專利名稱：一種從水母觸手中分離高純度未釋放刺絲囊的方法
技術領域：
本發明涉及生物技術，具體的說是一種從水母觸手中分離高純度未釋放刺絲囊的方法。
背景技術：
水母是海洋中重要的刺胞動物，含有大量刺細胞，在受到刺激后可放出刺絲并釋放毒素。人若被蜇傷會出現皮膚局部紅腫、刺痛、壞死，嚴重的可出現全身癥狀，甚至死亡。近年來水母暴發頻繁，水母蜇傷的事件越來越多，嚴重影響海濱旅游、海洋捕撈、海軍訓練及海上運動項目等涉海活動。據青島第一海水浴場醫務室的統計，每年的7月底-9月初，每天有上百人因水母蜇傷接受簡單的治療。水母毒素主要存在于刺絲囊中，為預防水母蜇傷必須研究其刺絲囊細胞釋放的影響因素及機制，因此需要以未釋放的刺絲囊細胞作為研究對象，但由于水母在捕撈過程中，觸手刺絲囊細胞會不可避免的部分釋放，所以建立合適方法分離出高純度未釋放的水母刺絲囊細胞是研究其釋放影響因素及機制的基礎，具有重要的現實意義。此外制備高純度未釋放的水母刺絲囊細胞為改進毒素的提取方法，以獲取雜質更少的水母毒素提供了原材料，對深入研究水母毒素有著重要意義。由于釋放、未釋放水母刺 絲囊以及其他雜質的沉降系數和體積大小存在差異，采用合適的離心速度與不同目數的篩子可以實現未釋放水母刺絲囊的分離，操作具有可行性。

發明內容
本發明的目的是提供一種從水母觸手中分離高純度未釋放刺絲囊的方法。為達到此目的，本發明采用的技術方案如下:一種從水母觸手中分離高純度未釋放刺絲囊的方法，將冷凍溶解后水母觸手離心，收集上清液，上清液經離心后，收集沉淀，將沉淀用海水溶解后，過濾收集濾液，離心后收集的沉淀為高純度未釋放的水母刺絲囊。進一步的說，取冰凍水母觸手并加入其重量2-0.5倍的海水，采用電磁攪拌或玻璃棒攪拌，以加速溶解，溶解后再攪拌10-30min ;而后冷凍離心，離心力為100-1000 X g，離心5_20min,收集上清液,上清液經冷凍離心,離心力為1000-4000X g,離心時間5_20min ；收集沉淀，將沉淀再經海水溶解，溶解后20-100目篩網過濾，濾液再經300-600目篩過濾，收集濾液；濾液以8000-16000 X g冷凍離心5-20min，收集沉淀即為高純度未釋放水母刺絲囊樣品。其中溶解沉淀的海水用量與溶解冰凍水母觸手時所用海水量相等。所述海水為2_6°C的海水。所述冷凍離心溫度0_6°C。將所得高純度未釋放刺絲囊沉淀用少量海水溶解后，加入0.4%臺盼藍染色劑少量染色，l-2min后置顯微鏡下血球板觀察計數未釋放刺絲囊拒染比例，檢驗未釋放刺絲囊活性。本發明的優點:1.本發明成功實現了水母未釋放刺絲囊的制備，制取的水母未釋放刺絲囊純度高，活性好。2.本發明所用制備方法快速，設備簡單，可操作性強，重復性好，為水母刺絲囊釋放機制及水母毒素的研究奠定了基礎。3.采用本發明方法分離得到樣品置光學顯微鏡下觀察計數，未釋放刺絲囊比例超過97%。采用臺盼藍染色檢測細胞活性，刺絲囊細胞幾乎全部拒染，證明制備的刺絲囊細胞完整未受損傷。


圖1為本發明實施例提供的所制取的水母未釋放刺絲囊在光學顯微鏡下的照片(X640)。圖2為本發明實施例提供的所制取的水母未釋放刺絲囊臺盼藍染色后在光學顯微鏡下的照片(X 1600)。圖3A、B、C、D分別為本發明不同實施例所制取的水母未釋放刺絲囊的純度檢驗結
果O
