專利名稱：：茶尺蠖核型多角體病毒蘇云金桿菌殺蟲懸浮劑及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物殺蟲劑，更具體涉及一種茶尺蠖核型多角體病毒蘇云金桿菌殺蟲懸浮劑，適用于防治茶葉茶尺蠖、茶刺蛾、巻葉蛾、茶毛蟲等茶園鱗翅目害蟲。還涉及制備茶尺蠖核型多角體病毒蘇云金桿菌殺蟲懸浮劑的方法。
背景技術(shù)：
：茶尺蠖，鱗翅目，尺蠖蛾科；別名大尺蠖、量尺蟲、油桐尺蛾、柴棍蟲、卡步蟲等；主要有油桐尺蠖、銀尺蠖、灰尺蠖、油茶尺蠖，其中以油桐尺蠖發(fā)生最多；主要分布在安徽、江蘇、浙江、江西、湖北、湖南、四川、貴州、廣東、廣西、福建等省。茶尺蠖是我國茶樹的主要害蟲之一。以幼蟲取食葉片為害，l齡幼蟲取食嫩葉葉肉，留下表皮，被害葉呈現(xiàn)褐色點(diǎn)狀凹斑；2齡幼蟲能穿孔，或自葉緣咬食，形成缺刻(花邊葉)；3齡前幼蟲在茶園中有明顯的發(fā)蟲中心，3齡起則能取食全葉，3齡后食量猛增，以末齡食量最大。茶尺蠖年發(fā)生代數(shù)多，繁殖力強(qiáng)，以夏秋茶受害重。發(fā)生嚴(yán)重時(shí)，老葉、嫩莖被幼蟲取食殆盡，致使茶叢變?yōu)楣鈼U，嚴(yán)重影響當(dāng)季茶葉產(chǎn)量和質(zhì)量，并致樹勢衰退，對茶葉生產(chǎn)的威脅很大。目前，國內(nèi)防治茶尺蠖的藥劑仍以化學(xué)藥劑為主，主要藥劑有2.5%高效氯氟氰菊酯乳油、4.5%高效氯氰菊酯乳油、2.5%聯(lián)苯菊酯乳油、40%辛硫磷乳油、2.5%溴氰菊酯、10%氯氰菊酯、40%乙酰甲胺磷乳油等。由于化學(xué)農(nóng)藥見效快、.效果好，得到了大量的使用，茶園中長期大量使用化學(xué)農(nóng)藥，殺死茶尺蠖的同時(shí)也殺死了寄生性和捕食性天敵，漸漸失去了自然天敵的控制作用，破壞了生態(tài)平衡，導(dǎo)致某些害蟲周期性大發(fā)生，或次要害蟲上升為主要害蟲；同時(shí)茶葉中農(nóng)藥的殘留量越來越高，嚴(yán)重影響了茶業(yè)的品質(zhì)和茶業(yè)出口。茶尺蠖核型多角體病毒只對茶尺蠖有效。幼蟲取食病毒后會感染病毒死亡，感染病毒死亡的蟲尸體內(nèi)含有大量病毒，可在田間繼續(xù)擴(kuò)散感染，因此后效作用強(qiáng)，但潛伏期較長，有的甚至到蛹期才能死亡。一般一年使用一到兩次就可控制全年的茶尺蠖發(fā)生。使用茶尺蠖病毒農(nóng)藥與化學(xué)農(nóng)藥防治相比，主要有以下優(yōu)點(diǎn)(l)無農(nóng)藥殘留問題。茶尺蠖核型多角體病毒和蘇云金桿菌都是純天然生物殺蟲劑，在茶葉上應(yīng)用是十分安全的。(2)不殺傷茶園病蟲天敵。由于昆蟲病毒有很強(qiáng)的專一性，即只殺靶標(biāo)害蟲，不殺傷茶園害蟲天敵，因此可以充分發(fā)揮天敵群落對害蟲群落的自然控制作用，保持次要害蟲原有的生態(tài)平衡。(3)持效期長。茶尺蠖核型多角體病毒的生存能力很強(qiáng)，在蟲尸或土壤中可以存活數(shù)年至數(shù)十年。茶園中施用昆蟲病毒后，死亡的蟲體(蟲尸)中含有大量病毒，殘留在茶樹上，下一代幼蟲食到后還會感病死亡。一般噴施1次病毒可以控制以后數(shù)代害蟲的發(fā)生。茶尺蠖核型多角體病毒防治的主要缺點(diǎn)(1)殺蟲譜窄。昆蟲病毒的專一性很強(qiáng)，茶尺蠖核型多角體病毒只對茶尺蠖等少數(shù)幾種害蟲有效，對其他的害蟲無效。而茶園中的害蟲有多種，茶園發(fā)生了其它害蟲危害，在這種情況下噴施茶尺蠖病毒是無效的。(2)效果發(fā)揮慢。害蟲的幼蟲取食病毒后，病毒在蟲體內(nèi)不斷繁殖，當(dāng)病毒達(dá)到一定數(shù)量時(shí)，幼蟲死亡。病毒在幼蟲體內(nèi)的潛伏期較長，在推廣的使用劑量下，從防治(噴藥)到死亡高峰期，一般出現(xiàn)在7—15天。而幼蟲在病毒潛伏期和發(fā)病后的前期，仍會取食葉片。蘇云金桿菌(Bt)含有活芽孢和晶體毒素，幼蟲取食后，作用于害蟲中腸，害蟲迅速停止取食，最后因敗血癥而死亡。死亡時(shí)間一般在噴藥后2-7天。蘇云金桿菌不僅可以防治茶尺蠖，還對多種鱗翅目幼蟲有很好的防效，在高溫季節(jié)也能使用，但持效期短。茶尺蠖核型多角體病毒與蘇云金桿菌混配，不僅可以防治茶尺蠖，而且還可以防治其它鱗翅目害蟲，在提高速效性的同時(shí)，也延長了持效期。一般施藥后2-5天就可以達(dá)到好的防效，持效期長達(dá)15天；對人畜無毒，對害蟲天敵也無殺傷作用，可在生產(chǎn)有機(jī)茶的茶園中應(yīng)用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是在于提供了一種茶尺蠖核型多角體病毒蘇云金桿菌殺蟲懸浮劑，該配方經(jīng)過科學(xué)篩選，殺蟲譜廣，操作方便，懸浮性能和穩(wěn)定性好，提高殺蟲效果，防治效果達(dá)82.2%以上。本發(fā)明的另一個(gè)目的是在于提供了一種茶尺蠖核型多角體病毒蘇云金桿菌殺蟲懸浮劑的制備方法。該方法工藝簡單，操作方便，避免有機(jī)溶劑可能造成的火災(zāi)和對人體的危害，減少了對環(huán)境的污染，提高了經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。茶尺蠖核型多角體病毒的防治是通過害蟲幼蟲感染病毒生病死亡實(shí)現(xiàn)的，幼蟲取食沾有病毒的葉子后，要經(jīng)過潛伏期、發(fā)病期、再到死亡期。在潛伏期，染病幼蟲與正常幼蟲同樣取食，但食量會減少；在發(fā)病期，幼蟲食量驟減直至停止取食。因此，噴施病毒后，在蟲口數(shù)量大的情況下，茶園仍然會受到危害。染病幼蟲死亡后，蟲尸中含有大量病毒，殘留在茶樹上，具有持效作用，在一定的時(shí)間內(nèi)可以控制害蟲后代的發(fā)生。