專利名稱：分泌抗南方水稻黑條矮縮病毒單抗雜交瘤細(xì)胞株及其單抗應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種分泌抗南方水稻黑條矮縮病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株及其單抗的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
南方水稻黑條矮縮病于2001年首次在廣東陽西縣發(fā)現(xiàn)，此后發(fā)生范圍逐步擴(kuò)大， 為害日趨嚴(yán)重。2008年擴(kuò)散至長江流域，2009年該病毒病在我國的發(fā)生面積約40萬hm2， 晚稻嚴(yán)重受害，超過0.67萬hm2水稻基本失收。2010年該病害在我國廣西、廣東、江西、湖南、福建、貴州、云南、浙江、安徽、海南等13個(gè)南部省份暴發(fā)成災(zāi)，發(fā)病面積約133萬hm2， 中晚稻區(qū)出現(xiàn)多處點(diǎn)片絕收，給我國的水稻生產(chǎn)造成巨大損失。2011年該病毒病仍在湖南、 貴州、安徽、云南等多個(gè)南方省份發(fā)生流行。近年來越南南方水稻黑條矮縮病在越南暴發(fā)成災(zāi)。南方水稻黑條矮縮病由南方水稻黑條矮縮病毒(Southern rice black streaked dwarf virus, SRBSDV)引起，該病毒為呼腸孤病毒科(Reoviridae)斐濟(jì)病毒屬(Fijivirus)的一個(gè)新種。該病毒可侵染水稻、玉米、薏米、白草和稗草等多種禾本科作物和雜草，引起水稻和玉米南方黑條矮縮病。病毒粒體球狀，直徑70 75 nm。病毒基因組為雙鏈RNA(dsRNA)， 共10個(gè)片段，由大到小分別命名為SI S10，其中SlO編碼病毒的外殼蛋白。由于SRBSDV 引起的水稻南方黑條矮縮病最明顯的癥狀為植株矮縮，不同田塊間發(fā)病率存在顯著差異， 而且雜交稻發(fā)病重于常規(guī)稻。水稻的各個(gè)生育期均可受到SRBSDV侵染，但不同生育期的稻株感病后表現(xiàn)癥狀有所不同秧苗期感病的稻株嚴(yán)重矮縮，不能拔節(jié)，移栽大田后重病株死亡；大田初期感病的稻株明顯矮縮，葉色深綠，上部葉的葉面可見凹凸不平的皺褶，拔節(jié)期地上數(shù)節(jié)節(jié)部有氣生須根及高節(jié)位分枝，病株莖稈表面有乳白色大小約1 2 mm的瘤狀突起，瘤突呈蠟點(diǎn)狀縱向排列成一短條形，早期乳白色，后期褐黑色，不抽穗或僅抽包頸穗；分蘗期和拔節(jié)期感病稻株矮縮不明顯、能抽穗，但穗型小、實(shí)粒少、粒重輕。該病毒由白背飛虱傳毒，不能經(jīng)種傳播，植株間也不互相傳毒。病毒可在白背飛虱體內(nèi)繁殖，白背飛虱一旦獲毒，即終身帶毒，若蟲及成蟲均能傳毒，且白背飛虱高效傳毒，水稻病株上擴(kuò)繁的二代高齡若蟲，可80%帶毒。1990年代以后，雜交水稻種植面積的大幅度增加和吡蟲啉的大范圍高強(qiáng)度施用，使白背飛虱逐漸取代褐飛虱而成為優(yōu)勢種群，近年來我國南方大部稻區(qū)白背飛虱連年暴發(fā)，年均發(fā)生面積2億畝左右。白背飛虱是一種典型的遷飛性害蟲，早春白背飛虱隨西南氣流從中南半島的越南等國家遷入我國，并在我國稻區(qū)降落繁殖，使SRBSDV隨白背飛虱傳入我國稻區(qū)并造成發(fā)生為害。白背飛虱大區(qū)域發(fā)生遠(yuǎn)距離遷飛特性使SRBSDV暴發(fā)并造成流行蔓延的風(fēng)險(xiǎn)大大增加。隨著境外毒源積累，近年該病害發(fā)生處于上升時(shí)期，在耕作制度及氣候無明顯改變的條件下，我國南方水稻黑條矮縮病暴發(fā)態(tài)勢仍將延續(xù)。