專利名稱：篩選或輔助篩選高抗穗發(fā)芽小麥的方法及其專用引物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域，尤其涉及一種篩選或輔助篩選高抗穗發(fā)芽小麥的方法及其專用引物。
背景技術：
穗發(fā)芽(Pre-harvest sprouting簡稱PHS)是指小麥在收獲前遇到連續(xù)陰雨的天氣或在潮濕的環(huán)境下的穗上發(fā)芽。穗發(fā)芽不但影響產(chǎn)量，而且嚴重影響品質(尤其是加工品質)、儲存、及下年的播種質量，造成不同的經(jīng)濟損失。世界上的多個國家和地區(qū)都曾受到穗發(fā)芽的危害，其中以加拿大和澳大利亞最為嚴重。據(jù)Derera報道，澳大利亞平均每年有7%的小麥受穗發(fā)芽危害，最嚴重的1984年，穗發(fā)芽危害程度高達20%。而加拿大平均每個季度因穗發(fā)芽損失近I億美元。在我國穗發(fā)芽嚴重的地區(qū)主要有長江中下游地區(qū) ，東北春麥區(qū)，但是，西北春麥區(qū)，黃淮冬麥區(qū)及北部冬麥區(qū)也時有穗發(fā)芽發(fā)生。據(jù)報道2009年小麥穗發(fā)芽造成江蘇、湖北、安徽、河南等多個省份相似地區(qū)的大面積商品麥質量下降，僅湖北省中北部小麥發(fā)生穗發(fā)芽的面積約占80%。據(jù)有關資料統(tǒng)計，每十年內(nèi)淮南麥區(qū)必有一年出現(xiàn)適宜小麥嚴重穗發(fā)芽的天氣。穗發(fā)芽嚴重地區(qū)小麥一般減產(chǎn)6%-10%，在穗發(fā)芽嚴重的年份產(chǎn)量損失則高達20%，這給廣大生產(chǎn)者帶來巨大的損失。雖然許多學者對小麥收獲前穗發(fā)芽的遺傳、形態(tài)、生態(tài)與生理機制進行研究，探討和明確減輕小麥收獲前穗發(fā)芽的途徑與措施，得出了相應的研究結論，但是由于種種原因，小麥抗穗發(fā)芽育種尚未有突破性進展。因此，目前穗發(fā)芽問題是我國乃至世界小麥育種急待解決的關鍵問題之一。由于小麥穗發(fā)芽是受多基因控制的數(shù)量性狀，品種的形態(tài)特征及生理生化性狀如種子休眠特性、種皮顏色、a -淀粉酶活性、穎殼抑制物、穗部結構等都會對小麥穗發(fā)芽產(chǎn)生不同程度的影響(Derera，1989;肖世和等，1985)。傳統(tǒng)的育種方法一般正常年份田間無法鑒定穗發(fā)芽抗性，必須取樣在室內(nèi)人工鑒定，這對于大量的早代育種材料篩選比較困難。所以分子標記輔助育種，成為當下培育抗穗發(fā)芽品種的主要途徑之一。分子標記具有以下特點:(1)直接反映DNA序列差異，不受基因表達的影響，結果可靠性強；(2)標記位點豐富，遍布整個染色體組；(3)許多標記是共顯性標記，不受雜交方式的影響；(4)不受植物生長發(fā)育階段及環(huán)境條件的影響，加快了育種進程；(5)標記形式多樣。有研究表明:分子標記輔助育種可以大大提高選擇效率。小麥穗發(fā)芽的基因及QTL定位是近年來國內(nèi)外研究的重點領域之一。目前，在小麥的21條染色體上均發(fā)現(xiàn)了與穗發(fā)芽抗性相關的基因和QTL。其中以第三、第四同源染色體群為主。Kulwal 等(2004)在 2BL 上發(fā)現(xiàn)一個 QTL QPhs.ccsu_2B.1 能解釋 16% 的表型變異。Osa等(2003)檢測到一個與休眠相關的主效QTL位于Xbcdl380和Xfbb310之間，能解釋23-38%的表型變異，Mori等(2005)又將這個QTL定位于Xbarc310和Xbcd907之間。張海萍等(2007)在3AS上檢測到一個控制休眠的主效QTL，位于Xbarc294和Xbarc57之間，可解釋表型變異的35%-47%。Kulwal等(2005)檢測到一個與穗發(fā)芽相關的QTLQphs.ccsu-3A.1,位于3AL上，這個QTL在單個環(huán)境中能解釋的表型變異達到了 25_35%。Yang等(2007)根據(jù)玉米中報道的控制種子休眠的轉錄因子Vpl在小麥中開發(fā)了一個位于3BL上STS標記VplB3，在抗穗發(fā)芽的品種中能擴增出845bp或569bp的片段，而在感穗發(fā)芽的品種中僅能擴增出652bp的片段。Chang等(2011)在3AL上也開發(fā)了一個標記Vp_lA17_19，并在81份小麥品種中發(fā)現(xiàn)了 6種等位基因(Vp-lAa, Vp-lAb, Vp-lAc, Vp-lAd, Vp-1Ae andVp-lAf),其中 Vp-1Ab 和 Vp-1Ad 與抗糖發(fā)芽相關，而 Vp-lAa, Vp-lAc, Vp-1Ae 和 Vp-1Af 與感穗發(fā)芽相關。Rasul等(2009)在4B上檢測到一個QTL，這個QTL與降落值、發(fā)芽指數(shù)和整穗發(fā)芽率都高度相關。Chen等(2007)在4A上檢測到一個與穗發(fā)芽和休眠相關的QTL位于Xbarcl70和Xgwm397之間。