專利名稱：蘇云金芽胞桿菌高效表達載體、構(gòu)建方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及蘇云金芽胞桿菌高效表達載體的構(gòu)建方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis,簡稱Bt)是一種廣泛存在于土壤中的細菌，其可以在生長穩(wěn)定期形成芽胞，且芽胞內(nèi)含有晶體，晶體主要組成成份是殺蟲晶體蛋白(亦稱為S-內(nèi)毒素)由cry和cyt基因編碼，具有特異的殺蟲活性[Sanahuja, G., R.Banakar, R.M.Twyman, et al., 2011.Bacillus thuringiensis: acentury of research, development and commercial applications.Plant BiotechnolJ.9(3):p.283-300]。多種Bt產(chǎn)品被應(yīng)用于農(nóng)業(yè)害蟲和衛(wèi)生害蟲蚊子的防治[Bravo，A.，S.Likitvivatanavongj S.S.Gill,et al., 2011.Bacillus thuringiensis:A story of asuccessful bioinsecticide.1nsect Biochem Mol Biol.41 (7):p.423-31]。根據(jù) cry基因表達調(diào)控的特點可以將其分為兩類，芽胞依賴型cry基因如crylA、cry2A、cry4A、cry4B和cry IIA 等，和不依賴芽胞形成的 cry 基因，如 cry3A[ Ibrahim，M.A.，N.Grikoj M.Junker, etal.，2010.Bacillus thuringiensis:a genomics and proteomics perspective.BioengBugs.1 (I):p.31-50.Bravo,A.，H.Agaissej S.Salamitoujet al.，1996.Analysis ofcryIAa expression in sigE and sigK mutants of Bacillus thuringiensis.Mol GenGenet.250 (6):p.734-41.Agaissej H.and D.Lereclus，1994.Expression in Bacillussubtilis of the Bacillus thuringiensis cryIIIA toxin gene is not dependenton a sporulation-specific sigma factor and is increased in a spoOA mutant.JBacteriol.176(15):p.47 34-41.]。而不同機制的啟動子需要不同的轉(zhuǎn)錄因子，如cryIAc啟動子為重疊的雙啟動子Bt I和Bt II，二者分別由σΕ和σκ調(diào)控[Sedlak，Μ.，Τ.Walter, and A.Aronson, 2000.Regulation by overlapping promoters of the rate ofsynthesis and deposition into crystalline inclusions of Bacillus thuringiensisdelta-endotoxins.J Bacteriol.182 (3):p.734-41] ；cry4A 為非重疊雙啟動子 pi 和 p2，在過渡期受到 σ H 的調(diào)控有較弱表達[Yoshisuej H., T.Fukadaj K.Yoshidaj et al.，1993.Transcriptional regulation of Bacillus thuringiensis subsp.1sraelensismosquito larvicidal crystal protein gene cryIVA.J Bacteriol.175(9):p.2750-3]；CIT8E基因與其上游orfl基因以操縱子形式進行轉(zhuǎn)錄，操縱子中的兩個啟動子受到σΗ和σ Ε調(diào)控(未發(fā)表資料)；Cry3A從營養(yǎng)期即開始表達，受到σ A的調(diào)控[Agaisse，H.andD.Lereclusj 1994.Expression in Bacillus subtilis of the Bacillus thuringiensiscryIIIA toxin gene is not dependent on a sporulation-specific sigma factor andis increased in a spoOA mutant.J Bacteriol.176 (15):p.4734-41],而 sigK 基因功能的喪失有利于cry3A啟動子在產(chǎn)胞后期的轉(zhuǎn)錄。