專利名稱：一株腐皮鐮刀菌菌株及發酵生產大黃酸的方法
技術領域：
本發明屬于藥用微生物技術領域，具體涉及到從藥用植物掌葉大黃中分離出的一株內生真菌腐皮鐮刀菌R13 (Fusarium solani R13),該菌株通過液體發酵能產生大黃酸和大黃素，可用于大量生產大黃酸或其類似物。
背景技術：
大黃是寥科大黃屬植物掌葉大黃(Rheum palmatum L.)、唐古特大黃(Rheumtanguticum Maxim, ex Balf.)或藥用大黃(Rheum officinale Bai 11)的干燥根及根莖，又名將軍，具瀉熱通便、涼血解毒、逐瘀通經的功效，是臨床最常用的藥物之一。它的活性成分大黃素、大黃酸、蘆薈大黃素、大黃酚、大黃素甲醚等具有具抗菌、抗腫瘤、抗病毒、保肝、強心、延緩衰老、調節免疫功能等作用。隨著大黃中有效成分的分離純化以及色譜技術的廣泛應用，從上世紀80年代開始大黃中單體的研究。例如大黃酸(Rhein, 4，5-dihydroxyanthraquinone)屬單蒽核類1，8-二羥基蒽醌衍生物，是掌葉大黃、虎仗等多種傳統中藥的主要有效成分之一。近年來發現大黃酸具有抗菌、抗腫瘤、抗炎、保肝抗纖維化、抗突變、抗多藥耐藥和聯合用藥、改變腎臟基因表達譜、改善細胞代謝、調脂作用等藥理學作用。大黃素具有諸多抗炎、抗病毒、抑菌、免疫調節、保護肝腎、促進胃腸蠕動、抗氧化、清除自由基、改善微循環等藥理學作用。大黃已廣泛應用于臨床，如用于黃疸、急性胰腺炎等的治療，大黃酸的1,8-二乙酰化物(Diacerein)已用于治療骨關節炎，其有效物質形式應為大黃酸。大黃酸已經從傳統的瀉藥成分轉變成為一種具有廣泛生理作用的新型藥物單體。經過結構修飾制備大黃酸偶聯物以及衍生物，可改善大黃酸溶解性。利用大黃酸的骨趨向性作為藥物骨靶向制劑載體，研制高 效低毒的新型抗腫瘤藥也日益成為關注的重點。隨著大黃酸藥物單體需求研究，單體大黃酸生產愈發重要。內生真菌(Endophytic fungus)是指生活在健康植物組織內部,但不引起植物病害的真菌，在植物組織中普遍存在。內生真菌與宿主在長期的生態系統演化中形成了互惠共生關系，可產生與宿主相同或不同的具有生物活性的次生代謝產物。1993年，Strobel從短葉紅豆杉中分離到一株能夠產生紫杉醇的內生真菌(Taxomyces andreanae),這為抗腫瘤藥物的研究增添了新的途徑。一系列的科學研究表明，植物內生真菌既能夠產生與宿主植物相同或相似的有效活性物質，也能夠產生其他有活性的天然產物。內生真菌的天然產物種類十分豐富，幾乎涵蓋了所有的天然產物的類型，因此內生真菌為天然產物的發現提供了廣泛的資源。

發明內容
本發明涉及一種從掌葉大黃(Rheum Palmatum L.)中分離出的一株產大黃酸的內生真菌。該內生真菌經形態學和rDNA ITS序列分析鑒定是腐皮鐮刀菌屬(Fusariumsolani)，是一種絲狀真菌。可用于大量生產大黃酸或其類似物。
本發明的技術方案。本發明采用嚴格的表面滅菌方法，從植物掌葉大黃活體植物中分離得到植物內生真菌R13,經rDNA ITS序列分析，即核糖rDNA內部轉錄間隔區(Ribosomal DNA InternalTranscribed Spacer)序列分析技術,結合微生物學形態學鑒定證明該菌株屬于腐皮鐮刀菌屬(Fusarium solani)。該菌株已于2013年I月9日送交保藏湖北省武漢市武漢大學的中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，其保藏編號為CCTCC N0:M2013009o本發明所述的腐皮鐮刀菌R13菌株的分離及篩選流程。