專利名稱：培養基及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及內皮細胞再生技術領域，具體地涉及培養基及其用途。更具體地，本發明涉及用于體外誘導胚胎干細胞分化為內皮細胞的一組培養基和試劑盒，及其在體外誘導胚胎干細胞分化為內皮細胞中的用途、體外誘導胚胎干細胞分化為內皮細胞的方法，以及內皮細胞或其衍生物。
背景技術：
心血管系統是胚胎發育中首先出現并發揮功能的系統。血管的發生和發育不僅對于胚胎形成中器官的發育和分化十分重要，對于成體的創傷修復和生殖功能也是具有重要意義的。血管發育在一系列病理現象中也有重要作用，如視網膜增殖、衰老相關的退行性斑點、類風濕性關節炎以及迄今仍無有效治療手段的腫瘤發生等。血管內皮細胞裱襯在整個心血管系統的內表面，為單層扁平上皮，是血管壁與血液之間的分界細胞，是形成心血管封閉管道系統的形態基礎。其在組織的動態平衡、纖維蛋白溶解和凝集、血液-組織分子交換、血管收縮調控、正常和腫瘤組織的血管化、以及生理和病理條件下的血細胞的活化和遷移中都發揮了重要作用。目前人們多認為血管內皮細胞除作為血液和組織間物質轉運的屏障外，最主要的生物學功能是使循環血液保持流動狀態，此外血管內皮細胞尚可合成與分泌多種結締組織成分、參與一些物質的代謝及與白細胞相互作用等。上述這些生理過程的發揮都依賴于對血管內皮細胞精密的調控，而失調則導致病理現象的發生。研究決定內皮細胞分化和表型的分子機制對于闡明血管發生發育的原理、對梗 死或損傷組織的血管新生治療以及抗腫瘤治療都有重要的指導意義。人類胚胎干細胞(human embryonic stem cells, hESCs)作為一種具備自我更新和無限增殖潛能的多能性細胞，其向內皮細胞分化的可能性為心血管疾病和四肢缺血的治療提供了令人興奮的前景。近年來，不斷有研究證實，人胚胎干細胞hESCs具有分化成不同發育階段的內皮細胞的能力。通過與小鼠的基質細胞共培養、誘導形成擬胚體(EBs)并添加促血管發育的因子、或與特殊的二維介質的共培養等策略營造內皮發育微環境，已有多個研究小組從hESCs中分化、分離到了內皮細胞。近期的研究結果顯示hESCs來源的內皮細胞能形成新的血管，提高梗死心臟的功能，是細胞替代治療中新的細胞源。雖然取得了這些成果，但是使用EBs (擬胚體)添加內皮相關誘導因子，與基質細胞共培養或者是使用基質膠添加因子來誘導分化產生內皮細胞，一般都會再通過分選的方式獲得相對較純的內皮細胞，之后再擴大培養。但是由于本身使用這些誘導方法產生的內皮細胞的比例及數量就較少，再加之分選之后在體外擴增的倍數有限，也難以用于臨床治療。高效快速的誘導胚胎干細胞向內皮祖細胞及內皮細胞進行分化依然是難以解決的問題。

發明內容
本發明旨在至少解決現有技術中存在的技術問題之一。為此，本發明的一個目的在于提出一種能夠用于體外誘導胚胎干細胞(ESCs)分化為內皮細胞的培養基、試劑盒及方法。根據本發明的一個方面，本發明提供了一組培養基。根據本發明的實施例，該組培養基包括:第一培養基，該第一培養基為添加了胰島素鐵硒傳遞蛋白、BSA、非必需氨基酸和rhBMP-4的IMDM/F12培養基；第二培養基，該第二培養基為添加了胰島素鐵硒傳遞蛋白、BSA、非必需氨基酸、rhVEGF和rhbFGF的MDM/F12培養基；以及第三培養基，該第三培養基為EGM2培養基。發明人驚奇地發現，利用本發明的上述培養基能夠高效快速地誘導ESCs向內皮祖細胞及內皮細胞進行分化，從而能夠有效地制備獲得大量的內皮細胞，進而能夠有效地為ECs (即內皮細胞)應用于心血管疾病和四肢缺血的治療提供了細胞基礎。