cry基因啟動子轉(zhuǎn)錄機制的不同決定了其相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄特點，研究人員根據(jù)這些特點構(gòu)建出表達載體用于實驗和生產(chǎn)。目前已報道的Bt表達載體主要有ρΒΜΒΙΑ、PEMB0557、pSXY_422b 和 pSTK_3A。ρΒΜΒΙΑ 是以低拷貝載體 pHT304 為基礎(chǔ)，cry IAc 啟動子指導(dǎo)的穿梭表達載體，可用于快速克隆表達不同類別的Cry蛋白[鄭文，葉偉星，彭東海，等.2012.基于crylAc表達調(diào)控元件的蘇云金芽孢桿菌表達載體構(gòu)建.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，，51(2):400-405] ;pEMB0557可以容納至少70kb的DNA片段，可用于克隆或表達較大的基因或基因族[Liu, X.，D.Peng, Y.Luo, et al., 2009.Construction of an Escherichiacoli to Bacillus thuringiensis shuttle vector for large DNA fragments.ApplMicrobiol Biotechnol.82(4):p.765-72] ;pSXY_422b 和 pSTK_3A 均是以高拷貝載體PHT315為基礎(chǔ)，cry3A啟動子指導(dǎo)的穿梭表達載體,只有抗性不同，Wang等將攜帶cry3Aa7基因的PSTK-3A轉(zhuǎn)化到對鱗翅目害蟲高毒力的野生菌株G03中，得到對鞘翅目和鱗翅目害蟲都有很高毒力的工程菌 G033A[Wang, G., J.Zhang, F.Song, et al., 2006.EngineeredBacillus thuringiensis G033A with broad insecticidal activity againstlepidopteran and coleopteran pests.Appl Microbiol Biotechnol.72(5):p.924-30]。Yan等將攜帶cry3Aa7基因的pSTK_3A轉(zhuǎn)化到對蠐螬高毒力的野生菌株HBF-1中，得到工程菌株3A-HBF，其不僅對蠐螬表現(xiàn)出較高毒力，而且還獲得對葉甲科害蟲的殺蟲活性[Yan, G., F.Song, C.Shu, et al., 2009.An engineered Bacillus thuringiensisstrain with insecticidal activity against Scarabaeidae(Anomala corpulenta)andChrysomelidae(Leptinotarsa decemlineata and Colaphellus bowringi).BiotechnolLett.31 (5):p.697-703]。蘇云金芽胞桿菌殺蟲晶體的形成是蛋白積累的結(jié)果，而利用一個強啟動子表達相應(yīng)基因，可提高蛋 白的產(chǎn)量，從而提高單位重量發(fā)酵液的活性。因此篩選一個強啟動子并構(gòu)建一個高效表達載體，為今后研制更為高效廣譜的蘇云金芽胞桿菌工程菌奠定基礎(chǔ)，對提高Bt制劑的活性有非常廣闊的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是構(gòu)建一種分析載體，用于比較四種不同轉(zhuǎn)錄機制的cry基因啟動子(PcrylA,Pcry3A,Pcry4A和Pcry8E)的活性,篩選出一個強啟動子，指導(dǎo)cry基因的表達。目的之二是應(yīng)用篩選出的強啟動子，構(gòu)建一個高效表達載體并對其效率進行評估，以用于研制更為高效廣譜的蘇云金芽胞桿菌工程菌。一種分析載體，其結(jié)構(gòu)特征為:將報告基因IacZ插入經(jīng)酶切后的骨架載體pHT315的多克隆位點之間。所述分析載體為pHTlac，其序列如SEQ ID NO所示。上述分析載體在構(gòu)建分析轉(zhuǎn)錄活性菌株中的用途。一種表達載體，其結(jié)構(gòu)特征為:將cry8E基因啟動子與大腸桿菌表達載體pET_21b的非啟動子表達區(qū)的重疊片段插入經(jīng)酶切后的骨架載體PHT315的多克隆位點之間。