白背飛虱帶毒情況及發(fā)生數(shù)量成為南方水稻黑條矮縮病發(fā)病流行的重要因素。為了掌握白背飛虱自然種群帶毒及水稻發(fā)病狀況，強(qiáng)化我國南方水稻黑條矮縮病早期監(jiān)測和預(yù)警，科學(xué)指導(dǎo)防控，急需建立檢測白背飛虱體內(nèi)及水稻中SRBSDV的高通量的檢測方法，而目前沒有這種高通量的檢測方法，僅用低效率的電鏡觀察、RT-PCR方法、核酸電泳等方法進(jìn)行小樣本檢測。本發(fā)明以合成的SRBSDV衣殼蛋白(CP)的多肽為抗原通過雜交瘤技術(shù)制備了 1株分泌抗SRBSDV的特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，以制備的單抗為核心可建立檢測SRBSDV的高通量的血清學(xué)方法及其試劑盒，從而為我國南方水稻黑條矮縮病早期監(jiān)測和預(yù)警，科學(xué)指導(dǎo)防控提供物質(zhì)和技術(shù)支持。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種分泌抗南方水稻黑條矮縮病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株及其單抗應(yīng)用。分泌抗南方水稻黑條矮縮病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，保藏號為CGMCC No. 5535，它能分泌抗水稻南方黑條矮縮病毒的單克隆抗體。抗南方水稻黑條矮縮病毒的單克隆抗體腹水間接ELISA效價(jià)達(dá)10_6以上，抗體類型及亞類為IgGl、kappa鏈，該單克隆抗體能與南方水稻黑條矮縮病毒56kD的外殼蛋白亞基有特異性免疫結(jié)合反應(yīng)。抗南方水稻黑條矮縮病毒單克隆抗體在該病毒檢測上的應(yīng)用是以單克隆抗體為核心建立的各種免疫學(xué)檢測方法和免疫學(xué)試劑盒。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有的有益效果1)提供的雜交瘤細(xì)胞株分泌抗南方水稻黑條矮縮病毒特異性單克隆抗體，以該單抗為核心建立的dot-ELISA、ACP-ELISA、 DAS-ELISAdP TAS-ELISA等免疫學(xué)方法及用這些方法建立的試劑盒能高度特異、準(zhǔn)確、靈敏的檢測南方水稻黑條矮縮病毒；2)利用本發(fā)明所制備的單克隆抗體檢測南方水稻黑條矮縮病毒，不需要昂貴的電子顯微鏡、PCR儀等設(shè)備；3)利用本發(fā)明所制備的單克隆抗體，可有效地用于田間作物及白背飛虱中的南方水稻黑條矮縮病毒的檢測。


圖1是dot-ELISA方法檢測水稻SRBSDV的靈敏度分析； 圖2是dot-ELISA方法檢測水稻田間樣品中SRBSDV的結(jié)果；
圖3是dot-ELISA方法檢測白背飛虱體內(nèi)SRBSDV的靈敏度分析； 圖4是dot-ELISA方法檢測田間白背飛虱體內(nèi)SRBSDV的結(jié)果。
具體實(shí)施例方式分泌抗南方水稻黑條矮縮病毒單抗雜交瘤細(xì)胞，于2011年11月觀日，保藏于中國科學(xué)院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為 CGMCCNo. 5535，它能分泌抗水稻南方黑條矮縮病毒的單克隆抗體。抗南方水稻黑條矮縮病毒的單克隆抗體腹水間接ELISA效價(jià)達(dá)10_6以上，抗體類型及亞類為IgGl、kappa鏈，該單克隆抗體能與南方水稻黑條矮縮病毒56kD的外殼蛋白亞基有特異性免疫結(jié)合反應(yīng)。抗南方水稻黑條矮縮病毒單克隆抗體在該病毒檢測上的應(yīng)用是以單克隆抗體為核心建立的各種免疫學(xué)檢測方法和免疫學(xué)試劑盒。