另外，根據本發明上述實施例的一組培養基還可以具有如下附加的技術特征:根據本發明的一個實施例，該MDM/F12培養基包含:75%的添加了 GlutaMAX -1的IMDM培養基；以及25%的添加了 GlutaMAX -1的F12培養基。其中，在本文中所述的“GlutaMAX -1”表示谷丙氨酸二肽。根據本發明的一個實施例，該第一培養基中包含1%的胰島素鐵硒傳遞蛋白(Insulin-Transferrin-Selenium, ITS)、0.05%BSA (即牛血清白蛋白)、1% 非必需氨基酸(其英文縮寫為“NEAA”)和25ng/ml rhBMP-4 (即重組人骨形態發生蛋白4)。由此，利用該不含血清、成分明確且含有誘導分化因子rhBMP-4的第一培養基，在rhBMP-4合適的濃度及作用時間下能夠高效誘導ESCs向中內胚層進行分化，這是由ESCs來源獲得內皮細胞的基礎。根據本發明的一個實施例，該第二培養基中包含1%胰島素鐵硒傳遞蛋白、0.05%BSA、1%NEAA (非必需氨基酸)、50ng/ml rhVEGF (即重組人血管內皮細胞生長因子)以及50ng/ml rhbFGF (即堿性成纖維細胞生長因子)。由此，利用該不含血清、成分明確且含有對于內皮誘導分化及擴大培養有明顯促進作用的rhVEGF和rhbFGF生長因子的第二培養基，能夠有效地誘導ESCs來源的中內胚層細胞向內皮祖/內皮細胞分化。根據本發明的一 個實施例，進一步包括:第四培養基，該第四培養基為添加了Knockout血清替代物、L-谷氨酰胺、P -巰基乙醇、非必需氨基酸和rhbFGF的D-MEM/F-12培養基；以及第五培養基，該第五培養基為mTeSR培養基。根據本發明的一個實施例，第四培養基中包含20%KnoCkout血清替代物、ImML-谷氨酰胺、0.1mMP-巰基乙醇、1%非必需氨基酸和5ng/ml bFGF。根據本發明的一些實施例，該成分明確，營養豐富，含有能夠維持ESCs (胚胎干細胞)干性的rhbFGF生長因子的第四培養基，能夠與滋養層細胞共同長期培養ESCs并能夠有效維持ESCs的特性。根據本發明的又一方面，本發明還提供了一種用于體外誘導胚胎干細胞分化為內皮細胞的試劑盒。根據本發明的實施例，該試劑盒包含前面所述的本發明的一組培養基。根據本發明的一些實施例，利用本發明的試劑盒，采用其中的培養基培養胚胎干細胞，能夠高效地實現體外誘導胚胎干細胞分化為內皮細胞，從而能夠有效地制備獲得大量的內皮細胞，對于心血管疾病和四肢缺血的治療意義重大。根據本發明的另一方面，本發明還提供了前面所述的一組培養基，或者試劑盒在體外誘導胚胎干細胞分化為內皮細胞中的用途。從而，利用上述一組培養基或試劑盒，能夠有效地實現體外誘導胚胎干細胞分化為內皮細胞，且誘導分化的效率尤其高。根據本發明的再一方面，本發明還提供了一種體外誘導胚胎干細胞分化為內皮細胞的方法。根據本發明的實施例，該方法包括以下步驟:利用前面所述的一組培養基，培養胚胎干細胞。由此，能夠高效快速地誘導ESCs向內皮祖細胞及內皮細胞進行分化，從而能夠有效地制備獲得大量的內皮細胞，其對心血管疾病和四肢缺血的治療意義重大。根據本發明的一個實施例，在本發明的體外誘導胚胎干細胞分化為內皮細胞的方法中，胚胎干細胞來源于人類。根據本發明的一個實施例，在本發明的體外誘導胚胎干細胞分化為內皮細胞的方法中，利用前面所述的一組培養基，培養胚胎干細胞進一步包括:利用該第一培養基對該胚胎干細胞進行第一誘導分化培養，以便獲得經過第一誘導分化培養的細胞；利用該第二培養基對該經過第一誘導分化培養的細胞進行第二誘導分化培養，以便獲得經過第二誘導分化培養的細胞；以及利用該第三培養基對該經過第二誘導分化培養的細胞進行第三誘導分化培養，以便獲得內皮細胞。