首先，從中國四川省若爾蓋草原采集掌葉大黃活體植株，選擇健康完好的植物進行表面清洗和消毒，在無菌的環境下，對根、莖、葉和花進行切段，接著放入馬鈴薯葡萄糖培養基(PDA)培養皿中，于培養箱中培養，觀察菌落生長情況，一般5-10天可看到切段周圍有絲狀真菌長出；對長出的真菌進行分離純化后保種并進行液體發酵培養，提取菌絲體中的蒽醌，以標準品大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、蘆薈大黃素對照，進行高效液相色譜(HPLC)檢測，根據色譜圖篩選產大黃酸的菌株；對初篩菌株進行高效液相色譜質譜連用(LC-MS)分析，進一步的確定產大黃酸的能力，對分析后確定產大黃酸的菌株進行系統分類學研究，包括形態學和分子生物學水平鑒定。菌株分類學地位的鑒定。1.固體培養特征。采用PDA培養基(土豆200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，加水定容1L，PH自然)培養腐皮鐮刀菌Rl3菌株。菌落形態:28°C培養3 4天，菌落直徑達30mm，7天時基本長滿培養皿，菌落為圓形，前期為白色，后期為紫紅色；菌落中間紫紅色 ，絨毛狀，菌落邊緣相對整齊，白色，中間顏色較深，邊緣較淺，隨著培養時間的增長，整個平板培養基都呈紅色。菌絲形態:菌絲分枝，有隔，菌絲寬度2-3 μ m。產孢特征:小型分生孢子多為單細胞，少數為1-2個分隔，有卵形、腎形等。大型分生孢子散生于菌絲上，大多數有3個分隔且分隔明顯，形狀為鐮刀形，頂端形狀漸尖。2.rDNA ITS 序列分析。2.1提取菌絲體總DNA。2.2 以 ITSl(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(5’ -TCCTCCGCTTATTGATAGC-3’ )為引物，擴增出rDNA ITS序列，經過測序，得到核苷酸序列SQE ID NOl0該序列包含了其兩端的18S rDNA、28S rDNA的部分序列和中間ITSl區、5.8S r DNA、ITS2區的完整序列。2.3 將測序結果遞交 http://blast, ncb1.nlm.nih.gov/Blast 進行序列比對，最后根據BLAST結果和形態學特征得出該分離的內生真菌屬于腐皮鐮刀菌屬(Fusariumsolani)。2.4腐皮鐮刀菌R13中大黃酸產量確定。2.4.1腐皮鐮刀菌R13接種至改良的察氏培養基中，液體發酵培養10d，每天收集發酵液并提取發酵液，采用高效液相(HPLC)定量分析提取液，結果表明，液體發酵72小時后開始產大黃酸，經過192小時發酵后,發酵液中大黃酸產量達到最大值5.672mg/L0本發明效果。
1.本發明為大黃酸和大黃素的開發提供了一株新的微生物菌株。2.本發明所述對象屬于微生物，可以通過發酵的方式獲得化合物，微生物生長繁殖迅速，不受氣候與地域的限制，產量提升空間較大。3.本發明能夠避免對植物掌葉大黃野生植物的過度開發，達到環境和生態的保護。


序列表1:本發明分離得到的腐皮鐮刀菌R13的rDNA ITS基因序列。圖1:分離得到的掌葉大黃內生真菌腐皮鐮刀菌R13菌落形態圖。圖2:腐皮鐮刀菌R13發酵提取液和大黃酸標準品HPLC圖譜。圖3:大黃素標品和大黃酸標品的HPLC-MS質譜圖。圖4:腐皮鐮刀菌R13代謝物的HPLC-MS質譜圖。圖5:腐皮鐮刀菌R13聚類分析圖。圖6:腐皮鐮刀菌R13菌絲細胞、鐮刀孢子顯微照片。圖7:腐皮鐮刀菌R13中大黃酸產量圖。

生物材料樣品保藏信息。保藏日期:2013年I月9日。保藏編號:CCTCCN0:M2013009o分類命名:腐皮鐮刀菌R13 (Fusarium solani R13)。保減單位名稱:中國典型培養物保減中心。保藏單位地址:中國.武漢.武漢大學 具體實施方式
