專利名稱：酶法提取狗腎多肽的方法及所得到的狗腎多肽提取物的制作方法
技術領域：
本發明方法涉及狗腎深加工技術領域，具體涉及一種利用生物酶酶解動物藥材狗腎，從而提取狗腎中多肽的方法，以及所提取得到的狗腎多肽提取物。
背景技術：
狗腎(Peniset Testis Canis)，犬科動物狗 Canis familiaris L.(雄性)的干燥陰莖和睪丸，四季可收，將附著的肉及油脂去凈，晾干或焙干即得。別名黃狗腎、廣狗腎、狗鞭、狗寶，為次常用中藥，原名牡狗陰莖，“神農本草經”列為下品。狗腎性咸，大熱，主含雄性激素、蛋白質、脂肪等成分，有暖腎，壯陽，益精等的功效，主要用于腎虛陽痿，遺精，腰膝痿弱無力等癥。有研究顯示，狗腎提取物能提高卵巢摘除大鼠雌激素活性以及促進幼鼠子宮、卵巢的發育，這與黃狗腎具有暖腎壯陽等功效相一致。

對狗腎有效成分的提取有傳統的水提法、醇提法，也有研究用超臨界CO2萃取，參見CN102138936A，其中公開了一種黃狗腎提取物及其制備方法，采用醇提取+超臨界CO2萃取工藝，所得提取液有更好的抗卵巢功能早衰的作用。但此種提取方法工藝繁瑣，且提取成本較高，不利于工業化生產制備。

發明內容
本發明的目的在于提供一種酶法提取狗腎多肽的方法，以對狗腎多肽進行更充分提取，提聞氣基酸及多妝提取效率。本發明的另一目的在于提供一種按照所述的方法制備得到的狗腎多肽提取物，該提取物中含有多種狗腎多肽成分，且保持良好的生物活性。一方面，本發明提供了一種酶法提取狗腎多肽的方法，其中，是采用了酶工程與傳統中藥提取技術的結合，對狗腎進行處理，提取其中的狗腎多肽。根據本發明的具體實施方案，本發明提供的酶法提取狗腎多肽的方法，包括對動物藥材狗腎進行酶提取和醇提取的步驟，其中:酶提取步驟:以添加蛋白酶制劑的水溶液作為酶提取液，對絞碎后的狗腎進行浸潰提取，提取條件:30°C 55°C酶解0.5小時 6小時；醇提取步驟:向酶解后的狗腎溶液中加入乙醇，配成30% 60%體積濃度的乙醇提取液，50°C 90°C加熱回流I小時 5小時；殘渣用30% 60%體積濃度的乙醇液再次50°C 90°C加熱回流提取I 4小時，合并提取液。本發明的酶法提取狗腎多肽的方法，在酶提取步驟中，加入了蛋白酶制劑，對動物藥材狗腎進行深加工，使狗腎藥材中的蛋白可通過酶制劑的降解，得到分子量較小的多肽類物質，為之后的制劑開發奠定基礎。根據本發明的具體實施方案，本發明的酶法提取狗腎多肽的方法中，所述蛋白酶制劑的添加量為藥材重量(除特別注明外，本發明中所述藥材量均是以狗腎藥材干重計)的 0.5% 3%。
根據本發明的具體實施方案，本發明的酶法提取狗腎多肽的方法中，所述蛋白酶為木瓜蛋白酶、胰蛋白酶或其混合物。更優選地，所述蛋白酶為木瓜蛋白酶與胰蛋白酶的混合物，且所述木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的質量比為1:1 2:1。本發明要求各酶制劑的規格:蛋白酶活力不低于20萬u/g。
根據本發明的具體實施方案，本發明的酶法提取狗腎多肽的方法中，所述酶提取步驟中，添加酶制劑的水溶液的量為藥材量的3 4倍重量。根據本發明的具體實施方案，本發明的酶法提取狗腎多肽的方法中，所述酶提取步驟中，優選的酶解條件為:以添加木瓜蛋白酶、胰蛋白酶或兩者混合物的的水溶液作為酶提取液，對絞碎后的狗腎進行浸潰提取，充分攪拌均勻，30°C 55°C酶解0.5 6小時。本發明的酶法提取狗腎多肽的方法中，考慮到成份的極性和溫度的影響，對酶提取液進一步采用了兩次乙醇加熱回流的方法進行循環處理，之后過濾，得提取液。具體地，本發明在酶解后，不需進行額外的滅酶處理，即可向狗腎酶提取液中加入乙醇配制30% 60%的乙醇提取液，在醇提加熱回流時即會對酶產生滅活。