專利名稱：一株產喜樹堿的喜樹內生細菌-ly214及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一株喜樹內生細菌的分離、培養及其用途，屬于醫藥生物技術領域。
背景技術：
喜樹堿(CPT)是由色胺和裂環馬錢子苷縮合形成的萜類吲哚生物堿，最早從我國特有植物喜樹(Camptotheca acuminata)樹皮中分離獲得，后來陸續在多種植物中發現，如夾竹桃科的海木狗牙花(Ervatamia heyneana)、茶茱萸科的臭味假柴龍樹(Nothapodytesfoetida)以及菌草科的短小蛇根草(Ophiorrhiza pumila)等。喜樹堿抗腫瘤機制獨特,通過抑制拓撲異構酶I而發揮抗腫瘤活性。喜樹堿系列衍生物對胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、腸癌、子宮頸癌、胃癌 和血液腫瘤等均有效，是全球抗腫瘤藥物市場上的主要品種。喜樹堿的來源主要有I)從植物中提取；2)化學合成；3)植物細胞培養。從植物中提取喜樹堿是目前采用的主要方式。然而，喜樹堿在植物中的含量較低(一般為0.1-0.2%左右，在新鮮樹葉中含量稍高，達0.4-0.5%)，其提取、分離、純化、制備過程繁瑣、較為困難；另外產喜樹堿植物的生長周期均較長，并且喜樹堿的積累進程緩慢。我國是喜樹堿的主要生產國和出口國，單純從植物中提取勢必造成對植物資源和生態環境的巨大破壞。此外，提取過程中大量有機溶劑的使用導致環境污染大、步驟繁瑣。喜樹堿的化學全合成是通過不同的建環方法合成，例如拆分法、不對稱氧化法等，多數方法存在路線過長，總產率過低等不足，較難實現工業化。利用植物細胞培養法生產高附加值的植物次生代謝產物(如喜樹堿及其衍生物)一度被認為是一條很有希望的替代途徑，但也因植物細胞生長緩慢、培養過程中異質化嚴重、產量不穩定、生產成本等因素致使實現工業化生產困難重重。總之，喜樹堿的來源有限，根本不能滿足市場需求(國際市場每年喜樹堿需求量3000kg，但是全球喜樹堿年產量僅600kg)，需要發現和研發替代資源及技術。植物內生菌是指那些在其生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物各種組織和器官內部或細胞間隙的真菌或細菌。鑒于部分內生菌能夠促使藥用植物次生代謝產物的合成，產生與宿主相同或相似的藥用活性成分，無論從生態還是經濟的角度來看，利用植物內生菌作為資源，尋找與共生植株相同或相似的天然活性物質，尤其是抗腫瘤天然藥物將是一項永不枯竭的資源。此外，微生物生長迅速，易于培養，成本相對低廉，同時，微生物易于通過基因工程等生物技術進行定向改造，具有良好的發展前景。迄今已有關于從不同種屬的植物如喜樹、臭味假柴龍樹和柴龍樹(Apodytesdimidiata E.Mey.ex Arn)等植物中分離獲得產喜樹堿及其類似物的內生真菌的相關報道(見表1)，這些研究表明利用微生物發酵生產喜樹堿成為一種可能，并且采用植物內生菌發酵生產喜樹堿無疑是解決喜樹堿原料來源的綠色途徑。

發明內容
本發明的目的是首次提供了一種從喜樹中分離、培養獲得的喜樹內生細菌Paenibacillus polymyxa LY214,及其應用，即用于制備喜樹堿。為達到本發明的目的，本發明采用的技術方案如下:本發明提供了一種喜樹內生細菌，其命名為Paenibacillus polymyxa LY214。本發明所述的喜樹內生細菌Paenibacillus polymyxa LY214是從珙桐科植物喜樹樹皮中分離得到的內生細菌。經過形態學和分子生物學鑒定，該菌屬于多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)。該菌已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址:北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所)，保藏日期2012年11月19日，保藏編號CGMCC 6841。從喜樹中分離得到的上述內生細菌Paenibacillus polymyxa LY214的16S rDNA喊基序列如SEQ ID N0.1所不為:AGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGGGGTTGATTAGAAGCTTGCTTCTAATCAACCTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTAGGCAACCTGCCCACAAGACAGGGATAACTACCGGAAACGGTAGCTAATACCCGATACATCCTTTTCCTGCATGGGAGAAGGAGGAAAGACGGAGCAATCTGTCACTTGTGGATGGGCCTGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGCCAGGGAAGAACGTCTTGTAGAGTAACTGCTACAAGAGTGACGGTACCTGAGAAGAAAGCCCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGCTTTTTAAGTCTGGTGTTTAATCCCGAGGCTCAACTTCGGGTCGCACTGGAAACTGGGGAGCTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATGTGGAGGAAC ACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGGCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATGCTAGGTGTTAGGGGTTTCGATACCCTTGGTGCCGAAGTTAACACATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCAGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCCTCTGACCGGTCTAGAGATAGACCTTTCCTTCGGGACAGAGGAGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATGCTTAGTTGCCAGCAGGTCAAGCTGGGCACTCTAAGCAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTACTACAATGGCCGGTACAACGGGAAGCGAAATCGCGAGGTGGAGCCAATCCTAGAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATTGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTACAACACCCGAAGTCGGTGGGGTAACCCGCAAGGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGGGTAGATGATTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAACC。測序結果遞交NCBI (網址為 http://blast, ncb1.nlm.nih.gov/Blast)進行比對，根據BLAST結果并結合形態學特征得出結論，確證該菌株屬于多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)。本發明還提供了一種從喜樹中分離多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)LY214的方法，該方法包括:將喜樹植物材料按照常規操作切段、清洗、消毒后接種到5%水瓊脂固體培養基，280C ±2°C恒溫培養2 3周，待植物材料長出菌絲，挑取菌絲移至沙氏瓊脂固體培養基繼續培養，最后經純化后得到內生細菌多粘類芽孢桿菌Paenibacillus polymyxa LY214。其中，該步中，按照接種的一般操作方法，經切段、清洗、消毒的喜樹植物材料可以在接種前先切斷，并將新切面接種到5%水瓊脂固體培養基。其中，所述喜樹植物材料是喜樹樹根或樹皮或果實或樹葉或樹枝。本發明還提供了一種上述多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)LY214在制備喜樹堿中的應用。具體地,上述利用多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa) LY214來制備喜樹堿的用途中，其中多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa) LY214來制備喜樹堿的方法包括多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)LY214菌株發酵培養步驟和喜樹堿提取步驟。其中，在所述發酵培養步驟中，將多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)LY214菌株接種到沙氏瓊脂液體培養基，搖床160 土 20rpm，28 ± 2°C，發酵培養8 15d，得到發酵混合·物；在所述喜樹堿提取步驟中，將發酵混合物經4000rpm離心15min，過濾，分別收集濾液與菌絲體；所述濾液經氯仿-甲醇(V/V=4:1)混合溶劑萃取，有機相于40°C減壓濃縮至干得到發酵液提取物；所述菌絲體研磨破碎，甲醇浸泡過夜，等體積氯仿-甲醇(V/V=4:l)混合溶劑萃取，有機相40°C減壓濃縮得到菌絲體提取物；發酵液提取物或菌絲體提取物加入氯仿-甲醇(V/V=4:1)溶解，經針頭過濾器過濾得到喜樹堿粗提物。另外,在上述利用多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa) LY214來制備喜樹堿的方法中，依照常規操作必要時可以在多粘類芽孢桿菌Paen ibac i 11us po I ymyxa LY214菌株發酵培養步驟前有多粘類芽孢桿菌Paenibacillus polymyxa LY214菌株種子液制備步驟。其中該種子液制備步驟包括菌種活化與種子培養。其中菌種活化中，活化培養基為沙氏固體培養基，28±2°C,培養時間5 7d ;種子培養中，培養基為沙氏液體培養基，28±2°C，搖床 160±20rpm 培養 2 3d。多粘類芽孢桿菌Paenibacillus polymyxa LY214經發酵培養制得的發酵液提取物或菌絲體提取物的成分分析顯示，喜樹堿主要存在于發酵液提取物中，菌絲體提取物中僅含有痕量喜樹堿。本發明的有益效果:(I)從喜樹植物中分離出新的喜樹內生菌多粘類芽孢桿菌Paenibacilluspolymyxa LY214，為喜樹堿新藥源的開發提供了一株新的微生物；(2)多粘類芽孢桿菌Paenibacillus polymyxa LY214具有產喜樹堿特性,能夠應用于制備喜樹堿；(3)與現有技術相比，本發明所述對象為細菌，具有生長繁殖迅速，易培養、發酵等優點(見表I); (4)多粘類芽孢桿菌Paenibacillus polymyxa LY214分離方法簡單易控制；(5)利用多粘類芽孢桿菌Paenibacillus polymyxa LY214獲得喜樹堿的方法簡單易控制。表I本發明喜樹內生細菌與現有報導的比較