Flintham等用Bezostaya替換Hobbit的全套染色體置換系，發(fā)現(xiàn)穗發(fā)芽抗性與4D和7B染色體有關。除了上述與穗發(fā)芽抗性相關的標記外，還發(fā)現(xiàn)有許多其他基因和標記，例如與種皮顏色相關的Phs基因，與糖部形狀相關的Hd基因，與穗型相關的C位點和與種皮吸水性狀相關的標記等。由于穗發(fā)芽抗性受多個位點的控制，因此利用分子標記明確不同品種中的抗性遺傳構成，并進行相關遺傳位點的聚合，就有望培育出抗穗發(fā)芽品種。一般情況下白粒小麥比紅粒小麥更易穗發(fā)芽。這是由于紅色R基因是一個轉錄調節(jié)因子，它通過調節(jié)控制類黃酮合成的幾個基因的表達而影響籽粒的休眠性，從而影響穗發(fā)芽抗性。但是，由于白粒小麥比紅粒小麥的出粉率高、收購價格高和人們偏愛白色面食制品，所以白粒小麥不僅倍受面粉企業(yè)的青睞，而且深受種糧農(nóng)戶的歡迎。因此，發(fā)掘白粒抗穗發(fā)芽基因和培育白粒抗穗發(fā)芽品種尤為重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種篩選或輔助篩選高抗穗發(fā)芽小麥的專用引物。本發(fā)明提供的專用引物，由如下引物對I和引物對2組成:所述引物對I由序列表中序列I所示的單鏈DNA分子和序列表中序列2所示的單鏈DNA分子組成；所述引物對2由序列表中序列3所示的單鏈DNA分子和序列表中序列4所示的單鏈DNA分子組成。上述專用引物中，所述引物對I和所述引物對2獨立包裝；所述篩選或輔助篩選高抗穗發(fā)芽小麥為從抗穗發(fā)芽親本小麥和感穗發(fā)芽親本小麥雜交的后代中篩選或輔助篩選高抗穗發(fā)芽小麥；所述高抗穗發(fā)芽小麥為穗發(fā)芽率低于或等于抗穗發(fā)芽親本。

在本發(fā)明的實施例中，抗穗發(fā)芽親本為CA0431 ;感穗發(fā)芽親本為CA0306 ;抗穗發(fā)芽親本小麥和感穗發(fā)芽親本小麥雜交的后代為CA0431和CA0306雜交后的F2代群體或F2:3代群體。含有上述的專用引物的篩選或輔助篩選高抗穗發(fā)芽小麥的PCR試劑組也是本發(fā)明保護的范圍。上述PCR試劑組由PCR試劑I和PCR試劑2組成:所述PCR試劑I由上述的專用引物中的引物對1、PCR擴增緩沖液、dNTPs、DNA聚合酶和水組成；所述PCR試劑2由上述的專用引物中的引物對2、PCR擴增緩沖液、dNTPs、DNA聚合酶和水組成。上述的PCR試劑組中，所述引物對I中的每條引物在其對應所述PCR試劑I中的終濃度均為0.2iiM ;所述引物2中的每條引物在其對應所述PCR試劑2中的終濃度均為
0.2uM ；所述篩選或輔助篩選高抗穗發(fā)芽小麥為從抗穗發(fā)芽親本小麥和感穗發(fā)芽親本小麥雜交的后代中篩選或輔助篩選高抗穗發(fā)芽小麥；所述高抗穗發(fā)芽小麥為穗發(fā)芽率低于或等于抗穗發(fā)芽親本。在本發(fā)明的實施例中，抗穗發(fā)芽親本為CA0431 ;感穗發(fā)芽親本為CA0306 ;抗穗發(fā)芽親本小麥和感穗發(fā)芽親本小麥雜交的后代為CA0431和CA0306雜交后的F2代群體或F2:3代群體。本發(fā)明的第二個目的是提供一種篩選或輔助篩選高抗穗發(fā)芽小麥的PCR擴增試劑盒。本發(fā)明提供的試劑盒，包括上述的專用引物或上述的PCR試劑組；所述篩選或輔助篩選高抗穗發(fā)芽小麥為從抗穗發(fā)芽親本小麥和感穗發(fā)芽親本小麥雜交的后代中篩選或輔助篩選高抗穗發(fā)芽小麥；

所述高抗穗發(fā)芽小麥為穗發(fā)芽率低于或等于抗穗發(fā)芽親本。在本發(fā)明的實施例中，抗穗發(fā)芽親本為CA0431 ;感穗發(fā)芽親本為CA0306 ;抗穗發(fā)芽親本小麥和感穗發(fā)芽親本小麥雜交的后代為CA0431和CA0306雜交后的F2代群體或F2:3代群體。上述的專用引物、上述的PCR試劑組或上述PCR擴增試劑盒在篩選或輔助篩選待測樣本為高抗穗發(fā)芽小麥中的應用也是本發(fā)明保護的范圍；上述的專用引物、上述的PCR試劑組或上述PCR擴增試劑盒在鑒定或輔助鑒定待測樣本為高抗穗發(fā)芽小麥中的應用也是本發(fā)明保護的范圍；所述待測樣本具體為抗穗發(fā)芽親本小麥和感穗發(fā)芽親本小麥雜交的后代或者親本本身；所述高抗穗發(fā)芽小麥具體為穗發(fā)芽率低于或等于抗穗發(fā)芽親本；在本發(fā)明的實施例中，抗穗發(fā)芽親本為CA0431 ;感穗發(fā)芽親本為CA0306 ;待測樣本為抗穗發(fā)芽親本CA0431和感穗發(fā)芽親本CA0306的雜交后的F2代群體或F2:3代群體；待測樣本也可以為抗穗發(fā)芽親本CA0431或感穗發(fā)芽親本CA0306。