發明人驚奇地發現，利用上述方法能夠高效快速地誘導ESCs向內皮祖細胞及內皮細胞進行分化，從而能夠有效地制備獲得大量的內皮細胞，進而能夠有效地為ECs應用于心血管疾病和四肢缺血的治療提供了細胞基礎，意義重大。需要說明的是，利用上述本發明的方法體外誘導胚胎干細胞分化為內皮細胞時，第二誘導分化培養階段結束后，已經有內皮祖和內皮細胞產生，即經過第二誘導分化培養的細胞中包含有部分內皮祖和內皮細胞。根據本發明的一個實施例，在本發明的體外誘導胚胎干細胞分化為內皮細胞的方法中，進行該第一誘導分化培養1.5-3天，優選2天。由此，能夠有效促進ESCs向中內胚層分化。根據本發明的另一個實施例，在本發明的體外誘導胚胎干細胞分化為內皮細胞的方法中，進行該第二誘導分化培養為4-8天，優選4.5天。由此，能夠進一步誘導經過第一誘導分化培養的細胞向內皮祖/內皮細胞分化。根據本發明的再一個實施例，在本發明的體外誘導胚胎干細胞分化為內皮細胞的方法中，進行該第三誘導分化培養為3-20天。由此，能夠有效促進經過第二誘導分化培養的細胞向內皮祖/內皮細胞的分化，以及內皮祖/內皮細胞的進一步分化成熟。此外，根據本發明的另一個實施例，經過第三誘導分化培養后，可以繼續利用第三培養基對獲得的內皮細胞進行擴大培養。由此，能夠有效制備獲得大量內皮細胞。根據本發明的一個實施例，在進行該第一誘導分化培養之前，進一步包括:利用該第五培養基將該胚胎干細胞進行預培養，然后依次進行消化和傳代處理。由此，可以有效去除部分滋養層細胞并擴大培養無滋養層培養的ESCs，為后續的誘導分化培養做準備。其中，根據本發明的一個實施例，進行該預培養5-7天。根據本發明的另一個實施例，利用1%的dispase酶進行該消化處理。根據本發明的再一個實施例，按照1:3的比例進行該傳代處理2-3次。由此，經過多次無滋養層的傳代處理后，可以完全去除滋養層細胞，從而能夠避免滋養層細胞對后續誘導分化培養的影響，同時，多次的傳代處理也可以獲得大量ESCs細胞，為進一步誘導分化獲得大量內皮祖/內皮細胞奠定了基礎。根據本發明的一個實施例，在將該胚胎干細胞進行預培養之前，進一步包括:利用該第四培養基將該 胚胎干細胞進行滋養層細胞共培養。由此，能夠在體外條件下長期維持ESCs的特性。此外，根據本發明的另一個實施例，進一步包括將經過滋養層細胞共培養的胚胎干細胞進行消化和傳代處理。由此，可以實現經過滋養層細胞共培養的胚胎干細胞進一步的擴大培養，從而能夠獲得大量的ESCs，以便為后續的誘導分化培養做準備。其中，根據本發明的一個實施例，利用IV型膠原酶進行該消化處理，按照1:3或1:5的比例進行該傳代處理。根據本發明的一個實施例，在進行該第三誘導分化培養之前，進一步包括:將該經過第二誘導分化培養的細胞進行消化和傳代處理。由此，可以避免由于細胞的過度增殖而對誘導分化的效率產生負面影響。其中，根據本發明的一個實施例，利用0.25%的胰酶進行該消化處理。根據本發明的另一個實施例，按照1:2或1:3的比例進行該傳代處理。根據本發明的又一方面，本發明還提供了一種內皮細胞或其衍生物，其是通過前面所述的本發明的體外誘導胚胎干細胞分化為內皮細胞的方法獲得的。根據本發明的實施例，本發明的內皮細胞或其衍生物，能夠有效用于梗死或損傷組織的血管新生、四肢缺血以及抗腫瘤的治療，對于現代醫學的發展意義重大。需要說明的是，本發明的一組培養基以及利用該組培養基體外誘導胚胎干細胞分化為內皮細胞的方法，均是本發明的發明人經過艱苦的創造性勞動和大量的優化工作才完成的。本發明的附加方面和優點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發明的實踐了解到。