具體實施例下面結合說明書附圖對本發明作進一步說明，并且本發明的保護范圍不僅局限于以下實施例。實施例1:I)取冰凍水母觸手50g于燒杯中，加入2-6°C的海水25ml，電磁攪拌至冰凍觸手全部溶解后再攪拌lOmin，紗網濾除殘余觸手。2)將步驟I)中所得的濾液進行4°C冷凍離心5min，離心力為100Xg后，收集上清，混勻后，4°C冷凍離心5min，離心力為1000 X g，收集沉淀，待用。3)步驟2)中所得沉淀用25ml的2_6°C的海水溶解后，20目篩過濾，濾液再經300目篩過濾，收集濾液，4°C冷凍離心5min，離心力為8000 X g，收集沉淀即為高純度未釋放的水母刺絲囊樣品(參見圖1)。即溶解沉淀的海水用量與溶解冰凍水母觸手時所用海水量相等。4)將步驟3)分離所得的高純度未釋放刺絲囊沉淀用2ml海水溶解后，取少量樣品置顯微鏡下血球板觀察計數未釋放刺絲囊比例，檢驗未釋放刺絲囊的純度(參見表I和圖3A)。5)將步驟3)分離所得的高純度未釋放刺絲囊沉淀用2ml海水溶解后，加入0.4%臺盼藍染色劑少量，l_2min后置顯微鏡下觀察刺絲囊染色情況，幾乎全部拒染，制備的刺絲囊細胞完整未受損傷(參見圖2)。表1水母未釋放刺絲囊純度檢測表
權利要求
1.一種從水母觸手中分離高純度未釋放刺絲囊的方法，其特征在于:將冷凍溶解后水母觸手離心，收集上清液,上清液經離心后，收集沉淀,將沉淀用海水溶解后，過濾收集濾液，離心后收集的沉淀為高純度未釋放的水母刺絲囊。
2.按權利要求1所述的從水母觸手中分離高純度未釋放刺絲囊的方法，其特征在于:取冰凍水母觸手并加入其重量2-0.5倍的海水，采用電磁攪拌或玻璃棒攪拌，以加速溶解，溶解后再攪拌10-30min ;而后冷凍離心,離心力為100-1000 X g,離心5_20min,收集上清液，上清液經冷凍離心，離心力為1000-4000 X g，離心時間5-20min ;收集沉淀，將沉淀再經海水溶解，溶解后20-100目篩網過濾，濾液再經300-600目篩過濾，收集濾液；濾液以8000-16000 Xg冷凍離心5-20min，收集沉淀即為高純度未釋放水母刺絲囊樣品。
3.按權利要求1或2所述的從水母觸手中分離高純度未釋放刺絲囊的方法，其特征在于: 所述海水為2-6°C的海水。
4.按權利要求1或2所述的從水母觸手中分離高純度未釋放刺絲囊的方法，其特征在于: 所述冷凍離心溫度0-6 °C。
5.按權利要求1或2所述的從水母觸手中分離高純度未釋放刺絲囊的方法，其特征在于: 將所得高純度未釋放刺絲囊沉淀用少量海水溶解后，加入0.4%臺盼藍染色劑少量染色，l-2min后置顯微鏡下血球板觀察計數未釋放刺絲囊拒染比例，檢驗未釋放刺絲囊活性。
全文摘要
本發明涉及生物技術，具體的說是一種從水母觸手中分離高純度未釋放刺絲囊的方法。將冷凍溶解后水母觸手離心，收集上清液，上清液經離心后，收集沉淀，將沉淀用海水溶解后，過濾收集濾液，離心后收集的沉淀為高純度未釋放的水母刺絲囊。將上述所得水母刺絲囊置光學顯微鏡下觀察計數，未釋放刺絲囊比例超過97%。采用臺盼藍染色檢測細胞活性，刺絲囊細胞幾乎全部拒染，證明制備的刺絲囊細胞完整未受損傷。本發明方法快速、簡單，操作性強，為水母觸手刺絲囊釋放的影響因素及機制的研究提供了重要的方法指導。
文檔編號C12N5/07GK103232968SQ20131014031
公開日2013年8月7日 申請日期2013年4月22日 優先權日2013年4月22日
發明者李鵬程, 薛偉, 于華華, 李榮鋒, 邢榮娥, 劉松, 秦玉坤, 陳曉琳, 胡林峰 申請人:中國科學院海洋研究所