所述表達載體為pHT315-8E21b，其序列如SEQ IDNO所示。表達載體pHT315_8E21b的構(gòu)建方法，包括如下步驟:(I)獲得cry8E基因啟動子和pET_21b的非啟動子表達區(qū)的重疊片段8E_21b，(2)插入經(jīng)酶切后的骨架載體PHT315的多克隆位點之間。所述步驟(I)的方法為:以Btl85菌株基因組DNA為模板，用引物對8E-up/8E-down (SEQ ID N011/12)擴增cry8E基因的啟動子序列，大小為1352bp;以大腸桿菌表達載體pET-21b質(zhì)粒為模板，用引物對21b-up/21b-down (SEQ ID N013/14)擴增得到無啟動子的pET-2Ib表達區(qū)片段，大小為213bp，其中包括多克隆位點；回收兩個PCR產(chǎn)物，以此為模板，用引物8E-up和2lb-down進行重疊PCR，獲得cry8E基因啟動子和pET_21b表達區(qū)的重疊片段8E-21b，大小為1565bp，所述骨架載體的pHT315經(jīng)EcoRI/Hindlll雙酶切。一種重組表達載體，在上述表達載體的多克隆位點之間插入目的基因。所述重組表達載體為pHT-8E_lAc，其序列如SEQ ID NO所示。一種工程菌HD-8E1AC菌株，其特征是含有重組表達載體pHT-8E_lAc。上述表達載體在表達Cry蛋白中的應(yīng)用。所述蛋白為CrylAc。本發(fā)明的技術(shù)方案如下:構(gòu)建四種不同轉(zhuǎn)錄機制的cry基因啟動子(PcrylA,Pcry3A,Pcry4A和Pcry8E)與報告基因IacZ融合表達載體，并導(dǎo)入Bt無晶體突變株HD-73-中，通過β -半乳糖苷酶活性測定，比較四種啟動子的活性，篩選出具有高轉(zhuǎn)錄活性的啟動子。將強啟動子與表達載體pET_21b的非啟動子表達區(qū)重疊，連接到基礎(chǔ)穿梭載體PHT315中，獲得高效表達載體pHT315-8E21b，并對該載體進行蛋白定量，殺蟲活性等效率評估。以下詳述本發(fā)明的方案過程:I大腸桿菌JMllO熱擊感受態(tài)的制備為了獲得含有外源基因的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子，制備大腸桿菌的熱擊轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞[Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T.1989.Molecular cloning:A LaboratoryManual (Cold Spring Harbour Lab., Cold Spring Harbour, NY)]。米用熱擊轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌受體態(tài)細胞，以 獲得更多的含有外源基因的轉(zhuǎn)化子。2高拷貝轉(zhuǎn)錄活性分析載體pHTlac的構(gòu)建以高拷貝載體PHT315為基礎(chǔ)載體，將質(zhì)粒pHT304_18Z中IacZ基因片段經(jīng)PCR擴增、限制性內(nèi)切酶消化，連接到PHT315的多克隆位點，獲得高拷貝轉(zhuǎn)錄活性分析載體pHTlac (圖1)。經(jīng)PCR、酶切及測序鑒定，驗證質(zhì)粒的正確性(圖2)。3Bt電擊感受態(tài)的制備為了提高Bt的轉(zhuǎn)化效率，制備Bt的電擊轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞[Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, Τ.1989.Molecular cloning:A LaboratoryManual (Cold Spring Harbour Lab., Cold Spring Harbour, NY)]，米用電擊轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)化Bt受體菌細胞，以獲得更多的含有外源基因的轉(zhuǎn)化子。4PcrylA, Pcry3A, Pcry4A 和 Pcry8E 與 IacZ 基因融合表達載體構(gòu)建