本發明的上述和/或附加的方面和優點從結合下面附圖對實施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中:圖1顯示了根據本發明一個實施例，本發明的體外誘導胚胎干細胞分化為內皮細胞的一般方法的流程示意圖；圖2顯示了實施例1中經過第一誘導分化培養的細胞，其干性和中內胚層相關標志基因表達水平的RT-PCR檢測結果以及細胞形態圖，其中，圖2A顯示了干性和中胚層相關標志基因表達水平的RT-PCR檢測結果，圖2B顯示了細胞形態圖；圖3顯示了實施例1中經過第二誘導分化培養的細胞，其內皮細胞相關標志基因表達水平的RT-PCR檢測結果、流式細胞術檢測結果、血管樣結構形成和植物凝集素結合實驗結果以及細胞形態圖，其中，圖3A顯示了內皮細胞相關標志基因表達水平的RT-PCR檢測結果，圖3B顯示了內皮細胞相關標志基因表達水平的流式細胞術檢測結果，圖3C顯示了細胞形態圖，圖3D顯示了血管樣結構形成和植物凝集素結合實驗結果；圖4顯示了實施例1中經過第三誘導分化培養6天獲得的內皮細胞，其內皮細胞相關標志基因表達水平的RT-PCR檢測結果、流式儀檢測結果和細胞形態圖，其中，圖4A是偏成熟內皮細胞相關標志基因表達水平的RT-PCR檢測結果，圖4B是內皮細胞相關標志基因⑶31和KDR表達水平的流式儀檢測結果，圖4C是細胞形態圖。
具體實施例方式下面將結合實施例對本發明的方案進行解釋。本領域技術人員將會理解，下面的實施例僅用于說明本發明，而不應視為限定本發明的范圍。實施例中未注明具體技術或條件的，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件或者按照產品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規產品。—般方法:根據本發明的一些實施例，參照圖1，本發明的體外誘導胚胎干細胞分化為內皮細胞的方法一般包括以下步驟:首先，依次利用第四培養基將胚胎干細胞進行滋養層細胞共培養，以及利用第五培養基將胚胎干細胞進行預培養，然后，利用該第一培養基對該胚胎干細胞進行第一誘導分化培養，以便獲得經過第一誘導分化培養的細胞。接著，利用該第二培養基對該經過第一誘導分化培養的細胞進行第二誘導分化培養，以便獲得經過第二誘導分化培養的細胞。然后，利用該第三培養基對該經過第二誘導分化培養的細胞進行第三誘導分化培養，以便獲得內皮細胞。實施例1參照圖1，采用本發明的體外誘導胚胎干細胞分化為內皮細胞的方法，按照以下步驟培養胚胎干細胞:1、滋養層細胞共培養采用第四培養基，將小鼠成纖維細胞作為滋養層細胞與未分化的人胚胎干細胞細胞(即hESCs，Hl和H9)共培養。其中，第四培養基的基本組成為:78%D-MEM/F-12基本培養基(GIBC0，N0.12400-016)，添加了 20%Knockout 血清替代物(GIBC0，10828)，ImM L-谷氨酰胺(GIBC0, 35050) ,0.1mM^ -巰基乙醇(Invitrogen, 21985-023)，1% 非必需氨基酸(NEAA(英文縮寫)，Invitrogen, 11140-050),以及5ng/ml堿性成纖維細胞生長因子(rhbFGF (英文縮寫)，Millipore, GF003)。經過滋養層細胞共培養后，對hESCs進行觀察，如果需要傳代，則用IV型膠原酶將待傳代的hESCs消化成小的細胞團，之后根據細胞密度按照1:3或者是1:5進行傳代處理。2、預培養然后，將上述經過滋養層細胞共培養，生長狀態良好的hESCs傳代至無飼養層的Matrigel (超純層纖連蛋白，BD，354277)上，用第五培養基即專用的mTeSR培養基(StemCell, #05850)進行培養。