根據本發明的具體實施方案，本發明的酶法提取狗腎多肽的方法中，所述醇提取步驟中，兩次乙醇提取液的量均可分別為藥材量的5 10倍。兩次醇提的提取液量可以相同或不同。兩次醇提的提取液的濃度可以相同或不同。兩次醇提的溫度優選為基本相同。根據本發明的具體實施方案，本發明的酶法提取狗腎多肽的方法還包括:對醇提取后得到的醇提取液進行濃縮干燥，得到狗腎多肽濃縮提取液或狗腎多肽提取浸膏。濃縮過程中回收乙醇，重復利用，以進一步降低成本。根據本發明的具體實施方案，本發明的酶法提取狗腎多肽的方法中，所述對醇提取液進行濃縮干燥的操作條件是:50°C 90°C旋蒸法減壓濃縮，90°C以下真空干燥。在本發明的一具體實施方案中，本發明提出的酶法提取狗腎多肽的方法包括有狗腎藥材的酶處理、醇提和濃縮干燥的步驟，具體操作如下:(I)稱取動物藥材狗腎，洗滌、泡軟，絞碎(通常要求可過80目篩)，向其中加3
4倍量的蒸餾水，添加蛋白酶制劑，充分攪拌均勻，在30 80°C溫度下酶解0.5 6小時；其中，所述的蛋白酶為所述蛋白酶為木瓜蛋白酶、胰蛋白酶或其混合物，優選為木瓜蛋白酶與胰蛋白酶按照1:1 2:1的混合物，按狗腎干藥材重量的0.5% 3%加至提取液中，在特定溫度下進行恒溫酶解，以充分溶解狗腎藥材中的蛋白等成分；(2)將酶解后的狗腎溶液再加入乙醇，配成30% 60%體積濃度的乙醇液，同時優選控制該乙醇液的量為原狗腎藥材干重的5 10倍，50 90°C加熱回流I 5小時，殘渣再5 10倍量的30 60%體積濃度的乙醇液再次50 90°C加熱回流提取I 4小時，合并兩次醇提取液；(3)將所得的醇提取液旋蒸法減壓濃縮成濃縮提取液，濃縮過程中回收乙醇，濃縮后可進一步干燥，為避免破壞氨基酸成分，采用90°C以下真空干燥，得黑棕色干膏狀物，即為本發明的狗腎多肽提取物稠膏。采用比色法測定本發明的方法提取狗腎多肽的得率，與單純的熱醇回流提取法相比較，本發明的提取率提聞40%以上,甚至可提聞達60%左右。另一方面，本發明還提供了按照本發明的酶法提取狗腎多肽的方法制備得到的狗腎多肽提取物。
根據本發明的具體實施方案，本發明的狗腎多肽提取物，其可以是濃縮提取液的形式，也可以是進一步干燥后的稠膏(或干膏)的形式。綜上所述，本發明的酶法提取狗腎多肽的方法具有以下優點:本發明采用生物酶技術與傳統的中藥提取技術相結合，由于生物酶的高效性和專一性，溶解狗腎藥材中的蛋白，使有效成分更加充分的提取出，再結合采用乙醇加熱回流的方法進行提取，提取出的有效成分更充分全面，提取率高；并且，本發明的方法中，酶解條件溫和，操作簡單，主要溶劑為水和乙醇，乙醇提取后可回收利用，從而減少溶劑消耗，使生產成本降低。


圖1為本發明的酶法提取狗腎多肽的工藝流程示意圖。
具體實施例方式
為了更清楚地理解本發明，現結合附圖并參照下列實施例進一步描述本發明。實施例權用于解釋而不以任何方式限制本發明。實施例1請參見圖1所示的提取工藝流程，本實施例的酶法提取狗腎多肽的工藝主要按照如下操作進行:稱取動物藥材狗腎100g，洗滌、泡軟、用絞肉機絞成碎末，過80目不銹鋼篩網，力口水400mL，加木瓜蛋白酶(規格20萬U/g，廣西南寧龐博生物工程有限公司生產)2g，胰蛋白酶(規格25萬U/g，上海生工生物工程有限公司生產)lg，充分攪拌均勻后，55°C溫度下酶解2小時，再加200mL95%體積濃度的乙醇，配成乙醇提取液，常壓加熱90°C回流3小時，用100目濾布過濾得提取液，去液面油脂；殘渣加800mL60%體積濃度的乙醇，常壓加熱沸騰回流2小時，用100目濾布過濾得提取液，將兩次醇提液合并后用旋轉蒸發儀(70°C的溫度)濃縮成浸膏狀，在濃縮過程中回收乙醇，最后將浸膏在60°C以下真空干燥，所得黑棕色干膏即為本實施例的狗腎多肽提取物。用比色法測定本實施例的酶法提取的狗腎多肽，與單純的熱醇回流法相比較，提取的狗腎多肽得率提高58.5%。