加入6-8ml鹽酸的比例，將赤石脂浸潰于鹽酸溶液中，并于35-40°C振蕩反應過夜，然后用去離子水洗滌至中性，烘干；
(2)赤石脂載體的硅烷化處理:按每克羥基化處理的赤石脂添加2-4ml石油醚和
0.02-0.04 mL硅烷化試劑的比例，在羥基化處理的赤石脂中加入石油醚和硅烷化試劑，充分混勻后，常溫下放置于搖床中反應3-5 h，待反應結束后，過濾，濾渣分別用石油醚和無水乙醇洗滌3-5次，烘干；
(3)脂肪酶的固定化:按給酶量為40-90mg/g的比例(即每克赤石脂給酶量為40-90mg)向脂肪酶溶液中加入硅烷化赤石脂，密封，在20-40°C下振蕩固定l_5h后，抽濾，濾渣用緩沖液洗滌直至沒有蛋白洗脫下來，冷凍干燥后備用；
(4)赤石脂固定化酶的包埋:按每克赤石脂固定化酶加入10-20ml海藻酸鹽溶液的比例，向其中加入質量百分比濃度為1-3%的海藻酸鹽溶液，充分攪拌均勻。用5號針頭的注射器將溶液逐滴打入到質量百分比濃度為1-2%的氯化鈣溶液中，并在4°C下固化l_3h，抽濾，充分洗滌，然后冷凍干燥，即得到固定化脂肪酶。本發明步驟(I)中鹽酸濃度為l_3mol/L。本發明步驟(2)中硅烷化試劑為甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷、3-氨丙基三乙氧基硅烷、N- ( β -氨乙基 )-Y -氨丙基三乙氧基硅烷中的一種。本發明步驟(3)中脂肪酶溶液為脂肪酶和pH值為3-8的緩沖液混合制得的溶液，其中緩沖液是濃度為0.02-0.05mol/L的磷酸鹽緩沖溶液或醋酸鹽緩沖溶液。緩沖液按常規方法配制，磷酸鹽緩沖溶液由磷酸氫二鈉溶液和磷酸二氫鈉溶液配制而成，醋酸鹽緩沖溶液由醋酸溶液和醋酸鈉溶液配制而成。本發明步驟(4)中所述海藻酸鹽溶液為海藻酸鈉或者海藻酸鈣溶液。本發明中固定化脂肪酶的評價方法如下:
1、脂肪酶活力測定采用橄欖油乳化法。向錐形瓶中加入4ml橄欖油乳化液和5ml磷酸緩沖液，40 V水浴中預熱5min，并設立空白組。加入固定化脂肪酶，混勻，40 V水浴震蕩15min。反應結束后，各錐形瓶中加入15ml的95%乙醇終止反應。待測樣品加入酚酞指示劑后，用0.05mol/L氫氧化鈉標準溶液準確滴定至粉紅色。由滴定消耗氫氧化鈉的量計算出游離酶及固定化酶的酶活。以在pH為7的緩沖液、溫度為40°C的條件下，Imin水解產生I μ mol脂肪酸所需的酶量定義為一個活力單位(U)，酶活力的計算公式如下:
C'AV 000
U = ~~~~~t.ηι
式中:C--標準NaOH溶液濃度(mol/L)；
AV-樣品和空白樣樣品消耗標準NaOH溶液的體積差(mL)； t—反應時間(h)； m—酶的用量(g)。
2、固定化酶酶活回收率計算公式如下:
權利要求
1.一種以赤石脂為載體的固定化脂肪酶的制備方法，其特征在于包括以下步驟: (1)赤石脂載體的羥基化處理:按每克赤石脂加入6-8ml鹽酸的比例，將赤石脂浸潰于鹽酸溶液中，并于35-40°C振蕩反應過夜，然后用去離子水洗滌至中性，烘干； (2)赤石脂載體的硅烷化處理:按每克羥基化處理的赤石脂添加2-4ml石油醚和0.02-0.04 mL硅烷化試劑的比例，在羥基化處理的赤石脂中加入石油醚和硅烷化試劑，充分混勻后，常溫下放置于搖床中反應3-5h，待反應結束后，過濾，濾渣分別用石油醚和無水乙醇洗滌3-5次，烘干； (3)脂肪酶的固定化:按給酶量為40-90mg/g的比例向脂肪酶溶液中加入硅烷化赤石月旨，密封，在20-40°C下振蕩固定l_5h后，抽濾，濾渣用緩沖液洗滌直至沒有蛋白洗脫下來，冷凍干燥后備用； (4)赤石脂固定化酶的包埋:按每克赤石脂固定化酶添加10-20ml海藻酸鹽溶液的比例，在赤石脂固定化酶中加入質量百分比濃度為1-3%的海藻酸鹽溶液，充分攪拌均勻，用5號針頭的注射器將溶液逐滴打入到質量百分比濃度為1-2%的氯化鈣溶液中，并在4°C下固化l_3h，抽濾，充分洗滌，然后冷凍干燥，即得到固定化脂肪酶。
2.根據權利要求1所述以赤石脂為載體的固定化脂肪酶的制備方法，其特征在于:鹽酸濃度為l-3mol/L。
3.根據權利要求1所述以赤石脂為載體的固定化脂肪酶的制備方法，其特征在于:娃燒化試劑為甲基丙稀酸氧基丙基二甲氧基娃燒、3_氛丙基二乙氧基娃燒、N-( β -氛乙基)-Y -氨丙基三乙氧基硅烷中的一種。
4.根據權利要求1所述以赤石脂為載體的固定化脂肪酶的制備方法，其特征在于:脂肪酶溶液為脂肪酶和PH值為3 -8的緩沖液混合制得的溶液，其中緩沖液是濃度為0.02-0.05mol/L的磷酸鹽緩沖溶液或醋酸鹽緩沖溶液。
5.根據權利要求1所述以赤石脂為載體的固定化脂肪酶的制備方法，其特征在于 海藻酸鹽溶液為海藻酸鈉或者海藻酸鈣溶液。
全文摘要
本發明公開了一種以赤石脂為載體的固定化脂肪酶的制備方法，首先對赤石脂分別進行羥基化和硅烷化處理，然后將處理好的赤石脂載體加入到肪酶溶液中，經搖床振蕩吸附固定后，用海藻酸鹽凝膠對吸附了脂肪酶的赤石脂進行包埋，最后冷凍干燥得到赤石脂固定化脂肪酶。本方法采用的赤石脂具有原料易得，價格低廉的特點，同時也具有很好的物理吸附性和表面化學活性，經過改性以及包埋處理后，能顯著提升載體的穩定性，制得的固定化酶酶活力回收率高，穩定性好，而且本發明的工藝簡單，操作成本低，有望推動酶法制備生物柴油的工業化進程。
文檔編號C12N11/10GK103146675SQ20131007006
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月6日 優先權日2013年3月6日
發明者余旭亞, 鄧濤, 游金坤 申請人:昆明理工大學