待hESCs生長至5_7天時，根據細胞的大小及密度進行消化處理，消化時使用lmg/ml dispase酶(中性蛋白酶,stem cell, 07923)。然后,將經過消化處理的細胞接種至鋪有Matrigel的孔板中，常規靜置培養。誘導分化前將經過預培養的hESCs進行2-3次無滋養層的傳代處理。其中，進行上述傳代處理，主要采用的儀器為:5910型離心機(日本久保田)，顯微鏡(OLYMPUS，CKX31)，具體方法包括:a、棄舊的培養基，用IXPBS洗三次。b、加入lmg/ml dispase酶(stem cell,07923)進行消化處理，并于顯微鏡下觀察細胞，若克隆發生卷邊，則棄dispase酶終止消化，并用I XPBS洗三次(避免用力吹打細胞，防止克隆丟失)。
C、添加入新的mTeSR培養基(Stem Cell, #05850)，并用該培養基輕柔吹打克隆，使得胚胎干細胞(ESCs)克隆從孔板上脫落。其中，要求盡量將所有克隆均吹打下來，并盡量將克隆吹打成均一大小的細胞團塊。d、根據所得細胞密度，按照1:2或者1:3的比例，將上述hESCs克隆接種于含有mTeSR培養基并處理有Matrigel的孔板中，之后將細胞置于37°C，5%C02的培養箱中靜置過夜培養。e、24小時后，根據克隆的大小進行換液處理(即繼續培養)或者下面所述的誘導分
化培養。3、誘導分化培養按照以下步驟，將上述經過預培養及傳代處理的hESCs進行內皮細胞的誘導分化:3.1第一誘導分化培養首先，待上述經過預培養及傳代處理的hESCs貼壁后，根據克隆的大小選擇是否進行內皮細胞的誘導分化。選取合適的孔板，要求孔板中含有盡可能多的大小合適的hESCs克隆(即含十幾至幾十個細胞的克隆)，利用第一培養基對其進行第一誘導分化培養48小時，以便獲得經過第一誘導分化培養的細胞。其中，第一培養基為添加了 1%的胰島素鐵硒傳遞蛋白(ITS (英文縮寫)，GIBC0，41400-045)、0.05%BSA (牛血清白蛋白，GIBCO，11021-029)、1% 非必需氨基酸(NEAA (英文縮寫)，Invitrogen, 11140-050)和 25ng/ml 重組人骨形態發生蛋白 4 (rhBMP-4, RD, 314-BP)的MDM/F12培養基。其中，在本文中所述的“MDM/F12培養基”包含:75%的添加了GlutaMAX -1 的 MDM 培養基(GIBC0，31980)，以及 25% 的添加了 GlutaMAX _I 的 F12 培養基(GIBC0，37165)。3.2第二 誘導分化培養將上述獲得的經過第一誘導分化培養的細胞，棄第一培養基并用PBS洗滌一次，之后利用第二培養基進行第二誘導分化培養4-8天，以便獲得經過第二誘導分化培養的細胞。其中，第二培養基為添加了 1%胰島素鐵硒傳遞蛋白(GIBC0，41400-045)、
0.05%BSA(GIBCO, 11021-029)、1% 非必需氨基酸(Invitrogen, 11140-050)、50ng/ml 重組人血管內皮細胞生長因子(rhVEGF (英文縮寫)，PEPR0TECH，100-20)以及50ng/ml堿性成纖維細胞生長因子(rhbFGF (英文縮寫)，Millipore, GF003)的頂DM/F12培養基。進行第二誘導分化培養4.5天后，經過第二誘導分化培養的細胞生長至接近孔板密度的90%以上。3.3第三誘導分化培養在開始第三誘導分化培養之前，利用0.25%胰酶，將經過第二誘導分化培養的細胞進行消化處理，并按照1:2或者是1:3的比例進行傳代處理。其中，進行消化和傳代處理，主要采用的儀器為:5910型離心機(日本久保田)，顯微鏡(OLYMPUS，CKX31)，具體方法包括:a、棄舊的培養基，用IXPBS洗三次。b、加入0.25%胰酶(AMRESC0，0458)，使用PBS進行配置，之后過濾除菌，4°C保存或者_20°C保存)進行消化處理，并于顯微鏡下觀察細胞，若細胞間隙變大，細胞與孔板之間發生脫離則添加含10%血清的生長培養基(即MDM培養基+10%FBS)，終止消化。