茶尺蠖核型多角體病毒與蘇云金桿菌按一定比例混配，不僅可以防治茶尺蠖，還可以防治茶園的其它尺蠖和多種鱗翅目害蟲幼蟲，擴(kuò)大了殺蟲譜；單用茶尺蠖病毒防治，7-15天才是死亡高峰期，但與蘇云金桿菌混配后，2天就可以控制害蟲，提高了殺蟲效果，同時(shí)也延續(xù)了病毒的持效期。茶尺蠖核型多角體病毒與蘇云金桿菌混配，按照濃度為1.0X106、2.0X106、5.0X106、8.0X106、1.0X107、2.0X107、5.0X107、8.0X107、I.OXIO8、2.0X108、5.0X108、8.0X108、1.0X109、2.0X109、5.0X109、8.0X109、1.0X1010PIB/mL茶尺蠖核型多角體病毒與質(zhì)量含量為3%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、20%、25%蘇云金桿菌任意混配，其中1.0x1()7piB/mL茶尺蠖病毒與6%蘇云金桿菌混配的共毒系數(shù)(CTC)高達(dá)202.96，增效最為明顯。本發(fā)明中提供的茶尺蠖核型多角體病毒蘇云金桿菌殺蟲懸浮劑，對目標(biāo)害蟲的殺蟲速度和效果明顯優(yōu)于單用茶尺蠖核型多角體病毒或蘇云金桿菌，具有很好的應(yīng)用價(jià)值。劑型中茶尺蠖核型多角體病毒含量1.0xl(^—1.0xlO^PIB/mL、蘇云金桿菌含量3.0-25.0%。一種茶尺蠖核型多角體病毒蘇云金桿菌殺蟲懸浮劑，它由以下重量配比的原料制成-茶尺蠖核型多角體病毒蘇云金桿菌苯甲酸鈉有機(jī)硅消泡劑(1.0xl06-1.0xl01())PIB/mL3.0-25.0%0.1-0.5%0.1-0.4o/o水表面活性劑助懸劑增粘劑防凍劑44.1-91.6%3-腦2-7%0.1-3%0.1-10%所述的表面活性劑為聚羧酸鹽、木質(zhì)素磺酸鈉、二辛基磺基琥珀酸鈉、烷基磺酸鹽其中的一種或任意組合；所述的助懸劑為白炭黑、硅酸鎂鋁其中的一種或二種組合；所述的增粘劑為黃原膠、羧甲基纖維素、聚乙烯醇其中的一種或任意組合；所述的防凍劑為乙二醇、丙二醇其中的一種或二種組合；所述的1.0x106—1.0xl01QPIB/mL茶尺蠖核型多角體病毒，是由病毒原粉稀釋而成；3.0-25.0%蘇云金桿菌直接稱重獲得。一種茶尺蠖核型多角體病毒蘇云金桿菌殺蟲劑，其特征在于它由以下重量百分比的原料制成茶尺蠖核型多角體病毒(1.0X106-1.0X101G)PIB/mL蘇云金桿菌3.0-20.0%苯甲酸鈉0.1-0.5%有機(jī)硅消泡劑0.1-0.4%水53.8-91.6%表面活性劑3.0-9.0%'其中聚羧酸鹽0.1-5.0%木質(zhì)素磺酸鈉0.1-5.0%二辛基磺基琥珀酸鈉0.1-5.0%垸基磺酸鹽0.1-5.0%助懸劑2.0-6.5%其中白炭黑0.5-5.0%硅酸鎂鋁0.1-2.0%增粘劑0.1-1.8%其中黃原膠0.05-0.8%羧甲基纖維素聚乙烯醇防凍劑其中乙二醇丙二醇0.05-0.5Q/o0.05-0.5%0.1-8%0.1-5.0%0.1-5.0%一種茶尺蠖核型多角體病毒蘇云金桿菌殺蟲劑，它由以下重量百分比的原料制成(其優(yōu)選范圍)(1.0xl06-1.0xl09)PIB/mL5.0-15.0o/o0.1-0.5%0.1-0.4%64.9-89.2%3.0-7.0%0.5-2.5%1.0-5.0%0.5-2.5%0.5-2.5%2.0-6.0%1.0-5.0%0.5-2.0%0.1-1.2%0.1-0.8%0.1-0.5%0.1-0.5%0.5-5.0%0.5-5%0.5-5%所述的茶尺蠖核型多角體病毒不占本發(fā)明的任何重量百分比，加入茶尺蠖核型多角體病毒后產(chǎn)品的防治效果更好。茶尺蠖核型多角體病毒蘇云金桿菌苯甲酸鈉有機(jī)硅消泡劑水表面活性劑其中聚羧酸鹽木質(zhì)素磺酸鈉二辛基磺基琥珀酸鈉烷基磺酸鹽助懸劑其中白炭黑增粘劑其中黃原膠羧甲基纖維素聚乙烯醇防凍劑其中乙二醇丙二醇一種茶尺蠖核型多角體病毒蘇云金桿菌殺蟲懸浮劑的制備步驟如下1、在蘇云金桿菌中，按順序依次加入表面活性劑、助懸劑、增粘劑、防凍劑、苯甲酸鈉、有機(jī)硅消泡劑和水，然后加入茶尺蠖核型多角體病毒混合，攪拌分散。其中表面活性劑為聚羧酸鹽、木質(zhì)素磺酸鈉、二辛基磺基琥珀酸鈉、烷基磺酸鹽其中一種或任意組合；助懸劑為白炭黑、硅酸鎂鋁其中一種或二種組合；增粘劑為黃原膠、羧甲基纖維素、聚乙烯醇其中一種或任意組合；防凍劑為乙二醇、丙二醇其中一種或二種組合。2、將上述混合物經(jīng)膠體磨均勻磨細(xì)，98X微粒粒徑在75nm以下。3、上述微粒再經(jīng)砂磨機(jī)研磨，98^微粒粒徑達(dá)到0.3-5pm以下。4、調(diào)整混合物的pH值保持在6.0-7.0之間。5、抽樣檢驗(yàn)茶尺蠖核型多角體病毒和蘇云金桿菌含量。6、經(jīng)質(zhì)量檢查合格后，包裝即可得到懸浮劑(參考劉步林2003年10月出版《農(nóng)藥劑型加工技術(shù)(第二版)》)。所述的茶尺蠖核型多角體病毒含量不占本發(fā)明的百分重量比，加了所述的茶尺蠖核型多角體病毒含量使本發(fā)明的產(chǎn)品更加好，殺蟲優(yōu)勢非常好。.本茶尺蠖核型多角體病毒蘇云金桿菌復(fù)合殺蟲劑與化學(xué)藥劑、其它核型多角體病毒及其它殺蟲微生物相比，具有如下特點(diǎn)1、殺蟲譜擴(kuò)大。該殺蟲劑中蘇云金桿菌殺蟲晶體蛋白除了可以防治茶尺蠖外，還可以防治茶灰蠖以及其它鱗翅目害蟲。2、見效快。病毒在幼蟲體內(nèi)的潛伏期較長，害蟲死亡一般需要7-15天，與蘇云金桿菌混配，害蟲死亡時(shí)間縮短到2-5天，同時(shí)也保持了病毒長久的持效期。3、安全環(huán)保。該殺蟲劑為生物農(nóng)藥，無殘留，在茶葉上使用安全。