。下文將通過實施例對本發明做進一步說明，但實施例不以任何方式限制本發明。實施例1。大黃內生真菌的初步篩選。1.1從中國四川省若爾蓋草原采集健康的掌葉大黃野生植株。1.2挑選健康的植株自來水沖洗10分鐘，無菌水浸泡10分鐘，除去表面污垢。1.3進行表面消毒，步驟如下。1.3.1分別從根、莖、葉三個部位截取長為2.0cm小段，先后用體積分數75%乙醇滅
菌30S，無菌水浸泡。1.3.25%次氯酸鈉溶液5min、2.5min> Imin (消毒時間根據材料大小可微調),無菌水漂洗3次，每次3min。1.3.3無菌脫脂棉浙干植株上的液體，然后將材料切小塊轉入PDA培養皿中，每皿4 5塊材料，并將最后一次漂洗的無菌水涂布于PDA培養基，作為對照，用以檢驗表面滅菌是否徹底。1.3.4將培養皿放置培養箱中，25°C避光培養7 15天，對長出的真菌進行分離純化，然后轉入大試管中4°C保藏。1.3.5將純化后的菌株用改良的察氏培養基進行液體發酵培養，25°C、200r/min搖床培養10天，收集發酵液和菌絲體。改良的察氏培養基:蛋白胨10g，蔗糖30g，磷酸氫二鉀lg，氯化鉀0.5g，硫酸鎂0.5，硫酸亞鐵0.0lgo實施例2。腐皮鐮刀菌R13的驗證。2.1制備種子培養液:將腐皮鐮刀菌R13接種于含有IOOml改良的察氏培養基的錐形瓶中，于25 °C、200r/min搖床培養24h。2.2擴大培養:將腐皮鐮刀菌R13種子液以5% (體積比)接種量接種于擴大培養液中，于 25°C、200r/min，培養 10h。2.3收集發酵液和菌絲體:將步驟2.2的培養物過濾，分別收集發酵液和菌絲體，菌絲體用無菌蒸餾水沖洗3次，60°C烘干至恒重，用75%酒精浸提24小時，然后將浸提液與發酵液合并。2.4利用中華人民共和國藥典當中大黃浸膏的提取方法，提取3步驟中的游離蒽醌。具體提取步驟。2.4.1每IOOml發酵液中加入2.5mol/L硫酸溶液10ml，超聲處理3分鐘，然后沸水加熱回流30分鐘。2.4.2加熱回流完成后，立即冷卻，加入乙醚提取，提取3次，合并提取液，旋轉蒸發掉乙醚，加甲醇溶解，即得粗提液。2.5用高效液相色譜(HPLC)`分析檢測粗提液，標品:大黃酸，大黃素，大黃素甲醚，大黃酚，蘆薈大黃素。色譜條件:甲醇:0.1%磷酸(80:20，V/V)為流動相。流速lmL/min，檢測波長 245nm,柱溫 30°C,色譜柱(75mmX4.6mm, 3.5 μ m)。2.6對步驟2.5所得的數據進行分析(見圖2)，大黃酸標品出現吸收峰的保留時間是2.959min，腐皮鐮刀菌R13發酵液提取物在保留時間2.953min時也出現一個明顯的吸收峰，由此推斷從掌葉大黃植株分離得到的一株內生真菌產大黃酸類似物。2.7用高效液相質譜聯用(HPLC-MS)檢測粗提液，并以大黃酸和大黃素標準品作對照。技術條件如下:Thermo Scientific液質聯用(LC-MS)色譜儀。電噴霧離子源，毛細管電壓3.5kV，脫溶溫度270°C，采用選擇離子監測(SIM)模式定性檢測。大黃酸和大黃素定性離子范圍分別為 m/z282.950-283.050 和 m/z268.960-269.050。Thermo Hypersil GoldC18色譜柱(150mmX2.1mm，5.0 μ m)，流動相為甲醇:0.1%乙酸銨(2mM)，比例為90:10。流速為0.2mL/min。分別對掌葉大黃的游離蒽醌和R13中游離蒽醌進行分析。2.8將標準品和提取物經過HPLC-MS檢測和分析，大黃酸標品產生一個m/z為282.99的[Μ-ΗΓ離子峰，發酵液提取物也產生一個m/z為282.99的[Μ_Η]_離子峰，與大黃酸標品一致，確定腐皮鐮刀菌R13產大黃酸。