C、收集細胞，于IOOOrpm條件下離心5分鐘。之后棄上清并使用PBS重懸洗滌細胞，以便去除終止消化中使用的血清，然后于IOOOrpm條件下再次離心5分鐘。d、棄上清，用EGM2培養基(Lonza，cc-4176)重懸細胞，并根據細胞密度，按照1:2或者1:3的比例進行接種，然后置于37°C，5%C02的培養箱中靜置過夜培養。e、根據細胞生長情況，選擇進行換液(即繼續培養)或者是傳代處理。然后，利用第三培養基，將上述經過第二誘導分化培養及傳代處理的細胞進行第三誘導分化培養3-20天，以便獲得內皮細胞。其中，第三培養基為EGM2培養基(Lonza, cc-4176)。進行第三誘導分化培養3_6天時，根據細胞密度考慮是否進行傳代處理。其中，進行消化和傳代處理，主要采用的儀器為:5910型離心機(日本久保田)，顯微鏡(OLYMPUS，CKX31)，具體方法包括:a、棄舊的培養基， 用IXPBS洗三次。b、加入0.25%胰酶(AMRESC0，0458)，使用PBS進行配置，之后過濾除菌，4°C保存或者_20°C保存)進行消化處理，并于顯微鏡下觀察細胞，若細胞間隙變大，細胞與孔板之間發生脫離則終止消化。C、收集細胞，于IOOOrpm條件下離心5分鐘。之后棄上清并用PBS重懸細胞，然后于IOOOrpm下離心5分鐘。d、棄上清，用EGM2培養基(Lonza，cc-4176)重懸細胞，并根據細胞密度，按照1:2或者1:3的比例進行接種，然后置于37°C，5%C02的培養箱中靜置過夜培養。此外，當細胞生長狀態良好時，可進一步于第三培養基中進行擴大培養，以便獲得更多的內皮細胞。實施例2分別對實施例1中獲得的經過第一誘導分化培養的細胞、經過第二誘導分化培養的細胞，以及經過第三誘導分化培養6天獲得的內皮細胞，進行流式細胞術和RT-PCR檢測，并于顯微鏡下觀察三個階段中細胞的形態學變化。一、具體檢測方法:1、流式細胞術檢測使用儀器:5910型離心機(日本久保田)，DH-1I旋轉混合儀(寧波新芝公司)，流式儀器(BD，FACSAria)o方法:1.1消化細胞:(I)棄舊的培養基，用IXPBS洗三次。(2)加入0.25%胰酶將待檢測細胞進行消化處理，并于顯微鏡下觀察細胞，若細胞間隙變大，細胞與孔板之間發生脫離則添加入新的終止培養基，終止消化。(3)收集細胞，于IOOOrpm條件下離心5分鐘，之后棄上清并用PBS重懸細胞。1.2標記抗體:根據抗體說明書，將上述獲得的經過消化處理的細胞置于離心管中并將4-7 X IO5細胞重懸于100 ill PBS中，之后添加相應的抗體，即抗人CD31-APC(eBioscience, 17-0319-42)和抗人 CD309-PE(血管內皮生長因子受體 2，VEGFR2/KDR; R&D systems, 560494),然后充分混勻，并將離心管置于旋轉混合儀上進行流式抗體的孵育和標記，時間為40分鐘。1.3 洗抗體:標記完成后，使用1.4ml PBS重懸上述經過抗體標記的細胞，并于IOOOrpm下離心5分鐘。之后棄上清，并使用1.5ml PBS再次重懸細胞,然后于IOOOrpm下離心5分鐘,之后重復該步驟(即棄上清、重懸之后離心)。