專利名稱：Ring1蛋白在提高植物對水稻矮縮病毒抗性中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，尤其涉及RINGl蛋白在提高植物對水稻矮縮病毒抗性中的應用。
背景技術：
水稻矮縮病毒(Rice Dwarf Virus,RDV)是呼腸孤病毒科(Reoviridae)植物呼腸孤病毒屬(Phytoreovirus)的成員。RDV是引起水稻矮縮病的病原,可以感染水稻,造成水稻嚴重減產。RDV的傳播需借助于昆蟲介體葉蟬。RDV為雙鏈RNA病毒，其基因組為十二條雙鏈RNA。根據這十二條雙鏈RNA在聚丙烯酰胺凝膠電泳中的遷移率由慢到快，分別命名為SI到S12。RDV基因組編碼至少七種結構蛋白，包括P1、P2、P3、P5、P7、P8、P9 ;五種非結構蛋白，包括卩1184、？1186、？11810、？11811、？11812。P2是RDV的外殼蛋白，由S2編碼，它能夠與水稻內根-貝殼杉烯氧化酶及其類似蛋白相互作用，引起水稻赤霉素含量的降低，是造成水稻矮縮癥狀的原因之一(Zhu etal.，2005.The Rice Dwarf Virus P2Protein interacts with ent—Kaurene Oxidases invivo, leading to reduced biosynthesis of Gibberellins and rice dwarf symptoms.Plant Physiology.139:1935-1945.)。另外，P2在RDV的昆蟲介體葉蟬細胞中，能夠引起細胞膜的融合，說明該蛋白在RDV侵染葉蟬過程中發揮作用(Zhou et al.,2007, TheP2capsid protein of the nonenveloped rice dwarf phytoreovirus induces membranefusion in insect host cells.Proceedings of the National Academy of Sciences ofUSA.104(49):19547-19552.)。酵母雙雜交是研究蛋白-蛋白相互作用的重要技術，通過研究蛋白之間的相互作用，可以深入了解蛋白在生物體內的功能。泛素是一種廣泛存在于真核生物中的小分子蛋白。它由76個氨基酸殘基組成，在各個物種中是高度保守的。在蛋白的泛素化過程中，泛素C末端的甘氨酸在多種酶的催化作用下與底物中特定氨基酸殘基(大部分情況為賴氨酸殘基)共價相連，通常有多個泛素分子被依次連接在底物蛋白的特定位點上。如果后續的泛素分子被連接到前一個泛素分子的48位賴氨酸上，那么，被修飾的底物蛋白將被26S蛋白酶體識別并降解，釋放出游離的泛素分子參與新的反應。通常情況下，蛋白的泛素化修飾需要三個步驟。首先，泛素與泛素活化酶(ubiquitin-activating enzyme, El)通過硫酯鍵相連,形成活性狀態。然后,活化的泛素被傳遞給泛素連接酶(ubiquitin-conjugating enzyme,E2),兩者也是通過硫酯鍵相連。最后，由蛋白-泛素連接酶(ubiquitin ligase enzyme,E3)識別并結合底物蛋白，催化E2上的泛素轉移到底物上。該過程重復發生，底物蛋白就被加上了多個泛素分子的長鏈。E3是底物特異性的決定因子。生物體內E3數量龐大，可以分為很多不同的類型。以擬南芥為例，根據E3分子中亞基的組成和其作 用方式的不同，可將其分為以下幾種類型:含有 RING (Really Interesting New Gene) finger 的 E3、含有 HECT (Homology toE6_Associated Carboxy-Terminus) Domain 的 E3、含有 U_box 的 E3、CRLs (Cullin - RINGLigases)。其中 CRLs 又可分為四種不同的類型:SCF (the S phase kinase-associatedproteinl (SKPl) - culI ini (CULl) - F-box complex)、BTB (the bric-a-brac -tramtrack - broad complex)、DDB (the DNA damage-binding Complex) 和 APC (theanaphase-promoting complex)。真核生物大部分的蛋白降解事件都是由泛素-蛋白酶體系統(Ubiquitin_26SProteasome System,以下簡稱為UPS)控制的，UPS介導的蛋白降解對于植物應對外界生物和非生物刺激有非常重要的意義，使得植物能在惡劣的環境下存活下來(Dreher andCallis, 2007)。不僅如此，UPS還能選擇性地清除合成過程中出錯的蛋白，避免這些蛋白對生物體造成危害。