分別以含有CrylA、Cry3A、Cry4A和cry8E基因的Bt菌株總DNA為模板，用相應(yīng)的特異性引物進行PCR擴增,得到PcrylA, Pcry3A, Pcry4A和Pcry8E四個啟動子片段,用限制性內(nèi)切酶消化后與PHTlac載體連接，得到的重組質(zhì)粒經(jīng)PCR、酶切及測序鑒定，驗證質(zhì)粒的正確性(圖4)。將正確的重組質(zhì)粒導(dǎo)入Bt無晶體突變株HD-73—，獲得菌株HDLPcrylAc、HDLPcry3A、HDLPcry4A、HDLPcry8E 和 HDpHTlac。5四種啟動子轉(zhuǎn)錄活性比較將分別含有四種啟動子的HDLPcry IAc、HDLPcry3A、HDLPcry4A 和 HDLPcry8E菌株接種于 SSM 培養(yǎng)基[Schaeffer, P., J.Millet, and J.P.Aubert, 1965.Catabolicrepression of bacterial sporulation.Proc Natl Acad Sci U S A.54(3):p.704-11],按固定的時間間隔取樣，測定樣品的β_半乳糖苷酶活性，比較四種啟動子的活性，篩選出具有高轉(zhuǎn)錄活性的啟動子(圖5)。6強啟動子指導(dǎo)的高效表達載體的構(gòu)建將強啟動子與大腸桿菌表達載體pET_21b的非啟動子表達區(qū)重疊，連接到基礎(chǔ)穿梭載體PHT315中，獲得高效表達載體pHT315-8E21b (圖6)，經(jīng)酶切及測序驗證重組質(zhì)粒的正確性(圖7)。7高效表達載體的效率評估PCR擴增crylAc基因，經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化后，導(dǎo)入高效表達載體pHT315_8E21b中，得到重組質(zhì)粒pHT-8E-lAc，經(jīng)酶切及測序鑒定正確(圖8)，導(dǎo)入HD_73_無晶體突變株，獲得HD-8E1AC菌株；同樣方法，將crylAc基因?qū)霃V泛應(yīng)用的含有cry3A基因啟動子的表達載體pSXY-422b中，得到重組質(zhì)粒pSXY-422b-lAc，鑒定正確后，導(dǎo)入HD_73_無晶體突變株，獲得HD-422-lAc菌株。晶體形態(tài)觀察: 將HD-8E1AC菌株接種于SSM培養(yǎng)基，至細胞大部分裂解，用掃描電子顯微鏡觀察晶體形態(tài)(圖9)。檢測高效表達載體pHT315-8E21b可正確表達外源Cry蛋白。蛋白產(chǎn)量測定:以無晶體突變株HD73_為對照，利用SSM培養(yǎng)基培養(yǎng)HD-422-lAc和HD-8E1AC菌株至細胞完全裂解，采用Pierces 660nm protein Assay Kit分別對三者上樣混合液中的總蛋白進行定量。調(diào)整上樣量使總蛋白含量一致進行點樣，利用SDS-PAGE檢測各菌株殺蟲晶體蛋白的產(chǎn)量(圖10)。SDS-PAGE方法參見分子克隆實驗指南[J.薩姆布魯克.分子克隆實驗指南(第二版)(金冬雁等).北京:科學(xué)出版社，1992]。殺蟲活性測定:將HD-422-lAc和HD_8ElAc菌株制成粉劑，對粉劑中蛋白進行定量，然后稀釋成不同的濃度，分別混入飼料拌勻，測定對小菜蛾(Plutella xylostella)的活性。結(jié)果表明，HD-8E-1AC菌株產(chǎn)生的CrylAc蛋白對小菜蛾有活性，LC50為0.05561，約為HD-422-lAc LC50的五分之一，證明菌株HD_8ElAc的生物活性比菌株HD-422-lAc的活性高，所以從生物活性的角度說明pHT315-8E21b載體對Cry蛋白的表達效率高于pSXY_422b。