1.4 重懸:棄上清，利用300-500 U I PBS或者2%多聚甲醛重懸經過上述處理的細胞。1.5流式細胞術檢測按照產品說明書及操作指南，將上述獲得的重懸細胞進行流式細胞術的檢測。2、RT-PCR (實時定量 PCR)檢測2.1RNA 提取使用儀器:離心機(sigma公司，3_18k)。方法:(I)細胞的收集-貼壁細 胞:于離心管中，利用膠原酶或胰酶將待檢測細胞進行消化離心后，PBS洗兩次，再次進行離心后棄上清，然后利用ImlTRIZOL(Invitrogen, 15596018)裂解細胞，之后按照后續步驟進行RNA的提取。(2)將樣品(即經過裂解的細胞)于室溫下靜置5-15分鐘，使核酸蛋白復合物完全分離。(3)每管加入0.2ml氯仿(國藥集團化學試劑有限公司，10006892)蓋上蓋子，劇烈充分搖勻15s，然后于室溫下靜置10分鐘。(4)于4°C，12000g條件下離心15分鐘，RNA溶解在上層的水層里邊，體積大約為50%。(5)將上述離心管中的上層無色水相層輕柔轉移至新的1.5ml離心管中。(6)向新的離心管中加入0.5ml異丙醇(國藥集團化學試劑有限公司，80109292),之后輕柔混勻，室溫放置lOmin。(7)于4°C，12000g條件下離心15分鐘，棄上清，則底部會有白色的RNA沉淀。(8)棄上清，向離心管中加入由DEPC水(無RNA酶的水)配制的75%的酒精(國藥集團化學試劑有限公司，10009292)，重懸RNA，之后于4°C，12000g下離心15分鐘。(9)棄凈上清，靜置5-10min，待酒精揮發且底部RNA剛好變無色時加入10-30 ylDEPC水(無RNA酶的水)，之后進行濃度測定。(10)將提取獲得的RNA于_70°C下保存，備用。2.2反轉錄使用TaKaRa的反轉錄系統，根據操作說明將0.8 y g上述提取獲得的RNA進行20 u I體系的反轉錄。使用儀器:PCR儀(Eppendorff公司，mascercycler),小型臺式離心機(杭州奧盛，K6)具體方法:(I)按照以下配比，將下述各組分充分混勻:
模版RNA 500-800ng (根據實際RNA濃度添加對應的體積)Oligo dT 引物 2.0ii I無RNA 酶的水(RNase Free dH20 (DEPC 水))使液體終體積為 12.0 iU。(2)將上述混合物進行離心，然后置于70°C下lOmin，冰上急冷2min，再離心數秒，使液體集中于離心管管底，以便獲得經過處理的模版RNA。(3)按照以下配比，于離心管中配制反轉錄反應體系:
權利要求
1.一組培養基，其特征在于，包括: 第一培養基，所述第一培養基為添加了胰島素鐵硒傳遞蛋白、BSA、非必需氨基酸和rhBMP-4 的 MDM/F12 培養基； 第二培養基，所述第二培養基為添加了胰島素鐵硒傳遞蛋白、BSA、非必需氨基酸、rhVEGF和rhbFGF的MDM/F12培養基；以及 第三培養基，所述第三培養基為EGM2培養基。
2.根據權利要求1所述的一組培養基，其特征在于，所述IMDM/F12培養基包含: 75%的添加了 GlutaMAX -1的MDM培養基；以及 25%的添加了 GlutaMAX -1的F12培養基。
3.根據權利要求1所述的一組培養基，其特征在于，所述第一培養基中包含1%的胰島素鐵硒傳遞蛋白、0.05%BSA、1%非必需氨基酸和25ng/ml rhBMP-4。
4.根據權利要求1所述的一組培養基，其特征在于，所述第二培養基中包含1%胰島素鐵硒傳遞蛋白、0.05%BSA、1%非必需氨基酸、50ng/ml rhVEGF以及50ng/ml rhbFGF。