蛋白的泛素化降解途徑在植物對抗病原微生物過程中也發揮著重要的作用。植物生長過程中不可避免的會遭遇病毒、細菌、真菌、線蟲、昆蟲等生物的危害，但是植物受到這些有害物種的侵害時并不都會產生病癥，這是因為植物本身具有多種防御系統來對抗這些外來侵害。近些年，越來越多的證據暗示，UPS在植物應對病原物的過程中可能起著重要的作用。但是，蛋白的泛素化降解是特異性的，其特異性由與蛋白相互作用的E3酶決定，相對于生物體中存在的數量龐大的E3酶，目前已知的E3酶與其底物的對應關系僅有少量報道。有關RDV的在先研究從未提及該病毒與任何水稻E3酶的相互作用，也沒有報道表明任何水稻E3酶具有抗RDV作用。

發明內容
本發明的一個目的是提供蛋白RINGl或其編碼基因或含有所述編碼基因的重組載體的用途。本發明提供的蛋白RINGl或其編碼基因或含有所述編碼基因的重組載體在調控植物抗水稻矮縮病中的應用；所述蛋白RINGl的氨基酸序列為序列表中的序列I。上述應用中，所述水稻矮縮病的病原為水稻矮縮病毒(Rice Dwarf Virus)。上述應用中，所述植物為單子葉植物或雙子葉植物，上述單子葉植物為水稻。上述應用中，所述含有所述編碼基因的重組載體為將蛋白RINGl的編碼基因插入表達載體中得到的重組載體；在本發明的實施例中，重組載體PCambial301-FlagRINGl制備方法按照實施例2的一的方法進行。所述蛋白RINGl的編碼基因的核昔酸序列具體為序列表中的序列2。本發明的另一個目的是提供一種培育轉基因植物的方法。本發明提供的方法，包括如下步驟:將蛋白RINGl的編碼基因導入目的植物中，得到轉基因植物，所述轉基因植物的水稻矮縮病抗性高于所述目的植物；所述蛋白RINGl的氨基酸序列為序列表中的序列I。上述方法中，所述蛋白RINGl的編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列2。上述方法中，所述水稻矮縮病的病原菌為水稻矮縮病毒(Rice Dwarf Virus)。上述方法中，所述蛋白RINGl的編碼基因通過重組載體導入目的植物；所述重組載體為將所述蛋白RINGl的編碼基因插入表達載體中得到的重組載體。在本發明的實施例中，重組載體pCambial301-FlagRINGl制備方法按照實施例2的一的方法進行。上述方法中，所述植物為單子葉植物或雙子葉植物，上述單子葉植物為水稻。所述轉基因植物的水稻矮縮病抗性高于所述目的植物具體體現在接RDV后，所述轉基因植物的感染的RDV病毒的植株數目少于所述目的植物；可通過鑒定是否含有RDV病毒的目的基因(S2的部分片段)或者植株的感病特征來確定感染的RDV病毒的植株。本發明的另一個目的是提供一種重組載體。本發明提供的重組載體，為將蛋白RINGl的編碼基因插入表達載體中得到的重組載體；所述蛋白RINGl的氨基酸序列為序列表中的序列I ;所述蛋白RINGl的編碼基因的核昔酸序列具體為序列表中的序列2。在本發明的實施例中，重組載體pCambial301_FlagRINGl制備方法按照實施例2的一的方法進行。上述蛋白RINGl在作為蛋白-泛素連接酶中的應用也是本發明保護的范圍；所述 蛋白RINGl的氨基酸序列為序列表中的序列I。其中植物表達載體包括但不局限于pCambial300、pCambial301、pCambia3301、P麗101等；水稻品種優選為對RDV敏感的品種如中花11、秀水11、日本晴、武3等；水稻組織或細胞的轉化方法可選自農桿菌介導法、基因槍法、電擊法、花粉管導入法、脂質體融合法以及其他任意可將質粒導入的方法。本領域的技術人員懂得，通過置換、取代、附加或缺失蛋白序列中的一個或多個氨基酸，可對其進行修飾而不改變其功能。因此，本發明應該被理解為包括了對RINGl蛋白進行的上述修飾。RINGl基因的喊基序列不局限于序列表中序列2所不，還包括具有將RINGl及帶有上述修飾的RINGl蛋白中各氨基酸殘基對應的任一密碼子進行選擇并組合的DNA序列。該密碼子的選擇可以按照常規方法，也可以參考宿主的密碼子偏好型。本發明的實驗證明，本發明發現RINGl是一種E3蛋白-泛素連接酶，它能夠與RDV外殼蛋白P2相互作用，促使P2被26S蛋白酶體降解；在水稻中過量表達RINGl蛋白，可以降低P2的累積量，從而抑制病毒的擴增，提高水稻的抗病毒能力。


圖1為P2和RINGl蛋白在酵母中相互作用的結果圖2為免疫共沉淀實驗驗證P2和RINGl相互作用的結果圖3為體外實驗證明RINGl具有E3蛋白-泛素連接酶活性的結果圖4為P2和RINGl在293T細胞中共表達的免疫印跡檢測結果圖5為轉RINGl水稻的Western鑒定圖6為轉RINGl水稻和野生型水稻在RDV侵染后的RDV病毒相關基因的RT-PCR檢測圖7為健康和感病(感染RDV)水稻癥狀圖具體實施方式