圖1:pHTlac載體構(gòu)建示意圖，圖2:pHTlac載體PCR和酶切鑒定，I: λ /Ecol30I Marker, 2:Pst I 單酶切產(chǎn)物，3:Hind ΙΙΙ+Pst I 雙酶切產(chǎn)物，4:PCR產(chǎn)物，圖3:PcrylA, Pcry3A, Pcry4A和Pcry8E與IacZ基因融合表達載體構(gòu)建示意圖，圖 4:重組質(zhì)粒 pHTlacPcrylAc、pHTlacPcry3A> pHTlacPcry4A 和 pHTlacLPcry8E酶切和PCR鑒定，I: λ /Ecol30I Marker, 2:pHTlacPcrylAc/Xba I 單酶切產(chǎn)物，3:pHTlacPcrylAc/Kpn I+Xba I雙酶切產(chǎn)物，4 =PcrylAc PCR 產(chǎn)物，5:pHTlacPcry3A/Xba I 單酶切產(chǎn)物，6:pHTlacPcry3A/KpnI+Xba I雙酶切產(chǎn)物，7:Pcry3A PCR 產(chǎn) 物，8:pHTlacPcry4A/Xba I 單酶切產(chǎn)物，9:pHTlacPcry4A/KpnI+Xba I雙酶切產(chǎn)物，10:Pcry4APCR 產(chǎn)物，11:pHTlacLPcry8E/Xba I 單酶切產(chǎn)物，12:pHTlacLPcry8E/Kpn I+Xba I 雙酶切產(chǎn)物，13:LPcry8E PCR 產(chǎn)物，14:DL2000Marker，圖5:不同cry基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性比較，圖6:pHT315-8E21b載體構(gòu)建圖譜，圖7:pHT315-8E21b 單酶切鑒定，I:ffide range Marker, 2:BamH I 單酶切產(chǎn)物，3:Sal I 單酶切產(chǎn)物，4:EcoR I 單酶切產(chǎn)物，5:Sac I單酶切產(chǎn)物，6:Hind III單酶切產(chǎn)物，7:Xho I單酶切產(chǎn)物，圖8:重組質(zhì)粒pHT-8E_lAc雙酶切鑒定，I:lkb DNA Ladder, 2:BamH I+Sal I 雙酶切產(chǎn)物，圖9:菌株HD73—和HD_8ElAc的掃描電鏡觀察結(jié)果，圖 10:HD-422-lAc、HD-8E_lAc 菌株 CrylAc 蛋白的 SDS-PAGE 分析，I:HD-73_ 菌株，2:HD-422_lAc 菌株，3:HD_8ElAc 菌株。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的詳細說明。下面所用載體和菌株均為市售產(chǎn)品。本申請人的實驗室均有保藏，可以對外公開發(fā)放。實施例1大腸桿菌JMllO熱擊感受態(tài)的制備及轉(zhuǎn)化挑取單菌落于5ml LB液體培養(yǎng)基，37°C震蕩培養(yǎng)過夜；按1%接種量接種于IOOmlLB 液體培養(yǎng)基中，37°C，220rpm 培養(yǎng) 2-2.5hr, (OD600=0.5-0.6) ;4°C，4000rpm 離心 IOmin ；棄上清，向沉淀中加入50ml預(yù)冷的0.1M CaCl2懸浮細胞，置于冰上30min ；4°C,4000rpm離心lOmin，回收細胞；用2-41111冰預(yù)冷的0.1M CaCl2重懸細胞，分裝成200 μ L/0.5mL離心管中，于4°C保存，一周內(nèi)用完。將200 μ L感受態(tài)細胞與質(zhì)粒混勻，冰浴30min，42° C熱擊1.5minJM#3min，；toA800yL LB 培養(yǎng)基，37° C 培養(yǎng) 60min，取 200 μ L 涂板，37° C 培養(yǎng)。實施例2高拷貝轉(zhuǎn)錄活性分析載體pHTlac的構(gòu)建以質(zhì)粒pHT304-18Z為模板，用引物對LacZ5’/LacZ3’ (SEQ ID N01/2)擴增獲得laCZ基因片段(3115bp)，經(jīng)過限制性內(nèi)切酶Hindm和Pst I雙酶切后，插入高拷貝載體PHT315中相應(yīng)位點，獲得重組質(zhì)粒pHTlac (圖1)，對重組質(zhì)粒進行PCR和酶切鑒定，結(jié)果表明(圖2)，PCR擴增得到3115bp的特異性條帶，用Pst I對載體進行酶切，獲得大約9.5kb大小的條帶，用Hind IIKPst I對載體進行雙酶切鑒定，獲得6.5kb和3.0kb的條帶，證明重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。