本發(fā)明提供的雜交瘤細(xì)胞株能大量分泌抗南方水稻黑條矮縮病毒單抗，且其特異性強(qiáng)、效價(jià)高、穩(wěn)定性好。以該單抗為核心建立了檢測SRBSDV的高通量的血清學(xué)方法及其試劑盒，可成功應(yīng)用于田間SRBSDV的檢測，從而為我國南方水稻黑條矮縮病早期監(jiān)測和預(yù)警，科學(xué)指導(dǎo)防控提供物質(zhì)和技術(shù)支持。下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。一、雜交瘤細(xì)胞獲得及其單克隆抗體的制備 1.免疫原及檢測抗原的制備
根據(jù)GenBank中報(bào)道的南方水稻黑條矮縮病毒(SRBSDV)的衣殼蛋白基因(CP基因) 序列(登陸號ETO23360)由上海波泰生物科技有限公司合成SRBSDV CP蛋白的C端多肽 (CHGQKIVLNKVTR，其中C為額外加入)，并由上海波泰生物科技有限公司合成多肽與牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)偶聯(lián)的免疫原SRBSDV CP-C-BSA和SRBSDV CP-C-OVA檢測抗原。2.免疫動物
用免疫原SRBSDV CP-C-BSA免疫四周齡體重18-20g BALB/C雌性小鼠lmg/ml免疫原SRBSDV CP-C-BSA 0. 5ml與等體積福氏完全佐劑混合，充分乳化后，經(jīng)背腹部皮下多點(diǎn)注射0. 2ml每只，間隔3周，取與一免等量抗原和等體積的福氏不完全佐劑充分乳化后，第二次腹腔注射0. 2ml每只，過3周后用加倍劑量的抗原進(jìn)行腹腔注射，3天后取脾細(xì)胞進(jìn)行融合。3.細(xì)胞融合
取上述免疫小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)按5-10 1的比例，在無血清的 RPMI-1640 (Gibco)培養(yǎng)基中混勻，1500rpm離心5min，去除培養(yǎng)基，用50 % PEG (Sigma，分子量1500)作為融合劑，在37°C下水浴下加入1ml，使其融合2min，用無血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基終止融合后1500rpm離心5min，沉淀用HAT培養(yǎng)基懸浮，分裝到96孔含有飼養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞板中，37°C，5 % C02的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4.雜交瘤細(xì)胞、陽性孔的篩選及其克隆
細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天后，用HAT培養(yǎng)基換液一次，第10天用HT培養(yǎng)基換液，等到融合細(xì)胞覆蓋孔底5%-50%時(shí)，以SRBSDV CP-C-OVA檢測抗原為包被抗原用常規(guī)間接ELISA方法篩選陽性孔，共獲56多個(gè)陽性孔。選擇10個(gè)呈強(qiáng)陽性反應(yīng)的細(xì)胞孔，進(jìn)行有限稀釋法克隆，獲得1株能分泌抗SRBSDV的特異性單抗的雜交瘤細(xì)胞株3F1。經(jīng)6個(gè)月以上體外傳代和多次凍存復(fù)蘇后，細(xì)胞株均能良好生長，并穩(wěn)定分泌抗體。經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后，用于腹水制備和液氮保存。5.單克隆抗體的特異性檢測