下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。以下將用實施例對本發明進行詳細說明，但這些實施例并非對本發明的限制。實施例1、RINGl蛋白及其編碼基因的獲得一、RINGl蛋白及其編碼基因的獲得水稻文庫的構建所用試劑盒為HybriZAP-2.ITwo-Hybrid Predigested Vector/Gigapack Cloning Kit (Stratagene),文庫構建及篩選方法根據說明書進行。所用誘館克隆PGBK-S2與專利號ZL200510114386.X所公布克隆相同。所用酵母菌株為AH109。篩選得到的陽性克隆經測序和序列分析，確定其編碼的蛋白片段具有序列表中序列I所示的氨基酸序列的12-308個氨基酸，將該蛋白全長(即序列I對應蛋白)命名為RING1，其編碼基因為序列表中序列2所示的核苷酸，將其命名為RINGl。二、RINGl全長序列的克隆及含有該片段的重組載體的獲得根據序列2設計引物，并在引物兩端加上所需酶切位點，引物序列為RING1-5’EcoR1:5’ -GAATTCATGGATCTGGAGAGGTCG-3’，RING1-3’ Sal1:5’ -GTCGACTTACAAGAATGGCGGCATCC-3，。依照說明書，用Invitrogen公司的TRIzol Reagent提取中花11水稻(Oryzasativa L.japonica cv.ZhonghualI,許昱等《“中花11”水稻谷蛋白Gtl基因克隆及臘質基因啟動子引導Gtl基因表達載體的構建》，上海師范大學學報(自然科學版)，2010年4月第39卷第2期,204頁,公眾可從北京大學獲得)的總RNA,用該公司的SuperScript II逆轉錄酶進行逆轉錄，得到cDNA。逆轉錄所用引物為16個核苷酸的Oligod (T)引物。以逆轉錄所得cDNA為模板，以上述基因特異性引物RING1-5’ EcoRI和RING1-3’SalI 進行 PCR (Polymerase Chain Reaction)反應，得到 1287bp 的 PCR 產物，該PCR產物具有序列表中序列2所示的核苷酸。回收PCR產物后用限制性內切酶EcoR I和Sal I進行酶切，回收1285bp帶有粘性末端的PCR產物；將載體pGADT7 (Clontech公司，產品目錄號:630442)用限制性內切酶EcoR I和Sal I雙酶切，回收7987bp載體骨架；將上述1285bp帶有粘性末端的PCR產物與7987bp載體骨架用T4連接酶連接，轉化大腸桿菌菌株DH5 α，得到轉化子。提取轉化子的質粒送去測序，該質粒為將序列表中序列2所示的基因RINGl插入載體pGADT7的EcoR I和Sal I酶切位點間得到的載體，將該質粒命名為pGAD-RINGl，即為重組載體。實施例2、體外證明RINGl蛋白與RDV P2的相互作用一、酵母雙雜交實驗證明RINGl與RDV P2的相互作用將實施例1得到的重組載體pGAD-RINGl與pGBK_S2 (S2為RDV P2蛋白的編碼基因，RDV P2蛋白的編碼基因導入pGBK中得到的。記載該載體的非專利文獻為Zhu etal.，2005.The Rice Dwarf Virus P2Protein interacts with ent—Kaurene Oxidases invivo, leading to reduced biosynthesis of Gibberellins and rice dwarf symptoms.Plant Physiology.139:1935-1945 ;公眾可從北京大學獲得)共轉化酵母菌株AH109 (購自Clontech公司，產品目錄號為630444)，酵母轉化方法采用公知的PEG/LiAc法；轉化后的酵母細胞涂布營 養缺陷型平板SD/-Trp-LeU，3(TC條件下培養2天。轉化子劃線至SD/-Trp-Leu-His-Ade營養缺陷型平板,30°C培養4天,觀察轉化子的生長情況。該實驗同時設負對照 pGADT7(產品目錄號為:630442)和 pGBK_S2、pGAD_RINGl 和 pGBK(購自 Clontech公司產品目錄號為630443)。結果如圖1 所示(A:pGAD-RINGl 和 pGBK_S2 ；B:pGADT7 和 pGBK_S2 ；C:pGAD-RINGl和pGBK)。結果證明，RINGl全長蛋白與RDV P2能在酵母中相互作用。二、免疫共沉淀實驗證明RINGl與RDV P2的相互作用UpWMlOl-FLAGHPRl 及 pCambial301_HAS2 克隆的構建以pGAD-RINGl 質粒為模板，以引物 FLAGRING1-5’ KpnI (序列為:5’-GGTACCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAGATGGATCTGGAGAGGTCG-3’)和 RING1-3’PstI (序列為:5’_CCTGCAGTTACAAGAATGGCGGCATC-3’ )進行 PCR 擴增，得到 1314bp 的 PCR 產物。將PCR產物用Kpn I和Pst I雙酶切，回收1312bp的酶切產物；ρ^101質粒(參見趙燕等《薺菜CRABS CLAff的克隆與擬南芥遺傳轉化》，《西北植物學報》2009年第11期第2162頁，公眾可從北京大學獲得)用Kpn I和Pst I雙酶切，回收9923bp的載體骨架；將1321bp的酶切產物和9923bp的載體骨架用T4DNA連接酶進行連接，得到重組質粒pWMlOl-FLAGHPRl (含有序列2所示的RINGl和FLAG標簽)。