本發(fā)明提供了一種茶尺蠖核型多角體病毒蘇云金桿菌殺蟲懸浮劑，其懸浮劑有以下優(yōu)點(diǎn)1、無粉塵危害，對操作者和環(huán)境安全；2、以水為分散介質(zhì)，降低環(huán)境污染，節(jié)省成本，不使用任何有機(jī)溶劑，生產(chǎn)中避免易燃、易爆和中毒問題；3、與可濕性粉劑相比，允許選用不同粒徑的原藥，以便使制劑的生物效果和物理穩(wěn)定性達(dá)到最佳；4、液體懸浮劑在水中擴(kuò)散良好，可直接制成噴霧液使用；5、比重大，包裝體積小；6、懸浮劑的分散性和展著性都比較好，懸浮率高，粘附在植物體表面的能力比較強(qiáng)，耐雨水沖刷，因而藥效較可濕性粉劑顯著且也比較持久；7、具有粒子小、活性表面大、滲透力強(qiáng)、配藥時(shí)無粉塵、成本低、藥效高等特點(diǎn)。并兼有可濕性粉劑和乳油劑型的優(yōu)點(diǎn)，可被水濕潤，加水稀釋后懸浮性好。具體實(shí)施例方式一種茶尺蠖核型多角體病毒蘇云金桿菌不同配比如下:<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>一種茶尺蠖核型多角體病毒蘇云金桿菌殺蟲懸浮劑的制備步驟如下:.1、在蘇云金桿菌中，按順序依次加入表面活性劑、助懸劑、增粘劑、防凍劑、苯甲酸鈉、有機(jī)硅消泡劑和水，然后加入茶尺蠖核型多角體病毒混合，攪拌分散。其中表面活性劑為聚羧酸鹽、木質(zhì)素磺酸鈉、二辛基磺基琥珀酸鈉、烷基磺酸鹽其中一種或任意組合；助懸劑為白炭黑、硅酸鎂鋁其中一種或二種組合；增粘劑為黃原膠、羧甲基纖維素、聚乙烯醇其中一種或任意組合；防凍劑為乙二醇、丙二醇其中一種或二種組合。2、將上述混合物經(jīng)膠體磨均勻磨細(xì)，98X微粒粒徑在75[im以下。3、上述微粒再經(jīng)砂磨機(jī)研磨，98X微粒粒徑達(dá)到0.3-5nm以下。4、調(diào)整混合物的pH值保持在6.0-7.0之間。5、抽樣檢驗(yàn)6茶尺蠖核型多角體病毒和蘇云金桿菌含量。6、經(jīng)質(zhì)量檢査合格后，包裝即可得到懸浮劑(參考劉步林2003年10月'出版《農(nóng)藥劑型加工技術(shù)(第二版)》)。試驗(yàn)例l茶尺蠖核型多角體病毒01(^PIB/克)對鵪鶉經(jīng)口毒性試驗(yàn)試驗(yàn)單位化工部農(nóng)藥安全評價(jià)監(jiān)督檢驗(yàn)中心試驗(yàn)時(shí)間2001年3月12日對武漢武大綠洲生物技術(shù)有限公司提供的茶尺蠖核型多角體病毒(EoNPV>10*18/克)進(jìn)行了鵪鶉毒性試驗(yàn)。根據(jù)預(yù)試結(jié)果，設(shè)計(jì)了5000.0mg/kg試驗(yàn)劑量，雌雄分別進(jìn)行。試驗(yàn)組和空白組同時(shí)進(jìn)行。采用經(jīng)口染毒方式，給藥后觀察7天，記錄中毒癥狀和死亡數(shù)。茶尺蠖核型多角體病毒01(^PIB/克)對雄鳥LD50:>5000.0mg/kg;對雌鳥LD5o:>5000.0mg/kg。據(jù)此結(jié)果和中國國家環(huán)保局《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》規(guī)定的鳥毒分級標(biāo)準(zhǔn)，該物質(zhì)在本實(shí)驗(yàn)室條件下對鵪鵓的毒性為"低毒級"。試驗(yàn)例2茶尺蠖核型多角體病毒01(^PIB/克)對鯉魚毒性試驗(yàn)試驗(yàn)單位化工部農(nóng)藥安全評價(jià)監(jiān)督檢驗(yàn)中心試驗(yàn)時(shí)間2001年3月23日對武漢武大綠洲生物技術(shù)有限公司提供的茶尺蠖核型多角體病毒(EoNPV>10*18/克)進(jìn)行了鯉魚毒性試驗(yàn)。根據(jù)預(yù)備試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)了5000.0mg/L試驗(yàn)濃度，同時(shí)進(jìn)行空白試驗(yàn)。試驗(yàn)采用半靜水式魚毒測定方法，試驗(yàn)用水以日本PCF-1200型活性炭過濾裝置處理。按設(shè)計(jì)劑量稱取試藥，加蒸餾水，攪拌均勻后倒入試驗(yàn)用水中，配置藥液，以不加藥為空白對照。測定試驗(yàn)開始時(shí)藥液的pH值和溶氧量。試驗(yàn)組和空白組同時(shí)進(jìn)行。水硬度和堿度在試驗(yàn)開始時(shí)測定1次，染毒接觸后，觀察96小時(shí)內(nèi)中毒癥狀和死亡率。試驗(yàn)結(jié)果標(biāo)明，武大綠洲茶尺蠖核型多角體病毒(EoNPV〉l()9piB/克)對鯉魚的LCso(96小時(shí))大于5000.0mg/L。據(jù)此結(jié)果和中國國家環(huán)保局《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》中規(guī)定的魚毒分級標(biāo)準(zhǔn)，該物質(zhì)在本實(shí)驗(yàn)室條件下對魚的毒性為"低毒級"。試驗(yàn)例3茶尺蠖核型多角體病毒毒理學(xué)試驗(yàn)評價(jià)報(bào)告試驗(yàn)單位湖北省衛(wèi)生防疫站試驗(yàn)地點(diǎn)湖北省醫(yī)學(xué)試驗(yàn)動物大樓試驗(yàn)時(shí)間2001.8.15-2001.10.81材料與方法1.1受試樣品茶尺蠖核型多角體病毒，瓶裝。有效成分為茶尺蠖核型多角體病毒。由武漢武大綠洲生物技術(shù)有限公司胡遠(yuǎn)揚(yáng)提供。1.2受試動物初成年Wistar大鼠，雌雄各半，176-198g;大耳白兔，雌雄各半，2.0±0.5kg;由湖北省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。詞養(yǎng)環(huán)境動物室溫度24°C，濕度45-75%，自然光照。