本發(fā)明的第三個目的是提供一種鑒定或輔助鑒定待測小麥是否為高抗穗發(fā)芽小麥的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟:分別用上述的專用引物、上述的PCR試劑組或上述PCR擴增試劑盒的引物對I和引物對2對待測小麥進行PCR擴增，檢測擴增產(chǎn)物；若所述引物對I的擴增產(chǎn)物中含有大小為159bp的產(chǎn)物，且所述引物對2的擴增產(chǎn)物中不含有大小為2150bp的產(chǎn)物，則待測小麥為或候選為高抗穗發(fā)芽小麥；若為如下情況，則待測小麥不為或候選不為高抗穗發(fā)芽小麥:I)所述引物對I的擴增產(chǎn)物中含有大小為159bp的產(chǎn)物，且所述引物對2的擴增產(chǎn)物中含有大小為2150bp的產(chǎn)物；2)所述引物對I的擴增產(chǎn)物中不含有大小為159bp的產(chǎn)物，且所述引物對2的擴增產(chǎn)物中不含有大小為2150bp的產(chǎn)物；3)所述引物對I的擴增產(chǎn)物中不含有大小為159bp的產(chǎn)物，且所述引物對2的擴增產(chǎn)物中含有大小為2150bp的產(chǎn)物。上述方法中，所述待測樣本為抗穗發(fā)芽親本小麥和感穗發(fā)芽親本小麥雜交的后代或者親本本身；所述高抗穗發(fā)芽小麥為穗發(fā)芽率低于或等于抗穗發(fā)芽親本。所述PCR擴增的模板為待測小麥的基因組DNA。在本發(fā)明的實施例中，抗穗發(fā)芽親本為CA0431 ;感穗發(fā)芽親本為CA0306 ;待測樣本為抗穗發(fā)芽親本CA0431和感穗發(fā)芽親本CA0306的雜交后的F2代群體或F2:3代群體；待測樣本也可以為抗穗發(fā)芽親本CA0431或感穗發(fā)芽親本CA0306。本發(fā)明還保護小麥穗發(fā)芽抗性的一個主效QTL ;小麥穗發(fā)芽抗性的數(shù)量性狀基因位點，定位于2B染色 體長臂上，位于SSR引物位點Xbarcl042和Xmag3319之間。在兩個世代兩個試驗點均能在2B染色體長臂上檢測出相同的穗發(fā)芽抗性的QTL位點:QPhs.caas-2BLo該QTL位點能解釋較大的表型變異,受環(huán)境影響較小，能穩(wěn)定遺傳。本研究擬利用白粒抗穗發(fā)芽品系CA0431與感穗發(fā)芽的白粒品種CA0306配置遺傳群體，進行QTL分析，以期發(fā)掘CA0431抗穗發(fā)芽的主效QTL及其緊密連鎖的分子標記進一步應用于分子標記輔助育種。本研究中的白粒小麥品系CA0431經(jīng)多年鑒定，對穗發(fā)芽具有極強的抗性。CA0431和CA0306農(nóng)藝性狀優(yōu)良，CA0431早熟、多穗、中矮桿，CA0306優(yōu)質、強筋。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明提供了利用CA0431和CA0306產(chǎn)生的后代群體進行QTL定位，找到與CA0431穗發(fā)芽抗性基因緊密連鎖的分子標記QTL (QPhs.caas-2BL)，且基于該主效QTL篩選出了篩選或輔助篩選高抗穗或高感穗發(fā)芽小麥的專用引物，利用專用引物可以篩選(或鑒定)或輔助篩選(或鑒定)抗穗發(fā)芽親本小麥和感穗發(fā)芽親本小麥雜交的后代中的高抗穗發(fā)芽小麥或高感穗發(fā)芽小麥，從而培育抗穗發(fā)芽品種。本發(fā)明的穗發(fā)芽抗性QTL位點、專用引物和鑒定方法將在小麥抗穗發(fā)芽育種中發(fā)揮重要作用，有利于白粒小麥穗發(fā)芽抗性的改良，有助于加速我國小麥育種進程。


圖1為完備區(qū)間作圖法顯示F2群體在2B染色體上的LOD曲線2為完備區(qū)間作圖法顯示F2:3群體及三個環(huán)境平均在2B染色體上的LOD曲線3為SSR引物Xbarcl042和Xmag3319在親本、抗、感池及F2抗、感單株的擴增
結果圖4為SSR引物Xbarcl042在親本及部分F2:3群體擴增結果圖5為SSR引物Xmag3319在親本及部分F2:3群體擴增結果
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。實施例中未注明小麥材料來源者均購自于國家種質資源庫。下述實施例中所用材料是抗穗發(fā)芽親本CA0431和感穗發(fā)芽親本CA0306、二者的雜種后代F2代群體、F2代自交3代的群體F2:3。其中抗穗發(fā)芽親本CA0431和感穗發(fā)芽親本CA0306 (品種審定后稱為中優(yōu)206)均記載在苗西磊等，白粒小麥品種(系)穗發(fā)芽抗性機制分析，麥類作物學報，2011，31 (4):747-746 ;公眾可從中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所獲得；且親本的抗穗和感穗性質為公知的，且已經(jīng)在上述文獻中鑒定了。F2中，“2”是兩個親本(純合體)產(chǎn)生的雜交后代Fl (雜合體)成熟后產(chǎn)生的種子。F2:3中，“2”是兩個親本(純合體)產(chǎn)生的雜交后代Fl (雜合體)成熟后產(chǎn)生的種子，“3”是這個種子自交3代。實施例1、輔助篩選高抗穗發(fā)芽小麥的主效QTL位點(QPhs.caas-2BL)及專用引物對的獲得一、穗發(fā)芽抗性鑒定抗穗發(fā)芽親本CA0431和感穗發(fā)芽親本CA0306的雜交后代F2代群體共220株于2010-2011年種植于北京，2m行長，20粒/行。