pCambial301-HAS2 (記載該載體的非專利文獻為:Zhu et al., 2005.The RiceDwarf Virus P2Protein interacts with ent—Kaurene Oxidases in vivo, leadingto reduced biosynthesis of GibberelI ins and rice dwarf symptoms.PlantPhysiology.139:1935-1945 ;公眾可從北京大學獲得)，其為將HAS2 (HAP2是在P2蛋白上帶了 HA標簽)構建入pCambial301。pWMlOl-FLAGRINGl 和 pCambial301_HAS2 分別轉化農桿菌 EHA105，轉化方法為公知的電擊轉化方法，得到 EHA105/pWM101-FLAGRINGl 和 EHA105/pCambial301-HAS2。2、HAP2和FLAGRING1在煙草中的表達分別挑取EHA105/pWM101-FLAGRINGl 和 EHA105/pCambial301-HAS2 單菌落，接A 2ml LB 液體培養基(含有 Kanamycinl00mg/L, Rifampicin50mg/L), 28°C振蕩培養 16hr(hr為小時hour的簡寫)。1:50轉接入10ml LB液體培養基(含有Kanamycinl00mg/L,Rifampicin50mg/L),繼續培養至OD6tltl約為0.8。4000rpm (rpm為每分鐘轉速)離心5min(min 為分鐘)收菌。AS buffer (IOmM MES, 150 μ M AS, IOmM MgCl2)重懸，調 OD6tltl 至 1.0。將兩種菌液以1:1 (體積)混合，通過壓力注射方法注射煙草N.benthamiana(記載該煙草的非專利文獻為 Zhu et al., 2005.The Rice Dwarf Virus P2Proteininteracts with ent-Kaurene Oxidases in vivo, leading to reduced biosynthesis ofGibberellins and rice dwarf symptoms.Plant Physiology.139:1935-1945.公眾可從北京大學獲得)并分別單獨取兩種菌懸液通過壓力注射方法注射煙草作為負對照。煙草繼續生長3天后，將注射的葉片置于液氮中研磨成粉末。3、免疫共沉淀實驗取約500mg上述葉片粉末加入1.5ml離心管中，加入Iml IP Buffer (150mMNaCl,50mM Tris-Cl (pH7.5),0.l%NP_40，5mM DTT，每 50ml 加 I 片蛋白酶抑制劑(ProteaseInhibitor Cocktail Tablets, EDTA-free ;Roche),混勻后 4°C, 12000rpm 離心 IOmin,將上清吸出轉移至新的離心管中。 再次以上面條件離心5min，將上清吸出轉移至新的離心管中，防止吸到沉淀，得到煙草蛋白提取物。
在上述步驟中得到的煙草蛋白提取物中加入20 μ I protein G beads (GEhealthcare，17-0618-06)，同時加入 0.2μ1 FLAG 抗體(Sigma，F3165)，4°C溫育 1.5hr。4°C, IOOOrpm 離心 lmin,吸掉上清。用 IP Buffer 洗 beads3 次。加入 50 μ 13Xproteinsample buffer (125mM Tris-Cl (pH6.8)，20% 甘油，6%SDS，0.004% 溴酚藍，30mM DTT), 95°C加熱5min，吸取上清進行SDS-PAGE。SDS-PAGE及Western Blot依照公知方法及產品說明書進行。所用抗體為ant1-FLAG-HRP (sigma)和 ant1-HA-Peroxidase (Roche)。結果如圖2所示，表明用FLAG抗體能夠將FLAGRING1和HAP2同時沉淀下來，說明這兩種蛋白之間相互作用。三、RINGl具有 E3 蛋白-泛素連接酶(E3Protein_Ubiquitine Ligase)活性1、表達克隆構建及蛋白的表達以pGAD-RINGl 質粒為模板，用 RING1-5’EcoRI (序列為:5’ -GAATTCATGGATCTGGAGAGGTCG-3’ 和 RING1-3’ SalI (序列為:5’ -GTCGACTTACAAGAATGGCGGCATCC-3’ )進行PCR擴增，得到1314bp的PCR產物。