實施例2稱取動物藥材狗腎100g，洗滌、泡軟、用絞肉機絞成碎末，過80目不銹鋼篩網，力口水400mL，加胰蛋白酶(規格25萬U/g，上海生工生物工程有限公司生產)3g，充分攪拌均勻后，55°C溫度下酶解2小時，再加200mL95%體積濃度的乙醇配成乙醇提取液，常壓加熱90°C回流3小時，用100目濾布過濾得提取液，去液面油脂；殘渣加800mL60%體積濃度的乙醇，常壓加熱沸騰回流2小時，用100目濾布過濾得提取液，將兩次醇提液合并后用旋轉蒸發儀(70°C的溫度)濃縮成浸膏狀，在濃縮過程中回收乙醇，最后將浸膏在60°C以下真空干燥，所得黑棕色干膏即為本實施例的狗腎多肽提取物。用比色法測定本實施例的酶法提取的狗腎多肽，與單純的熱醇回流法相比較，提取的狗腎多肽得率提高44.0%。實施例3
稱取動物藥材狗腎100g，洗滌、泡軟、用絞肉機絞成碎末，過80目不銹鋼篩網，力口水400mL，加木瓜蛋白酶(規格20萬U/g，廣西南寧龐博生物工程有限公司生產)3g，充分攪拌均勻后，55°C溫度下酶解2小時，再加200mL95%體積濃度的乙醇配成乙醇提取液，常壓加熱90°C回流3小時，用100目濾布過濾得提取液，去液面油脂；殘渣加800mL60%體積濃度的乙醇，常壓加熱沸騰回流2小時，用100目濾布過濾得提取液，將兩次醇提液合并后用旋轉蒸發儀(70°C的溫度)濃縮成浸膏狀，在濃縮過程中回收乙醇，最后將浸膏在60°C以下真空干燥，所得黑棕色干膏即為本實施例的狗腎多肽提取物。用比色法測定本實施例的酶法提取的狗腎多肽，與單純的熱醇回流法相比較，提取的狗腎多肽得率提高47.8%。實施例4稱取動物藥材狗腎100g，洗滌、泡軟、用絞肉機絞成碎末，過80目不銹鋼篩網，力口水400mL，加木瓜蛋白酶(規格20萬U/g，廣西南寧龐博生物工程有限公司生產)1.5g，胰蛋白酶(規格25萬U/g，上海生工生物工程有限公司生產)1.5g，充分攪拌均勻后，55°C溫度下酶解2小時，再加200mL95%體積濃度的乙醇，配成乙醇提取液，常壓加熱90°C回流3小時，用100目濾布過濾得提取液，去液面油脂；殘渣加800mL60%體積濃度的乙醇，常壓加熱沸騰回流2小時，用100目濾布過濾得提取液，將兩次醇提液合并后用旋轉蒸發儀(70°C的溫度)濃縮成浸膏狀，在濃縮過程中回收乙醇，最后將浸膏在60°C以下真空干燥，所得黑棕色干膏即為本實施例的狗腎多肽提取物。用比色法測定本實施例的酶法提取的狗腎多肽，與單純的熱醇回流法相比較，提取的狗腎多肽得率提高60.1 %。比色法比較各實施例提取狗腎效果一、提取方法

稱取動物藥材狗腎IOOg各四份，洗滌、泡軟、用絞肉機絞成碎末，分別加水400mL，分別加入(I)木瓜蛋白酶(規格20萬U/g，廣西南寧龐博生物工程有限公司生產)2g，胰蛋白酶(規格25萬U/g，上海生工生物工程有限公司生產)Ig ； (2)胰蛋白酶(規格25萬U/g，上海生工生物工程有限公司生產)3g; (3)木瓜蛋白酶(規格20萬U/g，廣西南寧龐博生物工程有限公司生產)3g ； (4)木瓜蛋白酶(規格20萬U/g，廣西南寧龐博生物工程有限公司生產)1.5g，胰蛋白酶(規格25萬U/g,上海生工生物工程有限公司生產)1.5g ; (5)不加酶制劑；充分攪拌均勻后，55°C溫度下酶解2小時，再加95%乙醇配成6倍量30%乙醇液，加熱回流3小時，用100目濾布過濾得提取液，去液面油脂；殘渣加8倍量60%乙醇，加熱回流2小時，用100目濾布過濾得提取液，將兩次醇提液合并統一濃縮至100ml，即得待測狗腎提取液。二、提取液含量測定:利用考馬斯亮蘭法測定氨基酸含量的方法，測定上述提取液中氨基酸的含量。(I)試液配制:0.lmg/ml的標準牛血清白蛋白溶液:精密稱取IOmg左右的牛血清白蛋白，另取87.5mgNaCL,溶于少量蒸懼水中，再稀釋定容至100ml,配成100 μ g/ml的牛血清白蛋白原液。