動物詞以湖北省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心加工的全價(jià)顆粒飼料。大鼠每5只飼養(yǎng)于塑料動物盒內(nèi)，自由進(jìn)食飲水。動物室條件始終保持恒定。1.3實(shí)驗(yàn)環(huán)境動物室溫度24。C，適度45-75%，自然光照。動物詞以湖北省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心加工的全價(jià)顆粒飼料，飲水為純凈水，染毒前健康觀察7天。實(shí)驗(yàn)室條件始終保持恒定。1.4方法1.4.1急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)1.4丄1受試動物初成年Wistar大鼠。1.4丄2劑量分組動物編號后按體重序號隨機(jī)分組，見表l。表1茶尺蠖核型多角體病毒經(jīng)口實(shí)驗(yàn)劑量分組.性別組別齊懂(mg/kg)動物數(shù)(只)體重范圍(g)1500010176-19431500010186-1961.4丄3樣品配置根據(jù)設(shè)計(jì)劑量，灌胃容量^lml/100g體重，將樣品用蒸餾水稀釋至所需濃度。1.4丄4染毒方法給藥前12-15h動物禁食，不禁水；次晨稱重后按劑量竟經(jīng)口一次灌胃染毒，染毒后2h動物恢復(fù)自由進(jìn)食。1.4丄5實(shí)驗(yàn)觀察給藥后即觀察動物表現(xiàn)0.5h,而后2、3、4、6h觀察l-14天每天觀察2次，記錄動物中毒表現(xiàn)、轉(zhuǎn)歸及死亡情況。1.4丄6實(shí)驗(yàn)動物的處理實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，未死亡動物脫臼法處死，所有廢棄實(shí)驗(yàn)動物深埋處理。1.4.2急性經(jīng)皮毒性試驗(yàn)1.4.2.1受試動物初成年Wistar大鼠。1.4.2.2劑量分組動物編號后按體重序號隨機(jī)分組，見表2。表2茶尺蠖核型多角體病毒經(jīng)皮實(shí)驗(yàn)劑量分組性別組別劑量(mg/kg)動物數(shù)(只)體重范圍(g)$12000178-1983120005182-1961.4.2.3樣品配制根據(jù)設(shè)計(jì)劑量，染毒量S0.5ml/100g體重，將樣品用蒸餾水稀釋至所需濃度。1.4.2.4染毒方法動物染毒前24h電推剪去毛5x6cm2，將受試混懸液一次均勻涂在4x5cm2脫毛皮膚上，用塑料紙蓋住、膠布密封。染毒4小時(shí)后用溫水洗凈染毒區(qū)域終止染毒，連續(xù)14天觀察動物中毒表現(xiàn)及死亡情況。1.4.2.5實(shí)驗(yàn)觀察染毒后即連續(xù)觀察動物表現(xiàn)lh，而后2、3、4、6h觀察，1-14天每天觀察2次，記錄動物中毒表現(xiàn)、轉(zhuǎn)歸及死亡情況。1.4.2.6實(shí)驗(yàn)動物的處理實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，未死亡動物脫臼法處死，所有廢棄實(shí)驗(yàn)動物深埋處理。1.4.3急性眼刺激試驗(yàn)1.4.3.1受試動物初成年大耳白兔4只。1.4.3.2劑量0.1ml/只樣品。1.4.3.3樣品配制根據(jù)設(shè)計(jì)劑量，染毒O.hnl樣品原液1.4.3.4染毒方法取受試液0.1ml，一次滴入右眼結(jié)膜囊內(nèi)，閉合上下眼瞼約l分鐘，左眼作對照。1.4.3.5實(shí)驗(yàn)觀察滴眼后l、24、48、72h各第4、7d觀察雙眼。根據(jù)眼損傷成都評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行眼刺激分級。1.4.3.6實(shí)驗(yàn)動物的處理實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用空氣栓塞法處死動物，所有廢棄實(shí)驗(yàn)動物深埋處理。1.4.4急性皮膚刺激實(shí)驗(yàn)1.4.4.1受試動物初成年大耳白兔4只。1.4.4.2齊慢0.5ml/只樣品。1.4.4.3樣品配制根據(jù)設(shè)計(jì)劑量，按染毒量每只原液0.5ml。1.4.4.4染毒方法染毒前24小時(shí)將背部左右兩側(cè)各剪毛3x4cm2。將原液0.5ml一次均勻在右側(cè)脫毛皮膚2x3cm2上，用兩層紗布覆蓋，再用塑料紙和紗布密封固定，左側(cè)脫毛區(qū)作為對照。4小時(shí)后洗凈染毒皮膚。1.4.4.5實(shí)驗(yàn)觀察染毒后連續(xù)觀察動物皮膚刺激表現(xiàn)，lh、24h、48h至7d記錄動物表現(xiàn)、恢復(fù)情況。1.4.4.6實(shí)驗(yàn)動物的處理實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用空氣栓塞法處死動物，所有廢棄實(shí)驗(yàn)動物深埋處理。2結(jié)果2.1急性經(jīng)口毒性中毒表現(xiàn)經(jīng)觀察，動物無明顯中毒表現(xiàn)和死亡發(fā)生。結(jié)果見表3。表3茶尺蠖核型多角體病毒急性經(jīng)口毒性<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>刺激反應(yīng)經(jīng)48小時(shí)觀察，染毒區(qū)皮膚無明顯紅斑、水腫，積分均值為o份結(jié)果見表6。<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>3.