1314bp的PCR產物以EcoR I和Sal I雙酶切后，凝膠電泳回收1312bp的酶切產物；將 pMAL-p2x 質粒(New England Biolabs, E8000S,本身表達 MBP 蛋白)EcoR I 和 SalI雙酶切，凝膠電泳回收6703bp的載體骨架；將1312bp的酶切產物和6703bp的載體骨架以T4DNA連接酶連接，得到重組載體pMAL-p2x-RINGl，經過測序，該重組載體為將序列表中序列2所示的DNA分子插入pMAL-p2x的EcoR I和Sal I酶切位點間得到的載體，命名為pMAL-p2x-RINGl0將pMAL_p2x_RINGl和pMAL_p2x質粒分別轉化原核表達菌株Rosetta (DE3):取0.5μ I質粒，加入50 μ I 感受態細胞中，混勻后冰上靜置30min ;42°C熱激90sec，加入Iml新鮮LB培養基，37°C振蕩培養Ihr ；3000rpm離心2min收集菌體，涂布LB平板(含100mg/LAmpicillin)，得到 Rosetta (DE3) /pMAL-p2x-RINGl (EcoR I 和 Sal I 雙酶切鑒定，得到1312bp的酶切產物的為陽性)和Rosetta (DE3) /pMAL_p2x。分別挑Rosetta (DE3)/pMAL_p2x_RINGl 和 Rosetta (DE3)/pMAL_p2x 單菌落接于5ml LB培養基中(含100mg/L Ampicillin)，37°C過夜培養。1:200轉接于300ml LB培養基中(含100mg/L Ampicillin)培養至0D600約為0.6。加入IPTG至終濃度ImM，誘導表達 4hr,得到 Rosetta (DE3) /pMAL-p2x-RINGl 菌液和 Rosetta (DE3) /pMAL-p2x 菌液。2、體外泛素化實驗檢測E3活性分別取IOOml Rosetta (DE3)/pMAL-p2x-RINGl 菌液和 Rosetta (DE3)/pMAL-p2x菌液,5000rpm離心IOmin收集菌體。力口入5ml破菌緩沖液(20mM Tris-Cl pH7.5, IOOmMNaCl，0.1%ΝΡ-40, ImM DTT, 0.0lM PMSF)，超聲破碎。4°C，12000rpm,離心20min取上清液，SP得到 Rosetta (DE3)/pMAL_p2x_RINGl 菌體蛋白(MBP-RING1)和 Rosetta (DE3)/pMAL-p2x菌體蛋白(MBP)。吸取40 μ I Amylose resin (NEB),用 Iml 破菌緩沖液洗,6000rpm,離心 15sec,吸去上清；重復洗一次。加入500 μ I破菌緩沖液，I μ I Rosetta (DE3) /pMAL-p2x-RINGl菌體蛋白或Rosetta (DE3)/pMAL-p2x菌體蛋白，室溫結合1.5hr (用靜音混合器)，用20mMTris-Cl (pH7.5)洗漆4次,吸凈液體,得到結合后Amylose resin。
在結合后Amylose resin中加入:20 X buffer 1.5 μ IEl (recombinant wheat(Triticum aestivum)El(G1:136632)) 3 μ IE2 (產品名稱:Recombinant Human UBCh5b，出售公司:R&D，貨號:Ε2_622_100)3 μ IHis-Ub (UBQ14, At4g02890) 6 μ I加雙蒸水至總體積為30 μ I。30 °C 950rpm 反應 2.5hr。加入15 μ 13Xprotein loading buffer, 10CTC加熱 5min,取上清進行 SDS-PAGE。用 ant1-His 抗體(KPL，24-01-01)，依據產品說明書進行 Western Blot。20 Xbuffer # IMTris-Cl pH7.5,40mM ATP, IOOmM MgCl2,40mM DTT。所用其余均為商品化試劑，可從試劑公司購得，并依照說明書進行實驗操作。結果如圖3所示，與Rosetta (DE3) /pMAL-p2x菌體蛋白(MBP)相比，在RINGl存在時Rosetta (DE3) /pMAL-p2x-RINGl菌體蛋白(MBP-RING1)能夠檢測到蛋白泛素化產生的大分子量蛋白條帶，表明RINGl具有E3蛋白-泛素連接酶活性。四、RINGl與RDV P2在293T細胞中的共表達1、表達載體的構建I)重組質粒 pRK-FLAGRINGlpGAD-RINGl 為模板，以引物 RKRING1-5’ SalI (序列為:5’ -TATTGTCGACGATGGATCTGGAGAGGTCG-3’)和 RKRING1-3’ XhoI (序列為:5’ -GGCCTCGAGTTACAAGAATGGCGGCATC-3’)進行PCR擴增，得到1329bp的PCR產物。將上述PCR產物用Sal I和Xho I雙酶切，回收酶切產物，與經過同樣酶切 pRK-FLAG 質粒(參見 Min Lian and Xiaofeng Zheng, HSCARG Regulates NF- κ BActivation by Promoting the Ubiquitination of RelA or COMMDI,J Biol Chem.2009July3 ;284(27): 17998 - 18006.公眾可從北京大學獲得；)得到的6300bp的載體骨架連接，得到重組質粒pRK-FLAGRINGl，經過測序，重組質粒pRK-FLAGRINGl為將序列表中序列2所示的DNA分子插入pRK-FLAG質粒的Sal I和Xho I酶切位點間得到的載體。