用感染蕪菁花葉病毒(TuMV)、番茄花葉病毒(ToMV)、煙草花葉病毒(TMV)、黃瓜花葉病毒(CMV)、馬鈴薯X病毒(PVX)和馬鈴薯Y病毒(PVY)、水稻矮縮病毒(RDV)、水稻條紋病毒 (RSV)、水稻齒葉矮縮病毒(RRSV)的病葉汁包被ELISA反應(yīng)板，以相應(yīng)的健葉提取液作陰性對照，以南方水稻黑條矮縮病毒為陽性對照，用間接ELISA法測定單抗的特異性反應(yīng)。間接ELISA方法具體為上述病毒感染的病葉用液氮研磨成粉末，按1: 30 (w/v, g /mL)加入 ELISA包被液研磨后IOOul/孔包被ELISA板，4°C過夜或37°C 2小時(shí)，使其吸附于聚苯乙烯板孔；PBST洗滌三次后用1-10%的脫脂奶粉或1-3% BSA或3_6%牛血清封閉30-60min; 加入單抗IOOul/孔，370C 1-2小時(shí)；PBST洗滌三次后加入按說明書稀釋10000倍的堿性磷酸脂酶(AP)標(biāo)記兔抗鼠IgG 二抗(Sigma公司)IOOul/孔，37°C 1-2小時(shí)，PBST洗滌四次后，用PNPP底物顯色，2mol/L氫氧化鈉終止反應(yīng)后，用酶標(biāo)儀讀取OD4tl5的值，以與陰性 OD值比值大于2. 1為陽性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3F1單抗對SRBSDV有特異性反應(yīng)，而與TuMV、TMV, ToMV、CMV、PVY、PVX、RDV、RSV、RRSV其他病毒均無特異性反應(yīng)。6.單克隆抗體腹水制備及純化
取8周齡左右BALB/C小鼠，腹腔注射0. 3-0. 5ml降植烷(Sigma)，7_10天后腹腔注入 5-10 X IO5個(gè)雜交瘤細(xì)胞，注射后7-10天可見小鼠腹部明顯膨大，采取腹水，3000rpm離心 3min，收集上清液，即為單克隆抗體腹水。取1倍體積腹水加2倍體積0. 06M PH4.8醋酸緩沖液稀釋，加辛酸(30ul/ml腹水)，室溫下邊加邊攪拌，4°C澄清1小時(shí)，12000rpm離心20min， 收集上清，再用50%飽和硫酸銨沉淀免疫球蛋白，4°C放置2小時(shí)，3000rpm離心20min，沉淀用2倍體積的PBS溶液溶解，在4°C流動透析M小時(shí)后即獲純化的腹水抗體，_70°C保存。7.單克隆抗體的亞類鑒定和腹水效價(jià)測定
將純化的單抗腹水與Sigma公司的標(biāo)準(zhǔn)抗BALB/C小鼠IgG1、IgG2aUgG2bUgG3^IgM抗體作雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)，結(jié)果為3F1單抗亞類為IgGl、kappa鏈。用常規(guī)間接ELISA方法檢測單抗腹水效價(jià)，結(jié)果為上述單抗腹水效價(jià)在10 —6以上。二、病毒免疫學(xué)檢測方法及其試劑盒
1.用單抗建立抗原包被ELISA(ACP-ELISA)方法檢測病毒 ACP-ELISA方法的操作步驟
(1)用0.05M碳酸鹽緩沖液(pH9. 6)按1: 30 (w/v, g /mL)倍稀釋的病葉汁液或按 150 ul碳酸鹽緩沖液每頭白背飛虱加入后搗爛的上清IOOul/孔加入ELISA板，SRBSDV病葉或攜帶SRBSDV白背飛虱為陽性對照，相應(yīng)健葉或非帶毒白背飛虱為陰性對照，37°C 2h， 或4°C過夜；
(2)PBST洗滌后用5%脫脂奶粉封閉30min ；
(3)單抗腹水5000倍稀釋后IOOul/孔，37°CIh ；
(4)PBST洗滌后加入5000倍稀釋的堿性磷酸脂酶(AP)或辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠 IgG 二抗(Sigma)，IOOul/孔，37°C，Ih ；