結(jié)論與評價(jià)根據(jù)中華人民共和國標(biāo)準(zhǔn)GB15670-1995《農(nóng)藥登記毒理學(xué)試驗(yàn)方法》中有關(guān)毒性評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)及本次試驗(yàn)結(jié)果[(2001)檢字第80022號監(jiān)測報(bào)告]，由湖北綠洲生物技術(shù)有限公司提供的茶尺蠖核型多角體病毒受試樣品對雌性大鼠急性經(jīng)口LD5o大于5000mg/kg，屬于低毒級，對雄性大鼠急性經(jīng)口LD5o大于5000mg/kg，屬于低毒級;對雄、雌大鼠急性經(jīng)口LD5o大于2000mg/kg，屬于低毒級。對兔眼剌激積分指數(shù)1.夂0.1為3分，M丄O.I48h后為0，眼刺激強(qiáng)度為無刺激性。皮膚刺激積分值為0分，對皮膚刺激強(qiáng)度為無刺激性。試驗(yàn)例41千萬PIB/毫升茶尺蠖核型多角體病毒200IU/微升蘇云金桿菌懸浮劑配方篩選報(bào)告昆蟲桿狀病毒殺蟲劑是國際上公認(rèn)的最安全的生物殺蟲劑，茶尺蠖核型多角體病毒(EoNPV)是一種昆蟲桿狀病毒。武漢大學(xué)病毒研究所作為國內(nèi)外病毒學(xué)領(lǐng)域的知名機(jī)構(gòu)，集數(shù)十年的科技積累于大成，研制開發(fā)出針對茶尺蠖的病毒殺蟲劑，取得良好的防效。但由于病毒本省的特性，其殺蟲速度較慢，因此將昆蟲病毒開發(fā)成生物殺蟲劑受到了制約。為了改變這種狀況，我們想用其他殺蟲速度較快的生物制劑與其復(fù)配，以提高其殺蟲速度。蘇云金芽孢桿菌(Bt)是目前國際公認(rèn)的對害蟲防治效果最好的生物制劑之一，具有廣譜殺蟲的特性及抑制害蟲進(jìn)食的特點(diǎn)，但防效不夠穩(wěn)定，殘效期短，這恰恰能與EoNPV垂直傳播，持效期長，無毒無公害的特點(diǎn)形成優(yōu)勢互補(bǔ)。同時(shí)，二者之間還有協(xié)同作用，對茶尺蠖的防治效果有明顯增強(qiáng)。因此，我們通過反復(fù)試驗(yàn)篩選獲得了蘇云金桿菌與EoNPV合適組合，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下1材料與方法1.1供試材料l丄l茶尺蠖核型多角體病毒(EoNPV)為本實(shí)驗(yàn)保存提供，濃度為1.0xl09PIB/ml;1.1.2蘇云金桿菌(BacillusthuringiensisBt)為4000IU/uL,由湖北農(nóng)科院Bt研究中心生產(chǎn)提供。l丄3木質(zhì)素磺酸鈉，甲基纖維素等購于一般化工商店。1.2供試?yán)ハx茶尺蠖為室外野生的抗性品系。飼養(yǎng)條件為室溫(溫度25—32'C)，相對濕度為55%—70%。用二齡幼蟲進(jìn)行測定。1.3測定方法(噴霧法)1.3.1在初步測定的基礎(chǔ)上，將待測樣品配制成一定的梯度濃度(5—6個(gè))，設(shè)立清水為空白對照。1.3.2新鮮茶枝洗凈晾干，將不同濃度的稀釋液分別用小型噴霧器均勻噴灑于其上，晾干后分別放入60cmx40cmx20cm塑料盒中。.1.3.3取健康的二齡野生茶尺蠖幼蟲，每濃度50頭放入盒中飼料，每48小時(shí)統(tǒng)一更換新鮮干凈茶枝。室溫飼料168小時(shí)后記錄死亡蟲數(shù)，計(jì)算死亡率。1.4病毒濃度篩選1.4.1將病毒原液稀釋成1.0xl08PIB/L;2.0xl07PIB/L;1.0xl07PIB/L;2.0xl06PIB/L;1.0xl()6piB/L;五個(gè)梯度濃度，備用。1.4.2按1.3噴霧法測定各梯度死亡率，試驗(yàn)重復(fù)3次。1.5病毒與蘇云金桿菌最佳比例的篩選。1.5.1在1.4結(jié)果的基礎(chǔ)上，將茶尺蠖核型多角體病毒(EoNPV)與蘇云金桿菌(Bt)按下表所列的比例進(jìn)行混合。EoNPV與Bt混合比例表<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>1.5.2將各個(gè)樣品分別稀釋250倍，500倍，1000倍，2000倍，4000倍，五個(gè)梯度，按1.3噴霧法測定各梯度死亡率，試驗(yàn)重復(fù)3次。1.6數(shù)據(jù)處理所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Finney機(jī)率值分析處理，按S皿&Johnson方法求出共毒系數(shù)(CTC)。聯(lián)合毒力判斷標(biāo)準(zhǔn)為，共毒系數(shù)CTC〈100為拮抗作用，IOO為相加作用，CTO100為增效作用。2結(jié)果與分析2.1病毒濃度篩選茶尺蠖核型多角體病毒(EoNPV)感染二齡茶尺蠖的最佳濃度篩選結(jié)果見下表。茶尺蠖核型多角體病毒(EoNPV)不同濃度感染二齡茶尺蠖死亡率統(tǒng)計(jì)表稀釋倍數(shù)EoNPV含量平均供試蟲數(shù)平均死亡蟲數(shù)校正死亡率<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>從上表看出，病毒濃度越高，感染率就越高。從感染的效果及經(jīng)濟(jì)角度考慮，稀釋100000倍即濃度為1.0xl07PIB/L較為合適，又因?yàn)楸净靹┑脑O(shè)計(jì)稀釋倍數(shù)是750-1000倍，因此，在混劑中病毒原液(1.0x109PIB/mL)的含量定為1%是比較合理的。2.2病毒與蘇云金桿菌的最佳配比篩選茶尺蠖核型多角體病毒(EoNPV)與蘇云金桿菌(Bt)不同比例混配對茶尺蠖的感染結(jié)果分析數(shù)據(jù)見下表。