2011年6-7月，在北京進行F2代群體穗發(fā)芽抗性鑒定，具體方法如下=F2代群體，每株取5個穗，生理成熟期取樣，先放于通風處自然風干5天，然后放于_20°C的冰箱內(nèi)保持休眠性，待所有樣品取完后再風干2天，然后進行穗發(fā)芽實驗。將5個麥穗捆成一束，在水中浸泡6-8小時，插入盛有沙子的塑料盒內(nèi)，澆足水，用塑料布覆蓋，在22土 1°C的環(huán)境下放置，每天用噴霧器噴水3次以保持濕度。7天后統(tǒng)計發(fā)芽情況。220株中高抗穗發(fā)芽小麥(穗發(fā)芽率低于或等于抗穗發(fā)芽親本的即為高抗穗發(fā)芽小麥)有15株；其余為非高抗穗發(fā)芽小麥(其鑒定標準為如下A或B:A穗發(fā)芽率高于或等于感穗發(fā)芽親本；B穗發(fā)芽率高于抗穗發(fā)芽親本或低于感穗發(fā)芽親本)；在非高抗穗發(fā)芽小麥中又分為高感穗發(fā)芽小麥(穗發(fā)芽率高于或等于感穗發(fā)芽親本的即為高感穗發(fā)芽小麥)有32株和173非高抗且非高感穗發(fā)芽小麥(穗發(fā)芽率高于抗穗發(fā)芽親本或低于感穗發(fā)芽親本)。穗發(fā)芽抗性是按照整穗發(fā)芽率判斷的；整穗發(fā)芽率(％)=(每穗發(fā)芽籽粒數(shù)/每穗總籽粒數(shù))X100% ;最后5個穗的平均值即為該植株的整穗發(fā)芽率。二、分子檢測及QTL分析用以下方法篩選與穗發(fā)芽抗性QTL位點連鎖的分子標記:通過對穗發(fā)芽抗性的鑒定，從220株F2代群體中選取5個高抗穗發(fā)芽小麥(為群體中發(fā)芽率最低的前5株；均命名為R)的單株DNA等質量混合組成抗穗發(fā)芽池(Bk)，5個高感穗發(fā)芽小麥(群體中發(fā)芽率最高的前5株；均命名為S)的單株DNA等質量混合組成感穗發(fā)芽池(Bs)。
將上述選取的5個高抗穗發(fā)芽小麥F2代單株的基因組DNA (R)、5個高感穗發(fā)芽小麥F2代單株的基因組DNA (S)、抗穗發(fā)芽親本CA0431的基因組DNA (Pr)、感穗發(fā)芽親本CA0306的基因組DNA (Ps)、抗穗發(fā)芽池(Bk)和感穗發(fā)芽池(Bs)分別作為模板。再用1375對不同來源的SSR引物(引物名稱和序列見R6der M.S., KorzumV., Wendehake K., Plaschke J.，Tixier M.H., Leroy P.and Ganal M.ff.1998.Amicrosatellite map of wheat.Geneticsl49:2002_2023和美國 graingene協(xié)作網(wǎng) http://wheat, pw.usda.gov)分別進行擴增,篩選多態(tài)性引物。每對SSR引物對應的PCR反應體系(20 u I):2 yl模板DNA (終濃度20ng/yl，)、
0.2u I Taq酶(0.05U/為終濃度)、2yl引物對(每條引物0.2 y M為終濃度，每條引物各加 Iu 1，共 2iil)、0.4iil dNTPs(0.2mM 為終濃度)、2.0iillOXPCR 緩沖液和 13.4u I
無菌蒸懼水。10XPCR 緩沖液的組成:Tris-HCl(pH8.3) 100mM、KC1500mM、MgCl215mM 和水。反應程序:94°C預變性5min ;隨后進行37個循環(huán):94°C 60s, 50-61°C (根據(jù)不同引物的退火溫度)60s，72°C 60s ;最后72°C延伸lmin，4°C保存。每份擴增產(chǎn)物中加入5-8 U I變性的載樣指示劑(98%甲酰胺，IOmM EDTA pH8.0，
0.25%溴酚藍和0.25% 二甲苯青)，95°C變性5_10mins。每份變性的擴增樣品5 U I在濃度為6%的變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離，銀染顯色。在親本間共篩選出422對具有多態(tài)性的引物，用422對在雙親間有多態(tài)性的引物對抗、感池進行篩選，其中有59對引物在親本和抗、感池中存在多態(tài)性。然后用這59對引物對小群體(根據(jù)田間表型，篩 選出10個抗穗發(fā)芽單株的DNA與10個感穗發(fā)芽單株的DNA)進行初步篩，得到可能與抗穗發(fā)芽QTL相連鎖的31對引物，分別位于2B、2D、3A、3B、4A、4B、7D染色體上。用這些引物對F2代群體進行基因型分析。應用這31對引物和完備區(qū)間作圖法對F2代群體在北京環(huán)境下的穗發(fā)芽率進行QTL分析。采用MapManager QTXb20軟件將SSR標記先進行定位再進行連鎖分析，用Kosambi函數(shù)將標記間的重組交換率轉換為遺傳圖距單位(Centimorgan, cM)。然后用ICIMapping3.2分析軟件，LOD值閾值取2.0，采用完備區(qū)間作圖法進行QTL分析，結果如圖1所示，箭頭所在位置即為QTL QPhs.caas-2BLoQPhs.caas_2BL位于2BL上，在Xbarcl042_Xmag3319之間，兩個標記遺傳距離約為10cM，可解釋的表型變異為3%，結果如表I所示。表I為F2及F2:3群體中檢測到的抗穗發(fā)芽QTL