(5)用PBST洗滌后加入硝基磷酸鹽底物或TMB底物IOOul/孔，室溫30min；
(6)用肉眼觀察，底物顏色變成黃綠色或藍(lán)色的孔為陽性，或用2mol/L氫氧化鈉或硫酸終止反應(yīng)后，用酶聯(lián)免疫檢測儀測0D405或450值，以P/N> 2. 1作為陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)。ACP-ELISA方法檢測靈敏度檢測
單抗腹水工作濃度為5000倍稀釋，對病葉從1 :10至5120作倍比稀釋或單頭白背飛虱進(jìn)行倍比稀釋50uL/頭至12800uL/頭，分別以相應(yīng)稀釋度的健葉汁液作陰性對照，進(jìn)行上述ACP-ELISA方法檢測。結(jié)果表明ACP-ELISA方法對1 :10 640倍稀釋的病葉汁液及單頭白背飛虱稀釋到3200uL/頭均呈陽性反應(yīng)，即對檢測病葉的靈敏度可達(dá)到1 :640，對白背飛虱的檢測靈敏度達(dá)到3200 uL/頭，表明ACP-ELISA方法具有高度的靈敏性和可靠性。2.檢測 SRBSDV 的 TAS-ELISA 檢測方法
2.1. TAS-ELISA方法的操作流程
1)抗SRBSDV的兔抗血清1 3000倍稀釋后(合成的免疫原免疫兔子獲得)IOOul/孔包被聚苯乙烯板，370C，2-4h或4°C，過夜；2)PBST洗滌三次后加1-10%的脫脂奶粉或1-3% BSA或3_6%牛血清封閉200ul/孔于 37°C 封閉 30-60min ；
3)加入檢測樣品IOOul/孔。以SRBSDV病葉或攜帶SRBSDV的白背飛虱為陽性對照，以相應(yīng)的健康樣品或非帶SRBSDV的SRBSDV作陰性對照，37°C l_2h ；
4)洗滌后用封閉液稀釋5000倍的單抗腹水IOOul/孔，37°Cl-2h
5)PBST洗滌后加入10000倍稀釋的AP或HRP標(biāo)記兔抗鼠IgG 二抗(Sigma)IOOul/孔， 370C l-2h
6)PBST洗滌后加PNPP底物或TMB底物于室溫顯色5-30min，肉眼觀察底物顏色變成黃綠色或藍(lán)色的孔為陽性，2mol/L氫氧化鈉或硫酸終止反應(yīng)后，用680型酶聯(lián)免疫檢測儀測 405nm或450nm的OD值，以P/N> 2. 1作為陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)。2. 2. TAS-ELISA檢測方法最適條件的確定
采用TAS-ELISA方陣試驗(yàn)進(jìn)行，即橫向分別加用包被緩沖液從1 : 100至1 : 10M00 倍比稀釋的兔抗SRBSDV血清(合成的免疫原免疫兔子獲得)；加入SRBSDV病葉汁或白背飛虱勻漿液；縱向分別加用封閉液從1 : 5至1 : 2048000倍比稀釋單抗腹水；AP標(biāo)或HRP 記的兔抗鼠IgG 二抗按Sigma公司說明書稀釋，1 10000倍；按TAS-ELISA方法流程進(jìn)行操作。結(jié)果為SRBSDV的兔抗血清及單抗的最適稀釋度分別為1 : 5000、1 8000。2. 3. TAS-ELISA方法檢測靈敏度的確定
在兔抗血清和單抗腹水最適工作濃度下，將SRBSDV病葉汁或白背飛虱勻漿液用PBS倍比稀釋后進(jìn)行TAS-ELISA測定，結(jié)果為TAS-ELISA檢測病葉和白背飛虱的靈敏度分別達(dá)到1:2000倍稀釋(w/v，g /mL)和6400 uL/頭，說明本方法具有很好的靈敏度。3. dot-ELISA方法的建立及田間檢測應(yīng)用