序列見(SEQ ID N017)。實施例3 Bt電擊感受態(tài)的制備挑取單菌落于5ml LB液體培養(yǎng)基，30°C震蕩培養(yǎng)過夜。按1%接種量接種于IOOmlBH 液體培養(yǎng)基中，37°C，220rpm 培養(yǎng) 3-4hr (OD600=3.0)。4°C，4000rpm 離心 lOmin。棄上清，加入預(yù)冷的超純水懸浮細胞,4 V，4000rpm離心lOmin，重復(fù)兩次，棄上清，向沉淀中加入lml40%PEG重懸細胞，分裝，_70°C保存?zhèn)溆谩嵤├? PcrylA, Pcry3A, Pcry4A和Pcry8E與IacZ基因融合表達載體構(gòu)建分別以HD-73菌株總DNA為模板用引物對LP1Ac5’/LP1Ac3’ (SEQ ID N03/4)擴增crylAc基因ATG上游382bp的啟動子序列；以Bt22菌株總DNA為模板，LP3A5’ /LP3A3’(SEQ ID N05/6)為引物擴增cry3A基因ATG上游570bp的啟動子序列；以Bti菌株總DNA為模板，LP4A5’/LP4A3’ (SEQ ID N07/8)為引物擴增cry4A基因ATG上游826bp的啟動子序列；以Btl85菌株總DNA為模板，LPorfl5’/LP8E3’ (SEQ ID N09/10)為引物擴增cry8E基因ATG上游1352bp的啟動子序列。以上啟動子片段分別經(jīng)限制性內(nèi)切酶Kpn I和Xba I雙酶切后，插入質(zhì)粒pHTlac的相應(yīng)位點，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JMllO菌株，獲得重組質(zhì)粒 pHTlacPcrylAc、pHTlacPcry3A、pHTlacPcry4A 和 pHTlacLPcry8E,圖 3 為重組質(zhì)粒構(gòu)建示意圖。四個重組質(zhì)粒經(jīng)PCR擴增、雙酶切及測序鑒定，證明構(gòu)建正確(圖4)。將鑒定正確的質(zhì)粒和對照載體PHTlac導(dǎo)入無晶體突變株HD-73—，分別獲得含有不同啟動子的菌株HDLPcry IAc、HDLPcry3A、HDLPcry4A、HDLPcry8E 和 HDpHTlac。實施例5四種啟動子轉(zhuǎn)錄活性比較將過夜活化的菌株HDLPcryIAc、HDLPcry3A、HDLPcry4A 和 HDLPcry8E 接入含有紅霉素的SSM培養(yǎng)基中 ，30°C，220rpm振蕩培養(yǎng)，從Ttl (菌體對數(shù)生長期將要結(jié)束即將進入穩(wěn)定期的時間點)取樣至T12 (Ttl后12小時)，每小時取樣一次，每次取樣2ml，12000Xg離心棄上清，沉淀迅速置于-20°C保存。半乳糖苷酶活性測定:向沉淀中加入500 μ LBuffer Z (0.06M Na2HPO4.2Η20，0.04Μ NaH2PO4.H2O,0.0lM KC1，0.0OlM MgSO4.7H20)和
0.2g鋼珠，破碎細胞Imin ;4°C，12000Xg離心5min，取20 μ I上清用于測定蛋白濃度，讀取 0D595 值；取 100 μ I 上清與 700 μ I Buffer Z 混合，加入 200μ1 ONPG (4mg/ml)，混勻，37°C反應(yīng)，計時直到反應(yīng)液呈現(xiàn)黃色，加入500μ1，1Μ Na2CO3，讀取0D420值。根據(jù)公式計算 Miller Units [Miller JH.1972.Experiments in Molecular Genetics.NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 352-355]。每組數(shù)據(jù)進行三次獨立重復(fù)試驗，取平均值。結(jié)果表明(圖5)，在SSM培養(yǎng)基中，PcrylA和Pcry4A啟動子從1~2開始有活性，PcrylA從T2到T9活性持續(xù)升高，Pcry4A在T8時活性達到最高；Pcry8E和Pcry3A從Ttl開始有活性，T0到T1之間，Pcry3A活性略高于Pcry8E, T1后Pcry8E活性開始高于Pcry3A,進入芽胞期后，Pcry8E、PcrylA與Pcry4A活性均有較大幅度的提高，而Pcry3A變化較為平緩。