# ................SI'S................................#EKI1LODff1...................................................................(%)
北京 2010-2011 (F2) 2BL Xbarcl042-Xmag3319 2.10 0.043.00
北京 2011-2012 (F2:3) 2BL Xbarcl042-Xmag3319 4.50 0.037.66
安陽 2011-201) F2BL Xharc1042-Xmag3319 5.78 0.059.27
平均2BL Xbarcl042-Xmag33I9 6.60 0.049.88抗穗發(fā)芽的基因來自抗性親本CA0431。Jaiswal等(2012)發(fā)現(xiàn)一個QTLQPhs.ccsu-2B.2位于2BL上在Xmwg546和Xgwm526之間，根據(jù)現(xiàn)有的遺傳圖譜分析這個QTL距離QPhs.caas-2BL超過70cM，由此推斷這倆個QTL不是同一個QTL ；Kulwal等(2004)在2BL上發(fā)現(xiàn)一個 QTL QPhs.ccsu-2B.1 位于 Xbcdl119 和 Xfbb335 之間，Mohan 等(2009)在 2BL上又發(fā)現(xiàn)一個 QTL Qphs.ccsu-2B.4 兩側的標記是 XE36M605 和 XE36M607，Kulwal 等(2012)又報道了一個位于2BL上的QTL與DArT標記wPt_0697和wPt_666931緊密連鎖；由于這幾個QTL與QPhs.caas-2BL所使用的標記類型不同，所以他們之間的遺傳距離不能確定，但是從系譜分析發(fā)現(xiàn)CA0431 (河農(nóng)326/ (CA8695/C39//京411))的抗穗發(fā)芽基因有可能來自中國的品種河農(nóng)326，CA8695，和英國品種C39，而以上幾個QTL的親本均來自印度和美國的品種，沒有共同的親本，所以QPhs.caas-2BL很可能不同于以上幾個QTL。Liu等(2008)發(fā)現(xiàn)了一個 QTLQPhs.pseru-2B.1, Munkvold 等(2009)發(fā)現(xiàn)了 QTL QPhs.cnl_2B.1, Singh 等(2010)發(fā)現(xiàn)了 QTL Qphs.usask-2B，這幾個 QTL 位于 2BS 上，顯然與 QPhs.caas_2BL 不同。綜上所述，QPhs.caas-2BL是一個新的抗穗發(fā)芽的QTL。上述SSR引物對中篩選出兩對SSR引物:Xbarcl042引物對和Xmag3319引物對:Xbarc 1042引物對如下(擴增產(chǎn)物的大小約為159bp):5，-GCG CTG CTC CAC AAT TAA TAA CCA ACT C_3’(序列表的序列 I)；5’-GCG CAT ACC AGA TTA GTG ACC GAA CG-3’(序列表的序列 2);Xmag3319 引物對如下(擴增產(chǎn)物的大小約為2150bp):5’-AAA GGA GCT GGA GAG GGA AG-3’(序列表的序列 3)；5’-GGC GGA AAC AAT ACC TCA AA-3’(序列表的序列 4)；其中，Xbarcl042引物對的退火溫度為55°C;Xmag3319引物對的退火溫度為55°C。將用Xbarc 1042引物對和Xmag3319引物對分別擴增上述模板得到的PCR擴增產(chǎn)物送去測序，若Xbarcl042引物對的擴增產(chǎn)物中含有大小為159bp的產(chǎn)物，且Xmag3319引物對的擴增產(chǎn)物中不含有大小為2150bp的產(chǎn)物，則待測小麥為或候選為高抗穗發(fā)芽，若為如下情況，則待測小麥不為或候選不為高抗穗發(fā)芽小麥:I)所述引物對I的擴增產(chǎn)物中含有大小為159bp的產(chǎn)物，且所述引物對2的擴增產(chǎn)物中含有大小為2150bp的產(chǎn)物；2)所述引物對I的擴增產(chǎn)物中不含有大小為159bp的產(chǎn)物，且所述引物對2的擴增產(chǎn)物中不含有大小為2150bp的產(chǎn)物；3)所述引物對I的擴增產(chǎn)物中不含有大小為159bp的產(chǎn)物，且所述引物對2的擴增產(chǎn)物中含有大小為2150bp的產(chǎn)物。其中上述3)的情況，待測小麥為或候選為高感穗發(fā)芽。結果如圖3所示，A為Xbarcl042引物對在親本、抗、感池及抗、感單株的擴增結果；M為marker，Pr為CA0431 (抗穗發(fā)芽親本)，Ps為CA0306 (感穗發(fā)芽親本)，Br為抗穗發(fā)芽池，Bs為感穗發(fā)芽池，R為高抗穗發(fā)芽單株(群體中發(fā)芽率最低的前5株；)，S為高感穗發(fā)芽單株(群體中發(fā)芽率最高的前5株；)，黑色箭頭所指為抗穗發(fā)芽所對應的片段。