3. 1 dot-ELISA檢測水稻中SRBSDV方法的建立及其田間樣品檢測將水稻葉片稱重后用液氮研磨成粉末，按1 10 30 (w/v, g /mL)加入0. 01 mol/L PBS (pH7. 4)后研磨；病汁液5000 rpm離心3 min;取3 μ 1上清點(diǎn)到NC上，同時(shí)設(shè)置健康和感病水稻葉汁分別作為陰性和陽性對照；室溫干燥10 20 min; NC膜浸入到含5%脫脂奶粉的PBST (含0.05% Tween-20的0. 01 mol/L PBS)封閉液中室溫封閉30 min ； NC膜放入適度稀釋的單抗中室溫孵育30 60 min ；用PBST洗膜3 4次，每次3 min ； NC膜放入適度稀釋的AP酶標(biāo)記羊抗鼠IgG 二抗中室溫孵育3(T60 min; PBST洗膜4 5次，每次 3 min; 66 μ L NBT 禾口 33 μ L BCIP 底物(Promega)加入到 10 ml 底物緩沖液(0. 1 mol/ L Tris CU0. 1 mol/L NaCl、0. 025 mol/L MgCl、ρΗ9· 5)混勻，膜放入底物液中反應(yīng)，肉眼觀察結(jié)果。待陽性對照顯色明顯，而陰性沒有任何顯色時(shí)自來水漂洗終止反應(yīng)，拍照記錄結(jié)^ ο用方陣試驗(yàn)確定檢測水稻病葉的dot-ELISA單抗和酶標(biāo)二抗的最適工作濃度，試驗(yàn)表明3F11單抗及酶標(biāo)二抗的最適工作濃度分別為1:5000和1:8000倍稀釋。以上述抗體的最適工作濃度建立檢測SRBSDV病葉的dot-ELISA方法。靈敏度分析表明，當(dāng)水稻葉片稀釋到1:320倍(w/v，g/mL)時(shí)，以3F1單抗建立的dot-ELISA檢測仍呈現(xiàn)紫色的陽性斑點(diǎn)，即其檢測病葉的靈敏度達(dá)到1:320倍稀釋(圖1)。用建立的dot-ELISA方法對2010、2011年采自福建福州、貴州荔波、浙江金華、 云南施甸縣等水稻田間疑似發(fā)病水稻樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，50個(gè)水稻檢測樣品中有41個(gè)樣品產(chǎn)生紫色的陽性斑點(diǎn)(圖2)，陽性樣品進(jìn)一步用RT-PCR分析，結(jié)果表明所有的 dot-ELISA陽性樣品均檢測到SRBDV特異性的PCR產(chǎn)物，PCR產(chǎn)物核酸測序表明陽性樣品感染SRBSDV。說明該dot- ELISA方法能準(zhǔn)確、可靠地用于水稻樣品中南方水稻黑條矮縮病毒的檢測。3. 2 dot-ELISA檢測白背飛虱體內(nèi)SRBSDV方法的建立及其田間樣品檢測
單頭白背飛虱放入1. 5 mL的印pendorf的離心管中，并加入100 μ L PBS (0. Olmol/ L，pH7. 4)，用牙簽搗爛白背飛虱后、5000 rpm離心3 min，取3 μ L上清點(diǎn)到NC膜上，膜干燥、單抗孵育、二抗孵育、顯色步驟與dot-ELISA檢測水稻中SRBSDV方法相同，不同的只是二抗為適度稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG 二抗，顯色底物是HRP的顯色底物，即如TMB沉淀型顯色底物等。同時(shí)設(shè)非帶毒和帶毒的白背飛虱作為陰性和陽性對照。用方陣試驗(yàn)確定檢測白背飛虱的dot-ELISA單抗和酶標(biāo)二抗的最適工作濃度，試驗(yàn)表明3F1單抗及酶標(biāo)二抗的最適工作濃度分別為1:4000和1:5000倍稀釋。以上述抗體的最適工作濃度建立檢測飛虱體內(nèi)SRBSDV的dot-ELISA方法，檢測結(jié)果表明攜帶SRBSDV 的白背飛虱呈現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)，而無毒的白背飛虱沒有任何顯色反應(yīng)，即建立的dot-ELISA方法能特異性地檢測白背飛虱體內(nèi)的SRBSDV。