空載體PHTlac的轉(zhuǎn)錄活性很低。以上結(jié)果說明啟動子轉(zhuǎn)錄活性由高到低依次為Pcry8E>PcrylA>Pcry4A>Pcry3A,證明 Pcry8E 為一個強啟動子。實施例6強啟動子指導(dǎo)的高效表達載體的構(gòu)建通過啟動子轉(zhuǎn)錄活性分析，發(fā)現(xiàn)芽胞期時crySE基因的啟動子活性最強，因此選取該啟動子構(gòu)建穿梭表達載體。以Btl85菌株基因組DNA為模板，用引物對8E-up/8E-down(SEQ ID N011/12)擴增cry8E基因的啟動子序列，大小為1352bp ;以大腸桿菌表達載體pET-21b質(zhì)粒為模板，用引物對21b-up/21b-down (SEQ ID N013/14)擴增得到無啟動子的pET-21b表達區(qū)片段，大小為213bp，其中包括多克隆位點；回收上述PCR產(chǎn)物，以此為模板，用引物8E-up和21b-down進行重疊PCR，獲得cry8E基因啟動子和pET_21b表達區(qū)的重疊片段8E-21b，大小為1565bp。8E_21b經(jīng)SmaI酶切，插入穿梭載體pHT315經(jīng)EcoRI/Hindlll雙酶切并補平后的位點，得到重組質(zhì)粒pHT315-8E21b。該質(zhì)粒含有cry8E基因啟動子、多克隆位點及T7終止子，物理圖譜如圖6。重組質(zhì)粒經(jīng)多種限制性內(nèi)切酶單酶切及測序鑒定，證明構(gòu)建正確圖7，序列見(SEQ ID N018)。實施例7高效表達載體的效率評估以HD-73 菌株基因組 DNA 為模板，引物 lAc-up 和 lAc-down (SEQ ID N015/16)配對擴增大小為3537bp的crylAc基因，經(jīng)BamHI和SalI雙酶切后，導(dǎo)入pHT315_8E21b的BamHI和SalI位點之間，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JMllO菌株，得到重組質(zhì)粒pHT_8E-lAc，經(jīng)雙酶切及測序鑒定(圖8)，證明構(gòu)建正確，序列見(SEQ ID N019)。將重組質(zhì)粒導(dǎo)入HD-73—無晶體突變株，獲得菌株HD-8E1AC。同樣方法，將crylAc基因?qū)霃V泛應(yīng)用的含有cry3A基因啟動子的表達載體pSXY-422b中，得到重組質(zhì)粒pSXY-422b-lAc，去甲基化后，導(dǎo)入HD-73-無晶體突變株，獲得菌株HD-422-lAc。晶體形態(tài)觀察:將HD-8E1AC菌株和對照菌株HD_73_無晶體突變株接種于SSM培養(yǎng)基，至細胞大部分裂解，離心，棄上清，將沉淀重懸于無菌水中；同時將蓋玻片粘在載物臺上，然后將胞晶混合物涂在蓋玻片上，用無水乙醇逐級脫水、干燥，鋨酸固定，噴金；掃描電子顯微鏡下觀察晶體的形態(tài)。結(jié)果證明(圖9)，HD-SElAc菌株可以形成菱形晶體，而HD-73—菌株中未觀察到菱形晶體的存在，說明pHT315-8E21b載體可以正確表達crylAc基因。蛋白產(chǎn)量測定:以無晶體突變株HD73_為對照，利用SSM培養(yǎng)基培養(yǎng)HD-422-lAc和HD-8E1AC菌株至細胞完全裂解，HD-422-lAc菌株需24h完全裂解，而HD_8ElAc需要30h。采用Pierceli 660nm protein Assay Kit分別對三者上樣混合液中的總蛋白進行定量。調(diào)整上樣量使總蛋白含量一致進行點樣，利用SDS-PAGE檢測各菌株殺蟲晶體蛋白的產(chǎn)量(圖10)。SDS-PAGE方法參見分子克隆實驗指南[J.薩姆布魯克.分子克隆實驗指南(第二版)(金冬雁等).北京:科學(xué)出版社，1992]。由圖10可知菌株HD-422-lAc和HD_8ElAc均可產(chǎn)生約130KDa的CrylAc蛋白，而總蛋白含量一致的情況下,通過Quantity One軟件定量得知，HD-8E1AC菌株所表達的CrylAc蛋白約為HD-422-lAc的4倍，說明pHT315_8E21b載體對Cry蛋白的表達效率明顯高于pSXY-422b。殺蟲活性測定:利用SSM培養(yǎng)基培養(yǎng)HD-422-lAc和HD_8ElAc菌株至細胞完全裂解，將菌株制成粉劑，對粉劑中蛋白進行定量，然后稀釋成不同的濃度，分別混入飼料拌勻，測定對小菜蛾(Plutella xylostella)的活性。結(jié)果表明(表1)，HD-8E_lAc菌株產(chǎn)生的CrylAc蛋白對小菜蛾有活性，LC50為0.05561，約為HD-422-lAc LC50的五分之一，證明菌株HD-8E1AC的生物活性比菌株HD-422-lAc的活性高，所以從生物活性的角度說明pHT315-8E21b載體對Cry蛋白的表達效率高于pSXY_422b。表1菌株HD-422-lAc和HD_8ElAc對小菜蛾的毒力測定