2 )重組質粒 pRK-HAS2pGBK_S2 (參見 Zhu et al., 2005.The Rice Dwarf Virus P2Protein interactswith ent-Kaurene Oxidases in vivo,leading to reduced biosynthesis ofGibberellins and rice dwarf symptoms.Plant Physiology.139:1935-1945..公眾可從北京大學獲得；)為模板，以引物RKS2-5’ SalI (序列為:5’ -CACCGTCGACCGCTTATCCTAATGACGTCAG-3’)和 RKS2-3’ Not I (序列為:5’ -ATTGCGGCCGCTCACAATGCATCATAGATAGATTG-3’)進行PCR擴增，得到3483bp的PCR產物。將上述PCR產物用Sal I和Not I雙酶切，回收酶切產物，與經過同樣酶切pRK_HA質粒(參見 Min Lian and Xiaofeng Zheng, HSCARG Regulates NF- κ B Activation byPromoting the Ubiquitination of RelA or COMMDI, J Biol Chem.2009July3;284(27):17998 - 18006.公眾可從北京大學 獲得；)得到的6300bp的載體骨架連接，得到連接產物。取5μ I連接產物，轉化DH5a，涂布含有100mg/L Ampicillin的LB平板，37°C倒置培養16hr。挑取單菌落進行PCR鑒定，陽性克隆進行測序。所得質粒為PRK-HAS2，是用于表達RDV P2的質粒。3)共表達pRK-FLAGRINGl 和 pRK_HAS2 共轉染 HEK293T 細胞(參見 Min Lian and XiaofengZheng, HSCARG Regulates NF-κ B Activation by Promoting the Ubiquitination ofRelA or COMMDI, J Biol Chem.2009July3; 284 (27): 17998 - 18006.公眾可從北京大學獲得；)，單獨用PRK-HAS2轉染細胞作為對照。通過胰酶消化收集293T細胞，用完全培養基(高糖DMEM，10%胎牛血清)以I X IO5至4X IO5細胞/cm2的密度平鋪細胞于組織培養皿上(使細胞貼壁后所占面積達到培養皿總面積的40 - 70%)。將細胞置于含5% CO2的37°C溫箱中孵育8-24hr，當細胞貼壁完全后即可開始轉染。轉染前2hr換液(用4ml新鮮的完全培養基置換舊的培養基)。制備磷酸鈣一 DNA沉淀(500 μ I反應總體積):在滅菌水中加入5 μ g質粒DNA，再加入31 μ 12M CaCl2,使三者總體積達到250 μ I，混勻。將等體積2 X HBS鹽溶液(NaCl 16.3g/L，KC10.74g/L, Na2HPO40.214g/L, Glucose2.4g/L，HEPES10g/L，調 pH 值至7.05)逐滴加入，同時輕彈管壁,使每滴加入后及時混勻。靜置2min后,立即將這500 μ I的磷酸鈣一 DNA懸液逐滴加入上述單層細胞的細胞培養基中，輕輕搖動平皿混勻。轉染的細胞置于含5% CO2的37°C溫箱孵育。8hr后吸去培養基與DNA沉淀，加入5ml37°C預熱的完全培養基，繼續將細胞置于溫箱內孵育。轉染后的293T細胞，培養20小時后用Iml細胞裂解液裂解細胞(若需用MG132處理，則在收集細胞前8hr在培養基中加入MG132至終濃度25 μ Μ)，進行 SDS-PAGE 和 Western blot 檢測。結果如圖4所示，與RINGl共表達時，P2的累積量明顯降低。當用26S蛋白酶體抑制劑MG132對細胞進行處理后，P2的累積量增加，且是否與RINGl共表達差別不大。說明RINGl能夠促進P2的降解，且該過程是通過26S蛋白酶體進行的。實施例2、RINGl在提高水稻對RDV的抗性中的應用—、表達載體的 構建pRTL2-Flag載體構建:在invitrogen公司合成Flag_F(序列為:CATGGACTACAAGGACGACGATGACAAGG)和 Flag-R (序列為:5’ -TCGACCTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTC-3’)兩條序列，按照說明稀釋成100 μ M，各取10 μ I混勻，65°C退火IOmin后降到室溫后形成雙鏈，與用NcoI和SalI酶切過的pRTL2 (參見Zhu et al., 2005.The RiceDwarf Virus P2Protein interacts with ent-Kaurene Oxidases in vivo, leadingto reduced biosynthesis of GibberelI ins and rice dwarf symptoms.PlantPhysiology.139:1935-1945.