<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>由上表中所列結(jié)果看出，3號混劑的組合是比較合適的組合，蘇云金桿菌(Bt)含量太高或太低時(shí)對EoNPV的增效作用都會降低。因此確定了配方中4000IU/nL的Bt含量為50%，而1.0xl09PIB/mL的病毒原液含量為1%為較科學(xué)的比例。試驗(yàn)例5茶尺蠖核型多角體病毒(EoNPV)與蘇云金桿菌(Bt)混用對茶尺蠖的聯(lián)合毒力分析目前，蘇云金桿菌殺蟲劑在國內(nèi)外生物防治中發(fā)揮著重要作用，但是，蘇云金桿菌在田間使用中存在防效不穩(wěn)定、殘效期短等問題，而昆蟲桿狀病毒具有殺蟲專一性強(qiáng)、殺蟲效果好，且能垂直傳播、持效期長。對人蓄無害的優(yōu)點(diǎn)，但是存在殺蟲速度慢問題。為了克服蘇云金桿菌和昆蟲病毒殺蟲的特點(diǎn)，發(fā)揮其各自的優(yōu)勢。因此，我們研制了茶尺蠖核型多角體病毒(EoNPV)和蘇云金桿菌(Bt)復(fù)合制劑。為了探討EoNPV對Bt的增效作用，我們通過以茶尺蠖作供試蟲，釆用孫云沛方法，對EoNPV和Bt進(jìn)行了聯(lián)合毒力的生物測定。1材料與方法1.1供試材料茶尺蠖核型多角體病毒(EoNPV)為本實(shí)驗(yàn)室保存提供，濃度為1.0xl09PIB/mL;蘇云金桿菌(Bt)為4000IU/pL，由湖北農(nóng)科院Bt研究中心生產(chǎn)提供。1.2供試?yán)ハx茶尺蠖為室外野生的抗性品系。飼養(yǎng)條件為室溫(25-32t:)，相對濕度為55%-70%。用二齡幼蟲進(jìn)行測定。1.3測定方法(噴霧法)在初步測定的基礎(chǔ)上，將藥液配置成一定的梯度濃度(5-6個(gè))。設(shè)立清水為空白對照。新鮮茶枝洗凈晾干，將不同濃度藥液用小型噴霧器均勻噴灑于其上，晾干后放入60cmx40cmx20cm塑料盒中。取健康的二齡野生茶尺蠖幼蟲，每濃度50頭放入盒中詞養(yǎng)，每48小時(shí)統(tǒng)一更換新鮮干凈的茶枝。室溫飼養(yǎng)168小時(shí)后記錄死亡蟲數(shù)，計(jì)算死亡率。1.4數(shù)據(jù)處理所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Finney機(jī)率值分析處理，按Sun&Johnson方法求出共毒系數(shù)(CTC)。聯(lián)合毒力判斷標(biāo)準(zhǔn)為，共毒系數(shù)CTC〈100為拮抗作用，IOO為相加作用，CTO100為增效作用。'2結(jié)果與分析茶尺蠖核型多角體病毒與蘇云金桿菌混配對茶尺蠖的聯(lián)合毒力分析結(jié)果見下表。分析結(jié)果標(biāo)明，在茶尺蠖核型多角體病毒與蘇云金桿菌的四個(gè)配比中，1:30，1:50，1:70三個(gè)配比均表現(xiàn)為增效作用，其中又以l:50配比的增效作用最為明顯，共毒系數(shù)CTC為202.96，并且其LC95也較茶尺蠖核型多角體病毒及蘇云金桿菌單獨(dú)使用有顯著降低，說明l:50混配時(shí)混劑的殺蟲效率最高。茶尺蠖核型多角體病毒與蘇云金桿菌混用對茶尺蠖的聯(lián)合毒力測定結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>A+B1:30Y=1.31X+2.69540.952957.031029.38137.79A+B1:50Y-1.56X+2.22420.969760.53680.98202.96A+B1:70Y=1.37X+2.21590.9689106.181689.59153.48試驗(yàn)例6茶尺蠖核型多角體病毒蘇云金桿菌殺蟲劑防治茶尺蠖田間藥效試驗(yàn)報(bào)告試驗(yàn)單位湖北省農(nóng)藥檢定管理所試驗(yàn)地點(diǎn)通城縣沙堆鎮(zhèn)示范茶場一小茶山上試驗(yàn)時(shí)間2001年7月8日1試驗(yàn)田基本情況試驗(yàn)地為紅沙土，有機(jī)質(zhì)含量1.042%，pH值5.4，茶樹樹齡一致，密度高，叢叢相連，除廂與廂外，基本無空隙，第四代茶尺蠖發(fā)生嚴(yán)重，未施藥前每十株茶樹平均有蟲63.7頭，高的超過100頭。2小區(qū)設(shè)置試驗(yàn)設(shè)6個(gè)處理，4次重復(fù)，共計(jì)24個(gè)小區(qū)，隨機(jī)區(qū)組排列，每小區(qū)20株茶樹，小區(qū)及試驗(yàn)田間四周設(shè)保護(hù)行。2.1藥劑處理A、茶尺蠖核型多角體病毒蘇云金桿菌殺蟲劑500倍B、茶尺蠖核型多角體病毒蘇云金桿菌殺蟲劑750倍C、茶尺蠖核型多角體病毒蘇云金桿菌殺蟲劑1000倍D、16000IU/mg蘇云金桿菌可濕性粉劑50克/畝E、茶尺蠖病毒750倍F、清水對照CK3試藥時(shí)間與方法在第四代茶尺蠖低齡幼蟲期(7月9日，晴天，當(dāng)時(shí)茶尺蠖大部分為1-2齡幼蟲)，下午4點(diǎn)采用手搖背負(fù)式噴霧器，按每畝藥液量50公斤均勻噴霧，先噴清水對照區(qū)，然后依次由低到高劑量逐個(gè)噴霧，每換一種藥劑將噴霧器蕩洗干凈。4調(diào)査內(nèi)容與方法采用5點(diǎn)取樣，每小區(qū)查10株，藥前調(diào)查蟲口基數(shù)，施藥后2天、5天、7天分別調(diào)査記載殘留蟲量，計(jì)算蟲口減退率及相對防效。蟲口減退率(％)=(藥前活蟲數(shù)一藥后活蟲數(shù))/藥前活蟲數(shù)x100防治效果(％)=(l—(cko活蟲數(shù)xpt!活蟲數(shù))/(ck!活蟲數(shù)xpto活蟲數(shù)))x100ck0:對照區(qū)藥前Ck1:對照區(qū)藥后pto:處理區(qū)藥前pt1:處理區(qū)藥后5施藥一周內(nèi)天氣情況<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>6藥劑對作物的直接影響試驗(yàn)期間未發(fā)現(xiàn)對茶樹有明顯的藥害。