可以看出高抗穗發(fā)芽單株都擴增出了 159bp的產(chǎn)物；B為Xmag3319引物對在親本、抗、感池及抗、感單株的擴增結果；M 為marker，Pr為CA0431 (抗穗發(fā)芽親本)，Ps為CA0306 (感穗發(fā)芽親本)，Br為抗穗發(fā)芽池，Bs為感穗發(fā)芽池，R為高抗穗發(fā)芽單株(群體中發(fā)芽率最低的前5株；)，S為高感穗發(fā)芽單株(群體中發(fā)芽率最高的前5株；)，黑色尖頭為感穗發(fā)芽對應的片段。可以看出高抗穗發(fā)芽單株都沒有擴增出2150bp的產(chǎn)物。
因此，可以用Xbarcl042引物對和Xmag3319引物對及其擴增產(chǎn)物可以用來篩選或輔助篩選高抗穗發(fā)芽小麥，也可以用來鑒定或輔助鑒定高抗穗發(fā)芽小麥。實施例2、主效QTL位點(QPhs.caas-2BL)及抗穗發(fā)芽專用引物對在鑒定或輔助鑒定高抗穗發(fā)芽中的應用本實驗的目的是為了進一步檢測以下兩個指標:1、小麥抗穗發(fā)芽主效QTL位點QPhs.caas-2BL存在的真實性；2、兩側分子標記Xbarcl042與Xmag3319作為篩選小麥抗穗發(fā)芽主效QTL位點QPhs.caas-2BL的特異性。用抗穗發(fā)芽親本CA0431與感穗發(fā)芽親本CA0306雜種后代F2:3群體進行了驗證:將F2:3代群體220個株系于 2011-2012年種植于北京和河南安陽。群體采用完全隨機區(qū)組設計，2次重復，單行區(qū)，行長lm，50粒/行，在每個重復最后種植親本各2行。UF213群體穗發(fā)芽抗性鑒定2012年6-7月，在北京和安陽進行220個F2:3群體穗發(fā)芽抗性鑒定，每個株系田間取30個麥穗，其余方法同F(xiàn)2代群體的鑒定方法(見實施例1的一)。結果為220個F2:3群體中有21株高抗穗發(fā)芽小麥(編號為3、4、6、8、10和編號為11-26)，其余199株為非高抗穗發(fā)芽小麥(編號為1、2、5、7、9和編號為27-220)；在非高抗穗發(fā)芽小麥中，有12株高感穗發(fā)芽小麥(編號為1、2、5、7、9和編號為27-33)，其余187株(編號為34-220)為非高抗且非高感穗發(fā)芽小麥(穗發(fā)芽率高于抗穗發(fā)芽親本或低于感穗發(fā)芽親本)。2、QTL位點在F2:3群體中的再次檢測驗證對F2群體中檢測到的這個QTL位點，在第二年的F2:3群體中進行了驗證，仍然可以檢測出來，具體指標見表1、圖2 (染色體的短臂在垂直軸的上方，著絲粒的位置在黑色方塊處，遺傳距離在垂直軸的左邊，箭頭所指的位置為QTL位置。LOD值設在2.0，用黑色直線表示。)。QPhs.caas_2BL位于Xbarcl042與Xmag3319之間，兩標記距離約為10.0cM,可解釋表型變異的7.7%和9.3%，加性效應分別為0.03和0.05，抗穗發(fā)芽QTL來自CA0431。同時，對北京2010-2011，北京2011-2012和安陽2011-2012兩年三個環(huán)境的數(shù)據(jù)進行分析驗證，仍然檢測到QPhs.caas-2BL,位于Xbarcl042與Xmag3319之間，可解釋表型變異9.9%，加性效應為0.04。具體結果見表1、圖2。以上驗證結果不但證明這個QTL確實穩(wěn)定存在，而且微衛(wèi)星標記Xbarcl042和Xmag3319作為篩選小麥抗穗發(fā)芽主效QTL位點QPhs.caas-2BL具有特異性。3、專用引物對鑒定F2:3群體的高抗穗發(fā)芽株系提取抗穗發(fā)芽親本CA0431、感穗發(fā)芽親本CA0306、220個F2:3群體株系的基因組DNA作為模板，分別用專用引物Xbarcl042引物對和Xmag3319引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物。擴增反應體系和擴增條件同實施例1的二，其中，Xbarcl042引物對的退火溫度為550C ；Xmag3319引物對的退火溫度為55°C。將不同模板用Xbarcl042引物對的PCR擴增產(chǎn)物和用Xmag3319引物對的PCR擴增產(chǎn)物均送去測序，若Xbarcl042引物對的擴增產(chǎn)物中含有大小為159bp的產(chǎn)物，且Xmag3319引物對的擴增產(chǎn)物中不含有大小為2150bp的產(chǎn)物，則待測小麥為或候選為高抗穗發(fā)芽，
若為如下情況，則待測小麥不為或候選不為高抗穗發(fā)芽小麥:1)所述引物對I的擴增產(chǎn)物中含有大小為159bp的產(chǎn)物，且所述引物對2的擴增產(chǎn)物中含有大小為2150bp的產(chǎn)物；2)所述引物對I的擴增產(chǎn)物中不含有大小為159bp的產(chǎn)物，且所述引物對2的擴增產(chǎn)物中不含有大小為2150bp的產(chǎn)物；3)所述引物對I的擴增產(chǎn)物中不含有大小為159bp的產(chǎn)物，且所述引物對2的擴增產(chǎn)物中含有大小為2150bp的產(chǎn)物。其中若為上述3)的情況，則待測小麥為或候選為高感穗發(fā)芽小麥；若為上述I)或