靈敏度分析表明，當(dāng)單頭白背飛虱加6400 μ L PBS時(shí)，以3F1單抗建立的dot-ELISA檢測仍呈現(xiàn)藍(lán)色的陽性斑點(diǎn)，即其檢測白背飛虱的靈敏度達(dá)到1 :6400稀釋(頭/μ L)(圖3)。用建立的dot-ELISA方法對2010、2011年采自福建福州、貴州荔波、浙江金華、云南施甸縣等水稻發(fā)病田間的白背飛虱、人工飼喂獲毒的和無毒的白背飛虱進(jìn)行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，110頭白背飛虱檢測樣品中有61頭產(chǎn)生藍(lán)色的陽性斑點(diǎn)，而無毒的白背飛虱沒有產(chǎn)生任何藍(lán)色斑點(diǎn)(圖4)。陽性樣品進(jìn)一步用RT-PCR分析，結(jié)果表明所有的dot-ELISA陽性樣品均檢測到SRBDV特異性的PCR產(chǎn)物，PCR產(chǎn)物核酸測序表明陽性樣品感染SRBSDV。說明該dot- ELISA方法能準(zhǔn)確、可靠地用于白背飛虱樣品中南方水稻黑條矮縮病毒的檢測。3. 3南方水稻黑條矮縮病毒dot-ELISA檢測試劑盒(水稻和白背飛虱樣品)
1)試劑盒主要成分
SRBSDV單克隆抗體1管0. 2 ml
AP標(biāo)記羊抗鼠IgG 二抗 1管0. 1 ml
HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG 二抗1管0. 1 ml
NBT/BCIP底物各1瓶分別為2 ml和Iml
TMB底物 1瓶10 ml
陽性對照1 (含SRBSDV水稻葉片汁液)1管2 ml
陽性對照2 (帶毒SRBSDV白背飛虱勻漿液)1管2ml
陰性對照1 (健康水稻葉片汁液)1管2 ml
陰性對照2 (非帶毒白背飛虱勻漿液)1管2 ml
抗體稀釋液(IOX)I瓶80ml
以上試劑均保存于4°C下硝酸纖維素膜(NC) 10張
2)檢測水稻樣品的操作步驟
a.將水稻葉片稱重后用液氮研磨成粉末，按1:10 30 (w/v, g /mL)加入0.01 mol/L PBS (pH7. 4)后研磨；
b.病汁液5000rpm離心3 min;
c.取3μ 1上清點(diǎn)到NC上，同時(shí)設(shè)置健康和感病水稻葉汁分別作為陰性和陽性對照， 室溫干燥10-20 min;
d.NC膜浸入到含5%脫脂奶粉的PBST (含0. 05% Tween-20的0. 01 mol/L PBS)封閉液中室溫封閉30 min ；
e.NC膜放入1 2000倍稀釋的單抗中室溫孵育30-60 min ；
f.用PBST洗膜3 4次，每次3min ； NC膜放入1 3000稀釋的AP酶標(biāo)記羊抗鼠IgG 二抗中室溫孵育30 60 min;
g.PBST洗膜4 5次，每次3 min ； 66 μ L NBT和33 μ L BCIP底物加入到10 ml底物緩沖液(0. 1 mol/L Tris C1、0. 1 mol/L NaCl、0. 025 mol/L MgCl、pH9. 5)混勻，膜放入底物液中反應(yīng)，肉眼觀察結(jié)果；
h.待陽性對照顯色明顯(紫色)，而陰性沒有任何顯色時(shí)自來水漂洗終止反應(yīng)，拍照記錄結(jié)果。)檢測白背飛虱樣品的操作步驟
a.單頭白背飛虱放入1.5mL的印pendorf的離心管中，并加入50-100 μ L PBS (0. 01mol/L, ρΗ7· 4)，用牙簽搗爛白背飛虱后、5000 rpm離心3 min，取3 μ L上清點(diǎn)到NC 膜上，同時(shí)設(shè)置帶毒和非帶毒的白背飛虱分別作為陰性和陽性對照，室溫干燥10-20 min;