公眾可從北京大學獲得)質粒的3812bp載體骨架連接，得到pRTL2-Flag 載體。pCambial301-FlagRINGl 載體的構建:以 pGAD-RINGl 為模板，以引物RING1-5’ SalI (序列為:5’ -TATTGTCGACGATGGATCTGGAGAGGTCG-3’)和 RING1-3’ KpnI (序列為:5’ -GGCGGTACCTTACAAGAATGGCGGCATC-3’ )進行 PCR 擴增，得到 1329bp 的 PCR 產物。將上述PCR產物用Sal I和KpnI雙酶切，回收酶切產物，與經過同樣酶切PRTL2-FLAG質粒的3836bp的載體骨架連接，得到重組質粒pRTL2_FLAGRINGl，經過測序，重組質粒PRTL2-FLAGRING1為將序列表中序列2所示的DNA分子插入pRTL2_FLAG質粒的SalI和Kpn I酶切位點間得到的載體。
然后將pRTL2-FLAGRINGl用PstI單酶切，得到2398bp的酶切產物，回收酶切產物，與用同樣酶酶切的pCambial301質粒(參見Zhu et al.，2005.The RiceDwarf Virus P2Protein interacts with ent-Kaurene Oxidases in vivo, leadingto reduced biosynthesis of GibberelI ins and rice dwarf symptoms.PlantPhysiology.139:1935-1945.公眾可從北京大學獲得)，得到11837bp的載體骨架連接，得到重組載體pCambial301-FlagRINGl (PstI單酶切，得到2398bp的酶切產物為陽性)。空載體對照pCambial301_Flag載體構建:將pRTL2_Flag質粒用PstI單酶切，跑瓊脂糖凝膠，切膠回收1123bp的片段，與用同樣酶酶切的pCambial301質粒11837bp的載體骨架連接，得到載體pCambial301_Flag載體,與pCambial301_FlagRINGl唯一的區別在于少了目的基因RINGl。二、過量表達轉RINGl水稻的獲得(I)愈傷組織的誘導培養中花11水稻(以下也稱為野生型水稻)種子去殼，先用70%乙醇浸泡lOmin，再用
0.1%升汞浸泡30min ;進行表面除菌。用大量無菌水洗去種子表面的溶液，用無菌濾紙吸去種子表面的水分。將種子置于成熟胚愈傷誘導培養基平板上，用Parafilm膜封閉平皿邊緣，于26°C溫箱內避光培養。大約15天后，小心取下長出的愈傷組織，轉移到成熟胚繼代培養基上，同樣條件繼續進行培養。每兩周需進行一次繼代培養。用于轉化時，需挑選繼代培養5天左右、呈淡黃色的顆粒狀愈傷組織。(2)農桿菌的培養將pCambial301-FLAGRINGl 電轉入農桿菌 EHA105 (參見 Zhu et al., 2005.The Rice Dwarf Virus P2Protein interacts with ent-Kaur ene Oxidases invivo, leading to reduced biosynthesis of Gibberellins and rice dwarf symptoms.Plant Physiology.139:1935-1945.公眾可從北京大學獲得)中，得到重組菌EHA105/pCambial301-FLAGRINGl。重組菌EHA105/pCambial301-FLAGRINGl能夠在加了抗生素利福平和卡那霉素的LB 平板上生長，而且以引物 RING1-5’ SalI (序列為:5’ -TATTGTCGACGATGGATCTGGAGAGGTCG-3’)和 RING1-3’ KpnI (序列為:5’ -GGCGGTACCTTACAAGAATGGCGGCATC-3’ )進行 PCR 擴增，得到1329bp的PCR產物的為陽性菌。將EHA105/pCambial301-FLAGRINGl 在含有抗生素(50mg/L Kanamycin，50mg/LRifampicin)的LB平板上劃線，28°C培養2天。挑取單菌落接入液體LB培養基中，28°C振蕩培養至0D_約為0.5，加入乙酰丁香酮至終濃度100禮，得到用于轉化水稻愈傷組織的農桿菌懸液。(3)水稻愈傷組織與農桿菌的共培養將繼代愈傷組織放入滅過菌的錐形瓶中，倒入農桿菌懸液使之浸沒愈傷組織。室溫放置20min，并不時輕輕晃動使愈傷組織與菌液充分接觸。用無菌的鑷子輕輕取出愈傷組織，放于無菌濾紙上吸去多余的菌液，轉移到鋪有一層無菌濾紙的共培養培養基平板上。28°C暗培養3天，得到經過共培養的愈傷組織。(4)抗性愈傷組織的篩選與分化將經過共培養的愈傷組織用適量無菌水清洗，除去表面殘余的農桿菌，放在篩選培養基上，26°C避光培養進行篩選，兩周后轉移到新的篩選培養基上繼續篩選兩周。挑選經過兩輪篩選后狀態較好的愈傷組織，將其轉移到分化培養基平板上，先避光培養3天，然后再轉至光照培養箱中(15hr/day)進行光照培養。