2)的情況，則待測小麥為或候選為非高抗且非高感穗發(fā)芽小麥。部分株系結果如圖4和圖5所示，圖4為Xbarcl042引物對在抗穗發(fā)芽親本CA0431、感穗發(fā)芽親本CA0306及部分F2:3群體擴增結果；PS為感穗發(fā)芽親本CA0306 ；PE:抗穗發(fā)芽親本CA0431 ;黑色尖頭為抗穗發(fā)芽對應的片段；1_10:編號為1-10的F2:3株系(編號為3、4、6、8、10是已經(jīng)鑒定出的高抗穗發(fā)芽F2:3代株系、編號為1、2、5、7、9是已經(jīng)鑒定出的高感穗發(fā)芽F2:3代株系，屬于非高抗穗發(fā)芽F2:3代株系)，可以看出，編號為1、3、4、6、7、8、10株系能擴增出159bp的片段；圖5為Xmag3319弓丨物對在抗穗發(fā)芽親本CA0431、感穗發(fā)芽親本CA0306及部分F2:3群體擴增結果；PS為感穗發(fā)芽親本CA0306 ；PE:抗穗發(fā)芽親本CA0431 ;黑色尖頭為感穗發(fā)芽對應的片段；1_10:編號為1-10的F2:3株系(編號為3、4、6、8、10是已經(jīng)鑒定出的高抗穗發(fā)芽F2:3代株系、編號為1、2、5、7、9是已經(jīng)鑒定出的高感穗發(fā)芽F2:3代株系);可以看出，1-10中編號為3、4、6、8、9、10的株系沒有擴增出2150bp的片斷。結合上述兩對引物的結果，可以看出，編號為3、4、6、8、10的F2:3代株系Xbarcl042引物對的擴增產(chǎn)物中含有大小為159bp的產(chǎn)物，且Xmag3319引物對的擴增產(chǎn)物中不含有大小為2150bp的產(chǎn)物；說明編號為3、4、6、8、10的F2:3代株系為高抗穗發(fā)芽小麥，這與用I鑒定的結果一致，說明本發(fā)明的方法可以鑒定出高抗穗發(fā)芽小麥。編號為2、5的F2:3代株系Xbarcl042引物對的擴增產(chǎn)物中不含有大小為159bp的產(chǎn)物，且Xmag3319引物對的擴增產(chǎn)物中含有大小為2150bp的產(chǎn)物；編號為1、7的F2:3代株系為Xbarcl042引物對的擴增產(chǎn)物中含有大小為159bp的產(chǎn)物，且Xmag3319引物對的擴增產(chǎn)物中含有大小為2150bp的產(chǎn)物；編號為9的F2:3代株系Xbarcl042引物對的擴增產(chǎn)物中不含有大小為159bp的產(chǎn)物，且Xmag3319引物對的擴增產(chǎn)物中不含有大小為2150bp的產(chǎn)物；說明編號為1、2、5、7、9的F2:3代株系均為非高抗穗發(fā)芽小麥，這與用I鑒定這幾株均為非高抗的結果一致。其他株系的鑒定結果如下:編號為11-26的F2:3代株系Xbarcl042引物對的擴增產(chǎn)物中含有大小為159bp的產(chǎn)物，且Xmag3319引物對的擴增產(chǎn)物中不含有大小為2150bp的產(chǎn)物，說明編號為11_26的F2:3代株系為高抗穗發(fā)芽小麥；編號為27-33的F2:3代株系Xbarcl042引物對的擴增產(chǎn)物中不含有大小為159bp的產(chǎn)物，且Xmag3319引物對的擴增產(chǎn)物中含有大小為2150bp的產(chǎn)物，說明編號為27-33的F213代株系為高感穗發(fā)芽小麥；編號為34-110的F2:3代株系Xbarcl042引物對的擴增產(chǎn)物中含有大小為159bp的產(chǎn)物，且Xmag3319引物對的擴增產(chǎn)物中含有大小為2150bp的產(chǎn)物；編號為111-220的F2:3代株系Xbarcl042引物對的擴增產(chǎn)物中不含有大小為159bp的產(chǎn)物，且Xmag3319引物對的擴增產(chǎn)物中不含有大小為2150bp的產(chǎn)物；說明編號為34-220的F2:3代株系均為非高抗非高感穗發(fā)芽小麥；上述可以看出，編號為27-33、編號為34-220的F2:3代株系均為非高抗發(fā)芽小麥。上述結果與用I方法鑒定是否為高抗穗發(fā)芽小的結果一致，說明本發(fā)明的方法正
確。·
權利要求
1.篩選或輔助篩選高抗穗發(fā)芽小麥的專用引物，由如下引物對I和引物對2組成:所述引物對I由序列表中序列I所示的單鏈DNA分子和序列表中序列2所示的單鏈DNA分子組成；所述引物對2由序列表中序列3所示的單鏈DNA分子和序列表中序列4所示的單鏈DNA分子組成。
2.根據(jù)權利要求1所述的引物對，其特征在于:所述引物對I和所述引物對2獨立包裝； 所述篩選或輔助篩選高抗穗發(fā)芽小麥為從抗穗發(fā)芽親本小麥和感穗發(fā)芽親本小麥雜交的后代中篩選或輔助篩選高抗穗發(fā)芽小麥； 所述高抗穗發(fā)芽小麥為穗發(fā)芽率低于或等于抗穗發(fā)芽親本。