通過質譜分析，檢測到發酵液中還含有另外一種游離蒽醌大黃素，產生一個m/z為268.91的[M_H]_離子峰，大黃素標準品的m/z為269.01，質譜圖基本一致，確定腐皮鐮刀菌R13產大黃素見圖3、圖4。實施例3。腐皮鐮刀菌R13分子生物學特征和形態學鑒定。采用CTAB方法提取腐皮鐮刀菌R13總DNA，總DNA的PCR擴增及其擴增體系與反應條件:ITSl:5' -TC CGTAGGTGAACCTGCGG-3' ；ITS4:5/ -TCCTCCG CTTATTGATATGC-3'。50 μ L PCR反應體系:25μ L C2 X Taq PCR Master Mix、lyL基因組DNA、引物 ITSl 和引物ITS4各2μ L、25y L滅菌超純水。PCR擴增程序:95°C 3min, 94°C 30s, 55V lmin, 72。。80s, 35個循環；72°C IOmin0將PCR產物純化后進行序列測定。將測序結果遞交至http://blast.ncb1.nlm.nih.gov/Blast。進行比對,再利用MEGA4.0對所克隆的片段進行聚類分析(見圖5)，結果菌株形態學特征(見圖6)，該菌被鑒定為腐皮鐮刀菌屬(Fusarium solani)。實施例4。腐皮鐮刀菌R13產大黃酸的定量分析。高效液相(HPLC)定量分析:HPLC檢測標品大黃酸，甲醇定容，配制成0.4-160 μ g/mL的梯度，繪制標準曲線。色譜條件:甲醇-0.1%磷酸(80:20, V/V)為流動相。流速ImL/min，檢測波長245nm，柱溫30°C，C18色譜柱(75mmX 4.6mm, 3.5 μ m)。精密稱取大黃酸標品
2.5mg，定容至25mL ，得母液濃度為0.lg/L。將母液濃度依次稀釋成濃度梯度為0.4、4、40、80、100、160μ g/mL，吸取10 μ L進樣，建立標準曲線。大黃酸產量分析:先將菌種接種到改良察氏培養基，進行種子培養，25°C，200r/min，搖瓶培養2d ;將種子發酵液接種于液體改良察氏培養基中，接種量5%，25 °C，200r/min,搖瓶培養10d，按照步驟2.4提取每天的發酵液，最后用高效液相定量，得大黃酸的產量，見圖7。本發明分離的腐皮鐮刀菌R13，為大量生產大黃酸和大黃素提供了新的來源。本發明實施可以采用常規的發酵方法進行生產。
權利要求
1.一株從寥科大黃屬掌葉大黃活體中分離得到的內生真菌，其特征在于該菌株是腐皮鐮刀菌R13 {Fusarium solani R13)，保藏在中國典型培養物保藏中心，其保藏號為=CCTCCNO: M 2013009。
2.根據權利要求I所述的腐皮鐮刀菌，其特征在于其18SrDNA ITS序列為SQE ID NO1。
3.根據權利要求I所述的腐皮鐮刀菌，其特征在于其液體發酵能合成大黃酸。
4.根據權利要求I所述的腐皮鐮刀菌，其特征在于用改良查氏培養基發酵72小時后，開始產生大黃酸且分泌于發酵液中。
全文摘要
本發明提供的大黃酸高產菌株腐皮鐮刀菌R13(FusariumsolaniR13)，其保藏號是CCTCC NO:M 2013009，保藏單位是中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏日期是2011年1月9日。該菌株是從蓼科大黃屬掌葉大黃活體中分離篩選得到的內生真菌，該菌株經液體發酵后能產生與其宿主掌葉大黃相同或相似的物質大黃酸和大黃素，該類大黃酸、大黃素以游離態存在發酵上清液中。本發明還提供了發酵生產大黃酸的方法，通過液態發酵在25-28℃代謝產生大黃酸產率可達到5mg/L以上。
文檔編號C12R1/77GK103255063SQ20131008411
公開日2013年8月21日 申請日期2013年3月18日 優先權日2013年3月18日
發明者張 杰, 游霞, 馮甦, 于志偉, 趙建, 侯若彤 申請人:四川大學