一個月后可見分化出的小苗。當分化的小苗長至約2cm時，將其轉移到錐形瓶中的生根培養基上，繼續培養兩周左右。選擇長勢較好、根系發達的小苗，用自來水洗去根部的培養基后移栽入土壤中，收取種子，得到T1代轉RINGl水稻種子，播種得到T1代轉RINGl水稻。T1代的水稻種子通過潮霉素初步篩選(pCambial301載體帶有潮霉素抗性篩選基因)，發芽的種子，表明載體轉入水稻。將發芽的種子種入土中，生長2周后，取0.1g葉片，用液氮磨成粉末，加入蛋白提取緩沖液(0.25M Tris-Hcl, pH6.8，8%SDS，8%P_巰基乙醇，20%甘油)200μ 1，冰上孵育10min，100°C煮沸lOmin，4°C，12000rpm離心IOmin后取上清，進行SDS-PAGE，轉膜之后用Western檢測。SDS-PAGE及Western Blot依照公知方法及產品說明書進行。所用抗體為ant1-FLAG-HRP (sigma)。如圖5，在46KDa處出現條帶者為陽性，表明基因轉入且蛋白表達，用于之后的抗病分析實驗。采用同樣的方法,將空載體pCambial301_Flag轉入野生型水稻中，得到轉空載體水稻。用潮霉素水浸泡種子進行陽性轉化篩選。三、轉RINGl水稻對RDV抗性增強1、RT-PCR鑒定RDV P2部分蛋白的表達用攜帶RDV (參見 Zhu et al., 2005.The Rice Dwarf Virus P2Proteininteracts with en t-Kaurene Oxidases in vivo, leading to reduced biosynthesis ofGibberellins and rice dwarf symptoms.Plant Physiology.139:1935-1945.公眾可從北京大學獲得。)的葉蟬(病原菌為水稻矮縮病毒(Rice Dwarf Virus))接種T1代轉RINGl水稻、轉空載體水稻和野生型水稻中花11，每種水稻接種25株，白天30度，晚上22度，濕度60%培養，每株接5頭葉蟬，咬食三天后將葉蟬捉出，咬食過的水稻在陽光溫室種培養(自然光，溫度。實驗重復3次，結果取平均值)。接毒2周后，提取25株T1代轉RINGl水稻、25株轉空載體水稻和25株野生型水稻中花11總RNA，之后，按照下表1，用RQlDnase (Promega，貨號:M610A)對RNA中的基因組DNA進行消化:
權利要求
1.蛋白RINGl或其編碼基因或含有所述編碼基因的重組載體在調控植物抗水稻矮縮病中的應用； 所述蛋白RINGl的氨基酸序列為序列表中的序列I。
2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于:所述水稻矮縮病的病原為水稻矮縮病毒(Rice Dwarf Virus)。
3.根據權利要求1或2所述的應用，其特征在于: 所述植物為單子葉植物或雙子葉植物。
4.一種培育轉基因植物的方法，包括如下步驟:將蛋白RINGl的編碼基因導入目的植物中，得到轉基因植物，所述轉基因植物的水稻矮縮病抗性高于所述目的植物； 所述蛋白RINGl的氨基酸序列為序列表中的序列I。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于:所述蛋白RINGl的編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列2。
6.根據權利要求4或5所述的方法，其特征在于:所述水稻矮縮病的病原為水稻矮縮病毒(Rice Dwarf Virus)。
7.根據權利要求4-6中任一所述的方法，其特征在于:所述蛋白RINGl的編碼基因通過重組載體導入目的植物； 所述重組載體為將所述蛋白RINGl的編碼基因插入表達載體中得到的重組載體。
8.根據權利要求4-7中任一所述的方法，其特征在于:所述植物為單子葉植物或雙子葉植物。
9.一種重組載體，為將蛋白RINGl的編碼基因插入表達載體中得到的重組載體； 所述蛋白RINGl的氨基酸序列為序列表中的序列I ; 所述蛋白RINGl的編碼基因的核昔酸序列具體為序列表中的序列2。
10.蛋白RINGl在作為蛋白-泛素連接酶中的應用； 所述蛋白RINGl的氨基酸序列為序列表中的序列I。
全文摘要
本發明公開了RING1蛋白在提高植物對水稻矮縮病毒抗性中的應用。本發明提供了蛋白RING1或其編碼基因或含有所述編碼基因的重組載體在調控植物抗水稻矮縮病中的應用；所述蛋白RING1的氨基酸序列為序列表中的序列1。本發明的實驗證明，本發明發現RING1是一種E3蛋白-泛素連接酶，它能夠與RDV外殼蛋白P2相互作用，促使P2被26S蛋白酶體降解，且在水稻中過量表達RING1蛋白，可以降低P2的累積量，從而抑制病毒的擴增，提高水稻的抗病毒能力。
文檔編號C12N15/52GK103194431SQ20131013379
公開日2013年7月10日 申請日期2013年4月17日 優先權日2013年4月17日
發明者李毅, 劉利芳 申請人:北京大學