3.含有權利要求1或2所述的專用引物的篩選或輔助篩選高抗穗發(fā)芽小麥的PCR試劑組。
4.根據(jù)權利要求3所述的PCR試劑組，其特征在于:所述PCR試劑組由PCR試劑I和PCR試劑2組成: 所述PCR試劑1由權利要求1或2所述的專用引物中的引物對1、PCR擴增緩沖液、dNTPs、DNA聚合酶和水組成； 所述PCR試劑2由權利要求1或2所述的專用引物中的引物對2、PCR擴增緩沖液、dNTPs、DNA聚合酶和水組成。
5.根據(jù)權利要求4所述的PCR試劑組，其特征在于: 所述引物對I中的每條引物在其對應所述PCR試劑I中的終濃度均為0.2 ii M ; 所述引物2中的每條引物在其對應所述PCR試劑2中的終濃度均為0.2 ii M ; 所述篩選或輔助篩選高抗穗發(fā)芽小麥為從抗穗發(fā)芽親本小麥和感穗發(fā)芽親本小麥雜交的后代中篩選或輔助篩選高抗穗發(fā)芽小麥； 所述高抗穗發(fā)芽小麥為穗發(fā)芽率低于或等于抗穗發(fā)芽親本。
6.篩選或輔助篩選高抗穗發(fā)芽小麥的PCR擴增試劑盒，包括權利要求1或2所述的專用引物或權利要求3-5中任一所述的PCR試劑組； 所述篩選或輔助篩選高抗穗發(fā)芽小麥為從抗穗發(fā)芽親本小麥和感穗發(fā)芽親本小麥雜交的后代中篩選或輔助篩選高抗穗發(fā)芽小麥； 所述高抗穗發(fā)芽小麥為穗發(fā)芽率低于或等于抗穗發(fā)芽親本。
7.權利要求1或2所述的專用引物、權利要求3-5中任一所述的PCR試劑組或權利要求6所述PCR擴增試劑盒在篩選或輔助篩選待測樣本為高抗穗發(fā)芽小麥中的應用； 或權利要求1或2所述的專用引物、權利要求3-5中任一所述的PCR試劑組或權利要求6所述PCR擴增試劑盒在鑒定或輔助鑒定待測樣本為高抗穗發(fā)芽小麥中的應用； 所述待測樣本具體為抗穗發(fā)芽親本小麥和感穗發(fā)芽親本小麥雜交的后代或者親本本身；所述高抗穗發(fā)芽小麥具體為穗發(fā)芽率低于或等于抗穗發(fā)芽親本。
8.一種鑒定或輔助鑒定待測小麥是否為高抗穗發(fā)芽小麥的方法，包括如下步驟:分別用權利要求1或2所述的專用引物、權利要求3-5中任一所述的PCR試劑組或權利要求6所述PCR擴增試劑盒的引物對I和引物對2對待測小麥進行PCR擴增，檢測擴增產(chǎn)物； 若所述引物對I的擴增產(chǎn)物中含有大小為159bp的產(chǎn)物，且所述引物對2的擴增產(chǎn)物中不含有大小為2150bp的產(chǎn)物，則待測小麥為或候選為高抗穗發(fā)芽小麥；若為如下情況，則待測小麥不為或候選不為高抗穗發(fā)芽小麥: 1)所述引物對I的擴增產(chǎn)物中含有大小為159bp的產(chǎn)物，且所述引物對2的擴增產(chǎn)物中含有大小為2150bp的產(chǎn)物； 2)所述引物對I的擴增產(chǎn)物中不含有大小為159bp的產(chǎn)物，且所述引物對2的擴增產(chǎn)物中不含有大小為2150bp的產(chǎn)物； 3)所述引物對I的擴增產(chǎn)物中不含有大小為159bp的產(chǎn)物，且所述引物對2的擴增產(chǎn)物中含有大小為2150bp的產(chǎn)物。
9.根據(jù)權利要求8所述的方法，其特征在于: 所述待測樣本為抗穗發(fā)芽親本小麥和感穗發(fā)芽親本小麥雜交的后代或者親本本身； 所述高抗穗發(fā)芽小麥 為穗發(fā)芽率低于或等于抗穗發(fā)芽親本； 所述PCR擴增的模板為待測小麥的基因組DNA。
10.小麥穗發(fā)芽抗性的數(shù)量性狀基因位點，定位于2B染色體長臂上，位于SSR引物位點Xbarc 1042 和 Xmag3319 之間。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種篩選或輔助篩選高抗穗發(fā)芽小麥的方法及其專用引物。本發(fā)明提供了篩選或輔助篩選高抗穗發(fā)芽小麥的專用引物，由如下引物對1和引物對2組成所述引物對1由序列表中序列1所示的單鏈DNA分子和序列表中序列2所示的單鏈DNA分子組成；所述引物對2由序列表中序列3所示的單鏈DNA分子和序列表中序列4所示的單鏈DNA分子組成。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明提供了利用CA0431/CA0306產(chǎn)生的后代群體進行QTL定位，找到與CA0431穗發(fā)芽抗性基因緊密連鎖的分子標記QTL(QPhs.caas-2BL)，且基于該主效QTL篩選出了輔助篩選抗穗發(fā)芽小麥的專用引物，利用專用引物可以篩選或輔助篩選抗穗發(fā)芽小麥，從而培育抗穗發(fā)芽品種。
文檔編號C12Q1/68GK103160584SQ20131010653
公開日2013年6月19日 申請日期2013年3月29日 優(yōu)先權日2013年3月29日
發(fā)明者陳新民, 苗西磊, 何中虎 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所