也尚未觀察到對茶樹有促進(jìn)生長現(xiàn)象。7結(jié)果武大綠洲提供的茶尺蠖核型多角體病毒蘇云金桿菌懸浮殺蟲劑對茶尺蠖有顯著防效，而單用16000IU/mg蘇云金桿菌可濕性粉劑或茶尺蠖病毒則防效偏低。茶尺蠖核型多角體病毒蘇云金桿菌殺蟲劑500、750、1000倍、16000IU/mg蘇云金桿菌可濕性粉劑畝用量50克和茶尺蠖病毒750倍，二天后對茶尺蠖防效分別為63.7%、63.27%、65.37%、29.71%、30.28%;藥后五天分別為91.93%、82.20%、75.37%、51.69%、52.21%;藥后七天分別為94.96%、88.54%、78.84%、72.82%、61.60%。以畝用500倍效果最佳，5-7天的防治達(dá)91.93%—94.96%，其次為750倍效果達(dá)82.20%—88.54%，蘇云金桿菌防效最差。8評價(jià)根據(jù)今年茶尺蠖大發(fā)生的情況我們認(rèn)為武大綠洲的茶尺蠖核型多角體病毒蘇云金桿菌殺蟲劑對茶尺蠖有很好效果，但速效差，藥后五天防效才有好轉(zhuǎn)，七天的防效達(dá)94.96%，持效期長，且防效大大高于單用16000IU/mg蘇云金桿菌可濕性粉劑或茶尺蠖病毒，防治時(shí)期宜在低齡前(l-2齡期)施藥。根據(jù)2001年試驗(yàn)結(jié)果，應(yīng)避免施藥時(shí)期l一2天內(nèi)下雨，否則重施藥。用量以500-750倍為宜。表一茶尺蠖核型多角體病毒蘇云金桿菌防治茶尺蠖藥效調(diào)査處理重復(fù)藥后.二天藥后五天藥后七天減退率防效減退率防效減退率防效154.8461.2288.7191.6593.5595.36256.9463.0286.1189.7391.679楊A(yù)60.9466.46卯.6393.0792.1994.38458.1864.0990.9193.2894.5596.08平均63.7091,9394.96155.8162.0574.4281.0883.7288.28258.9364.7376.7982.8482.1487.14B53.1959.8074.4781.1285.1189.28460.9866.4978.0583.7785.3789.46平均63.2782.2088.54159.3265.0766.1074.9369.4978.03260.2965.卯66.1874.9972.0679.88C61.7367.1469.1477.1871.0679.55457.3363.3665.3374.3669.3177.91平均65.3775.3778.84117.7429.3633.8751.0961.2972.12214.9326.9532.8450.3359.7070.98D19.6132.6135.2952.1462.7573.17418.3729.卯36.7353.2165.3175.02平均29.7151.6972.82118.2929.8338.2754.355063.99216.4828.2834.0751.2446.1561.22E21.5432.6235.3852.2144.6260.12418.9230.3733.7851.0345.9561.08平均30.2852.2161.601-15.79-31.58-36.842-17.31-38.46-40.74F-18.75-35.94-40.634-13.95-34.88-37.21平均-16.45-35.22-38.86表二茶尺蠖核型多角體病毒蘇云金桿菌對茶尺蠖防效單位頭/10株<table>complextableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>試驗(yàn)例71千萬PIB/毫升茶尺蠖核型多角體病毒，2000IU/微升蘇云金桿菌懸浮劑質(zhì)量控制指標(biāo)及檢測方法'該產(chǎn)品有效成分茶尺蠖核型多角體病毒、蘇云金桿菌的其他名稱、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及生物學(xué)特性如下-a)茶尺蠖核型多角體病毒通用名稱EoNPV;病毒形態(tài)不規(guī)則的三角形、四角形或近似圓形；病毒核酸雙鏈環(huán)DNA，MW7.1xl07d;結(jié)構(gòu)多肽包涵體蛋白，MW28000d;顆粒大小直徑約為1.66^mtt0.5nm病毒粒子大小50nm—55nmx250腿一275nm病毒分類及命名桿狀病毒科,桿狀病毒屬；生物活性殺蟲；穩(wěn)定性25"C以下貯存生物活性穩(wěn)定。b)蘇云金桿菌通用名Bacillusthuringiensis;相對分子量約為130000(按1995年國際相對原子質(zhì)量計(jì))；生物活性殺蟲穩(wěn)定性對紫外光敏感，遇堿分解。1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了l千萬PIB/毫升茶尺蠖核型多角體病毒，2000IU/微升蘇云金桿菌懸浮劑的要求、試驗(yàn)方法以及標(biāo)志、標(biāo)簽、包裝、貯運(yùn)。本標(biāo)準(zhǔn)適用于茶尺蠖核型多角體病毒原液、蘇云金桿菌原粉、適宜的助劑和填料復(fù)配所得的l千萬PIB/毫升茶尺蠖核型多角體病毒，2000IU/微升蘇云金桿菌懸浮劑。2規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單(不包括勘誤的內(nèi)容)或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)，然而，鼓勵根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。