考馬斯亮蘭G-250溶液:精密稱取IOmg考馬斯亮蘭，溶于5ml95%乙醇中，并加入12ml85%濃磷酸，再用水稀釋定容至100ml。供試品溶液配制:分別將狗腎酶法提取液和狗腎空白提取液(IOOml)稀釋定容至200ml，再各取Iml于IOml量瓶中，用70%乙醇稀釋至刻度，得到狗腎酶法提取樣品溶液和狗腎空白提取樣品溶液。(2)測定:取2支具塞刻度試管，其中一支加水1ml，考馬斯亮蘭G-250溶液5ml，搖勻，于595nm處校零；另外一支加0.lmg/ml的標準牛血清白蛋白溶液0.5ml，考馬斯亮蘭G-250溶液5ml，搖勻，于595nm處測光吸收值，作為對照。另取2支試管分別加0.5ml狗腎酶法提取樣品溶液和狗腎空白提取樣品溶液，再加水0.5ml，考馬斯亮蘭G-250溶液5ml，搖勻，于595nm處測光吸收值。由比爾-朗伯定律數學表達式:A = lg(l/T) = Kbc,
權利要求
1.一種酶法提取狗腎多肽的方法，該方法包括對動物藥材狗腎進行酶提取和醇提取的步驟，其中: 酶提取步驟:以添加蛋白酶制劑的水溶液作為酶提取液，對絞碎后的狗腎進行浸潰提取，提取條件:30°C 55°C酶解0.5小時 6小時； 醇提取步驟:向酶解后的狗腎溶液中加入乙醇，配成30% 60%體積濃度的乙醇提取液，50°C 90°C加熱回流I小時 5小時；殘渣用30% 60%體積濃度的乙醇液再次50°C 90°C加熱回流提取I 4小時，合并提取液。
2.根據權利要求1所述的酶法提取狗腎多肽的方法，其中，所述蛋白酶制劑的添加量為藥材重量的0.5% 3%。
3.根據權利要求1或2所述的酶法提取狗腎多肽的方法，所述蛋白酶為木瓜蛋白酶、胰蛋白酶或其混合物；優選地，所述蛋白酶為木瓜蛋白酶與胰蛋白酶的混合物，且所述木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的質量比為1:1 2:1。
4.根據權利要求1所述的酶法提取狗腎多肽的方法，其中，所述酶提取步驟中，添加蛋白酶制劑的水溶液的量為藥材量的3 4倍重量。
5.根據權利要求1所述的酶法提取狗腎多肽的方法，其中，所述醇提取步驟中，兩次乙醇提取液的量均為藥材量的5 10倍重量。
6.根據權利要求1所述的酶法提取狗腎多肽的方法，該方法還包括: 對醇提取后得到的醇提取液進行濃縮干燥，得到狗腎多肽濃縮提取液或狗腎多肽提取浸膏。
7.根據權利要求6所述的酶法提取狗腎多肽的方法，其中，所述對醇提取液進行濃縮干燥的操作條件是:50°C 90°C旋蒸法減壓濃縮，90°C以下真空干燥。
8.按照權利要求1 7任一項所述的酶法提取狗腎多肽的方法制備得到的狗腎多肽提取物。
9.根據權利要求8所述的狗腎多肽提取物，其為狗腎多肽濃縮提取液或狗腎多肽提取浸膏。
全文摘要
本發明提供了一種酶法提取狗腎多肽的方法及所得到的狗腎多肽提取物。所述的方法包括對動物藥材狗腎進行酶提取和醇提取的步驟，其中，酶提取步驟以添加蛋白酶制劑的水溶液作為酶提取液，對絞碎后的狗腎進行浸漬提取，提取條件30℃～55℃酶解0.5小時～6小時；醇提取步驟向酶解后的狗腎溶液中按照加入乙醇，配成30％～60％體積濃度的乙醇提取液，50℃～90℃加熱回流1小時～5小時；殘渣用30％～60％體積濃度的乙醇液再次回流提取1～4小時，合并提取液。利用本發明的方法得到的狗腎多肽提取物有效成分更齊全，相對單純的乙醇加熱回流，提取率提高40％以上，且本發明的提取條件溫和，操作簡單，成本較低。
文檔編號C12P21/06GK103173512SQ20131007335
公開日2013年6月26日 申請日期2013年3月7日 優先權日2013年3月7日
發明者陳勇 申請人:安徽豐潤生物技術有限公司, 陳勇