權利要求
1.一種從珙桐科植物喜樹中分離得到的內生細菌，其特征在于該內生細菌的分類命名為Paenibacillus polymyxa LY214,屬多粘類芽孢桿菌，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC6841。
2.根據權利要求1所述的內生細菌，其特征在于，該內生細菌，其特征在于該內生細菌Paenibacillus po lymyxa LY214 的 16S rDNA 喊基序列 1517bp,如 SEQ ID N0.1 所不。
3.權利要求1所述的一種從珙桐科植物喜樹中分離得到內生細菌多粘類芽孢桿菌Paenibacillus po lymyxa LY214的方法,其特征在于,該方法包括: 將喜樹植物材料按照常規操作切段、清洗、消毒后接種到5%水瓊脂固體培養基，280C ±2°C恒溫培養2 3周，待植物材料長出菌絲，挑取菌絲移至沙氏瓊脂固體培養基繼續培養，最后經純化后得到內生細菌多粘類芽孢桿菌Paenibacillus po lymyxa LY214。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述喜樹植物材料是喜樹樹根或樹皮或果實或樹葉或樹枝。
5.根據權利要求1所述的多粘類芽孢桿菌Paenibacilluspolymyxa LY214在制備喜樹堿中的應用。
6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于，利用珙桐科植物喜樹內生細菌多粘類芽孢桿菌Paenibacillus polymyxa LY214獲得喜樹堿的方法包括多粘類芽孢桿菌Paenibacillus polymyxa LY214菌株發酵培養步驟和喜樹堿粗提物步驟。
7.根據權利要求5或6所述的應用，其特征在于，所述方法中的發酵培養步驟中，將多粘類芽孢桿菌Paenibacillus polymyxa LY214菌株接種到沙氏瓊脂液體培養基,搖床160±20rpm，28±2°C，發酵培養8 15d，得到發酵混合物； 在所述方法中的的喜樹堿提取步驟中，將發酵混合物經4000rpm離心15min，過濾，分別收集濾液與菌絲體；所述濾液經V/V=4:l的氯仿-甲醇混合溶劑萃取，有機相于40°C減壓濃縮至干得到發酵液提取物；所述菌絲體研磨破碎，甲醇浸泡過夜，等體積的V/V=4:1的氯仿-甲醇混合溶劑萃取，有機相40°C減壓濃縮得到菌絲體提取物；發酵液提取物或菌絲體提取物加入V/V=4:1的氯仿-甲醇溶解，經針頭過濾器過濾得到喜樹堿粗提物。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，依照常規操作必要時可以在多粘類芽孢桿菌Paenibacillus polymyxa LY214菌株發酵培養步驟前有多粘類芽孢桿菌Paenibacillus polymyxa LY214菌株種子液制備步驟。
9.根據權利要求8所述的方法,其特征在于,所述的多粘類芽孢桿菌Paenibacilluspolymyxa LY214菌株種子液制備步驟包括菌種活化與種子培養。
10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于，所述的菌種活化中，活化培養基為沙氏固體培養基，28±2°C，培養時間5 7d ;種子培養中，培養基為沙氏液體培養基，28±2°C，搖床160±20rpm培養2 3d。
全文摘要
本發明涉及一株從珙桐科植物喜樹(Camptotheca acuminata)中分離純化得到的喜樹內生細菌及其用途。本發明所涉及的喜樹內生細菌LY214經形態學和分子生物學鑒定為多粘芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)，該菌株保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期2012年11月19日，保藏編號CGMCC 6841。本發明的顯著特征是經高效液相色譜、紫外光譜和質譜分析表明，喜樹內生細菌LY214菌株經液體發酵能產生抗腫瘤活性成分喜樹堿。本發明首次公開了從喜樹中分離培養出產喜樹堿的內生細菌，為喜樹堿的制備提供了一條新途徑。
文檔編號C12P17/18GK103146614SQ201310081808
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月14日 優先權日2013年3月14日
發明者羅應剛, 蒲祥, 陳菲, 屈細興, 張國林 申請人:中國科學院成都生物研究所