5.根據權利要求1所述的一組培養基，其特征在于，進一步包括: 第四培養基，所述第四培養基為添加了 Knockout血清替代物、L-谷氨酰胺、P -巰基乙醇、非必需氨基酸和rhbFGF的 D-MEM/F-12培養基；以及第五培養基，所述第五培養基為mTeSR培養基， 其中，所述第四培養基中包含20%Knockout血清替代物、ImM L-谷氨酰胺、0.1mMP-巰基乙醇、1%非必需氨基酸和5ng/ml rhbFGF。
6.一種用于體外誘導胚胎干細胞分化為內皮細胞的試劑盒，其特征在于，包含權利要求1-5任一項所述的一組培養基。
7.權利要求1-5任一項所述的一組培養基,或者權利要求6所述的試劑盒在體外誘導胚胎干細胞分化為內皮細胞中的用途。
8.—種體外誘導胚胎干細胞分化為內皮細胞的方法，其特征在于，包括以下步驟: 利用權利要求1-5任一項所述的一組培養基，培養胚胎干細胞， 任選地，所述胚胎干細胞來源于人類。
9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，利用權利要求1-5任一項所述的一組培養基，培養胚胎干細胞進一步包括: 利用所述第一培養基對所述胚胎干細胞進行第一誘導分化培養，以便獲得經過第一誘導分化培養的細胞； 利用所述第二培養基對所述經過第一誘導分化培養的細胞進行第二誘導分化培養，以便獲得經過第二誘導分化培養的細胞；以及 利用所述第三培養基對所述經過第二誘導分化培養的細胞進行第三誘導分化培養，以便獲得內皮細胞，其中 進行所述第一誘導分化培養1.5-3天，優選2天， 進行所述第二誘導分化培養4-8天，優選4.5天， 進行所述第三誘導分化培養3-20天， 在進行所述第一誘導分化培養之前，進一步包括: 利用所述第五培養基將所述胚胎干細胞進行預培養，然后依次進行消化和傳代處理，其中，進行所述預培養5-7天，利用1%的dispase酶進行所述消化處理，按照1:3的比例進行所述傳代處理2-3次， 在將所述胚胎干細胞進行預培養之前，進一步包括:利用所述第四培養基將所述胚胎干細胞進行滋養層細胞共培養，以及進一步包括將經過滋養層細胞共培養的胚胎干細胞進行消化和傳代處理，其中利用IV型膠原酶進行所述消化處理，按照1:3或1:5的比例進行所述傳代處理， 在進行所述第三誘導分化培養之前，進一步包括:將所述經過第二誘導分化培養的細胞進行消化和傳代處理，其中利用0.25%的胰酶進行所述消化處理，按照1:2或1:3的比例進行所述傳代處理。
10.一種內皮細胞或其衍生物，其是通過權利要求8或9所述的體外誘導胚胎干細胞分化為內皮細胞的方法獲得的。 ·
全文摘要
本發明公開了用于體外誘導胚胎干細胞分化為內皮細胞的一組培養基和試劑盒，及其在體外誘導胚胎干細胞分化為內皮細胞中的用途、體外誘導胚胎干細胞分化為內皮細胞的方法，以及內皮細胞或其衍生物。其中，該組培養基包括第一培養基，其為添加了胰島素鐵硒傳遞蛋白、BSA、非必需氨基酸和rhBMP-4的IMDM/F12培養基；第二培養基，其為添加了胰島素鐵硒傳遞蛋白、BSA、非必需氨基酸、rhVEGF和rhbFGF的IMDM/F12培養基；以及第三培養基，其為EGM2培養基。利用本發明的該組培養基能夠高效快速地誘導胚胎干細胞向內皮祖細胞及內皮細胞進行分化。
文檔編號C12N5/071GK103194423SQ201310073318
公開日2013年7月10日 申請日期2013年3月7日 優先權日2013年3月7日
發明者裴雪濤, 謝小燕, 岳 文, 何麗娟, 李艷華, 南雪, 姚海雷, 房芳, 張博文 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院野戰輸血研究所