權(quán)利要求
1.一種表達載體，其結(jié)構(gòu)特征為:將cry8E基因啟動子與大腸桿菌表達載體pET-21b的非啟動子表達區(qū)的重疊片段插入經(jīng)酶切后的骨架載體PHT315的多克隆位點之間。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述表達載體為pHT315-8E21b，其序列如SEQID N018所示。
3.權(quán)利要求1或2所述表達載體的構(gòu)建方法，包括如下步驟: (1)獲得cry8E基因啟動子和pET_21b的非啟動子表達區(qū)的重疊片段8E_21b， (2)插入經(jīng)酶切后的骨架載體PHT315的多克隆位點之間。
4.權(quán)利要求3所述的構(gòu)建方法，所述步驟(I)的方法為:以Btl85菌株基因組DNA為模板，用引物對8E-up/8E-down (SEQ ID N011/12)擴增cry8E基因的啟動子序列，大小為1352bp ;以大腸桿菌表達載體pET-21b質(zhì)粒為模板，用引物對21b-up/21b-down (SEQ IDN013/14)擴增得到無啟動子的pET-21b表達區(qū)片段，大小為213bp，其中包括多克隆位點；回收兩個PCR產(chǎn)物，以此為模板，用引物8E-up和21b-down進行重疊PCR，獲得cry8E基因啟動子和pET-21b表達區(qū)的重疊片段8E-21b，大小為1565bp，所述骨架載體的pHT315經(jīng)EcoRI/Hindlll 雙酶切， 所述8E-up序列如SEQ ID NOll所示，所述8E_down序列如SEQ ID N012所示， 所述21b_up序列如SEQ ID N013所示,所述21b_down序列如SEQ ID N014所示。
5.—種重組表達載體,在權(quán)利要求1或2所述表達載體的多克隆位點之間插入目的基因。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述重組表達載體為pHT-8E-lAc，其序列如SEQID N019所示。
7.菌株HD-8E1AC，其特征是含有權(quán)利要求6所述的重組表達載體pHT_8E-lAc。
8.權(quán)利要求5或6所述表達載體在表達Cry蛋白中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，所述蛋白為CryIAc。
全文摘要
本發(fā)明涉及“蘇云金芽胞桿菌高效表達載體、構(gòu)建方法及應(yīng)用”屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明通過比較蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis)四種不同轉(zhuǎn)錄機制的cry基因啟動子(Pcry1A、Pcry3A、Pcry4A和Pcry8E)的轉(zhuǎn)錄活性，篩選出一個強啟動子Pcry8E，構(gòu)建了一個高效表達載體pHT315-8E21b。利用該載體可以正確表達Cry蛋白，并具有生物學(xué)活性，其表達效率高于被廣泛應(yīng)用的cry3A啟動子指導(dǎo)的pSXY422b載體，具有廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號C12N1/21GK103194479SQ201310153479
公開日2013年7月10日 申請日期2012年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月21日
發(fā)明者彭琦, 宋福平, 梁影屏, 束長龍, 張 杰, 黃大昉 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所