b.NC膜浸入到含5%脫脂奶粉的PBST (含0. 05% Tween-20的0. 01 mol/L PBS)封閉液中室溫封閉30 min ；
c.NC膜放入1 3000倍稀釋的單抗中室溫孵育30 60 min ；
d.用PBST洗膜3 4次，每次3min ； NC膜放入1 3000倍稀釋的HRP酶標(biāo)記羊抗鼠 IgG 二抗中室溫孵育30 60 min;
e.PBST洗膜4 5次，每次3 min;膜放入TMB底物液中反應(yīng)，肉眼觀察結(jié)果；
f.待陽性對照顯色明顯(藍(lán)色)，而陰性沒有任何顯色時(shí)自來水漂洗終止反應(yīng)，拍照記錄結(jié)果。)保存及有效期于2 8°C避光保存，有效期12個(gè)月。)緩沖液配方
磷酸鹽緩沖液(PBS，0. 01 mol/L, ρΗ7· 4)
NaCl8 g
KCl0. 2 g
KH2PO40. 2 g
Na2HPO412H203g
疊氮化鈉0. 2 g
加蒸餾水950溶解后調(diào)pH至7. 4，定容至1000 ml
ELISA 洗滌液(0. 01 mol/L PBST)
1000 ml 0. 01mol/L PBS 中力口 0. 5 ml Tween-20
ELISA封閉液
0.01 mol/L PBST中加入脫脂奶粉至終濃度5% (W/V)。
權(quán)利要求
1.一種分泌抗南方水稻黑條矮縮病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，保藏號為CGMCC No. 5535，其特征在于能分泌抗水稻南方黑條矮縮病毒的單克隆抗體。
2.一種如權(quán)利要求1所述的雜交瘤細(xì)胞株分泌的抗南方水稻黑條矮縮病毒的單克隆抗體，其特征在于該單克隆抗體腹水間接ELISA效價(jià)達(dá)10_6以上，抗體類型及亞類為IgGl、 kappa鏈，該單克隆抗體能與南方水稻黑條矮縮病毒56kD的外殼蛋白亞基有特異性免疫結(jié)合反應(yīng)。
3 .—種如權(quán)利要求2所述的抗南方水稻黑條矮縮病毒單克隆抗體在該病毒檢測上的應(yīng)用，其特征是以單克隆抗體為核心建立的各種免疫學(xué)檢測方法和免疫學(xué)試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種分泌抗南方水稻黑條矮縮病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株及其單抗的應(yīng)用。用與牛血清白蛋白偶聯(lián)的南方水稻黑條矮縮病毒(SRBSDV)的衣殼蛋白的C端12個(gè)氨基酸的多肽為抗原免疫BALB/c小鼠，經(jīng)細(xì)胞融合、篩選、克隆，獲得1株能穩(wěn)定傳代并分泌抗SRBSDV單抗的雜交瘤細(xì)胞株3F1，其保藏號為CGMCCNo.5535。3F1單克隆抗體腹水間接ELISA效價(jià)達(dá)10-6以上，抗體類型及亞類為IgG1，kappa鏈。該株單抗與SRBSDV56kD的外殼蛋白亞基有特異反應(yīng)。利用3F1單抗建立的檢測稻飛虱和水稻中SRBSDV的dot-ELISA檢測方法，當(dāng)單頭白背飛虱稀釋到6400μL時(shí)，病葉1:320倍稀釋(w/v,g/mL)時(shí)仍能檢測到病毒。抗SRBSDV單抗的制備及其檢測方法的建立為該水稻病毒病的診斷、預(yù)報(bào)及科學(xué)防控提供技術(shù)和物質(zhì)支撐。
文檔編號G01N33/577GK102559602SQ201210004180
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月9日
發(fā)明者倪躍群, 劉歡, 吳建祥, 周雪平, 饒黎霞 申請人:浙江大學(xué)