GB/T1250極限值的表示方法和判斷方法GB/T1601—1993農(nóng)藥pH值測定方法GB/T1604商品農(nóng)藥驗(yàn)收規(guī)則GB/T1605-2001商品農(nóng)藥采樣方法GB/T14825—1993農(nóng)藥可濕性粉劑懸浮率測定方法GB/T16150—1995農(nóng)藥粉劑、可濕性粉劑細(xì)度測定方法GB3769農(nóng)藥包裝通則HG3616-1999蘇云金桿菌原粉3要求3.1組成和外觀:本品由符合標(biāo)準(zhǔn)的茶尺蠖核型多角體病毒、蘇云金桿菌原藥制成，灰白色或棕黃色懸浮液體，存放過程中，可能出現(xiàn)沉淀，但經(jīng)手輕搖動，應(yīng)恢復(fù)原狀。3.21千萬PIB/毫升茶尺蠖核型多角體病毒，2000IU/微升蘇云金桿菌懸浮劑應(yīng)符合表1的要求表l1千萬PIB/毫升茶尺蠖核型多角體病毒2000IU/微升蘇云金桿菌懸浮劑控制項(xiàng)<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>注無大腸桿菌、志賀氏菌、沙門氏菌等致病菌群。4試驗(yàn)方法4.1抽樣按照GB/T1605-2001中"液體制劑采樣"方法進(jìn)行。用隨機(jī)數(shù)表法確定抽樣的包裝件，最終抽樣量應(yīng)不少于200mL。4.2鑒別試驗(yàn)病毒的鑒別試驗(yàn)通過形態(tài)觀察和用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)進(jìn)行。形態(tài)觀察可與定量計(jì)數(shù)同時(shí)進(jìn)行，蘇云金桿菌的鑒別試驗(yàn)按HG3616—1999中4.2進(jìn)行。4.2.1茶尺蠖核型多角體病毒的鑒別一酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)4.2.1.1方法提要.病毒形態(tài)的觀察可與定量計(jì)數(shù)同時(shí)進(jìn)行，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)進(jìn)行特異性鑒別。4.2.1.2試劑和溶液磷酸鹽緩沖溶液0.2mol/L，NaHP03-NaH2P03，PH值7.2;生理鹽水0.85%的氯化鈉溶液，滅菌后用；飽和磷酸銨PH值7.0;鄰苯二胺；蔗糖；疊氮鈉；硫酸；c(l/2H2S04=2mol/L);硫柳汞10g/L的溶液。4.2.1.3儀器普通離心機(jī)4000r/min;超速離心機(jī)65，000r/min;聚苯乙烯微量滴定板；751紫外分光光度計(jì)；電子顯微鏡30000倍；注射器5mL。4.2.1.4試驗(yàn)步驟a)抗原的制備多角體的提純收集人工感染EoNPV的病死幼蟲，稱重后搗碎，按l:40的比例，即每克蟲體加40mL磷酸鹽緩沖液，紗布過濾，濾液經(jīng)1500r/min4000r/min差異離心3次可得純凈的多角體粗制品。再經(jīng)45%—65%(w/w)蔗糖密度梯度離心，取出病毒帶，吸取蔗糖可得到純凈的多角體。再用45%—75%(w/w)蔗糖密度梯度離心(離心力41000g,溫度4。C)2h。所獲得EoNPV在電鏡下檢査為純凈的EoNPV。b)抗血清的制備稱取純化病毒50mg用無菌生理鹽水配成5mL病毒懸液，免疫雄性家兔。選體重2.5kg健康的雄性家兔，進(jìn)行靜脈注射5次，劑量分別為2、4、8、16、25mg/次，即0.2mL，0.4mL，0.8mL，1.6mL，2.5mL。每次間隔4d。末次注射一周后，殺兔采血，凝血后采集血清，加疊氮鈉防腐，終濃度為1%，經(jīng)對流免疫電泳和瓊脂雙擴(kuò)試驗(yàn)鑒定，并測定凝集效價(jià)。'C)酶聯(lián)免疫試驗(yàn)(ELISA)檢測1)抗原病毒標(biāo)樣稀釋液EoNPVl(^PIB/mL，102PIB/mL，待檢樣品稀釋成lmg/mL，0.1mg/mL。2)辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記兔抗EoNPV的制備采用飽和硫酸胺沉淀透析法提取IgG，以752型分光光度計(jì)測定IgG，含量為30mg/mL，并采集其凝集效價(jià)為l:16000，然后用HRP按二步法制備酶標(biāo)IgG，測定酶和IgG的結(jié)合量，算出酶與IgG的克分子比為0.9612，用瓊脂雙擴(kuò)試驗(yàn)和對流免疫電泳鑒定酶標(biāo)IgG，在形成單一沉淀線后加酶底物鄰苯二胺，沉淀線顯色，證實(shí)酶與IgG結(jié)合良好，具有酶活力。.3)ELISA檢測(雙抗體夾心法)取特異性抗血清吸附于固相載體，聚苯乙烯微量滴定板作固相載體；取含有抗原的待檢測液，與致敏的固相載體溫育后清洗；加入酶標(biāo)記的特異性抗體，溫育后清洗；加入新配制的鄰苯二胺，室溫下反應(yīng)30min，滴硫酸溶液50微升，終止反應(yīng)，出現(xiàn)黃色為陽性。用標(biāo)準(zhǔn)病毒稀釋液進(jìn)行對照試驗(yàn)。4.3茶尺蠖核型多角體病毒含量的測定4.3.1方法提要試樣用蒸餾水反復(fù)在離心管中以8000r/min清洗后懸浮，然后將樣品在電子顯微鏡下直接計(jì)數(shù)。4.3.2試劑和溶液水二次蒸餾水；鹽酸c(HCl)二0.1mol/L溶液4.3.3儀器電子顯微鏡，能放大8000—30000倍；銅網(wǎng)4>3mm，銅網(wǎng)孔徑為75pm;離心機(jī)8000r/min;微量注射器5pL。4.3.4測定步驟將樣品搖勻后用取樣器吸取lmL水懸浮液(精確至0.01mL)，在1.5mL離心管內(nèi)以8000r/min離心15min反復(fù)清洗。棄去上清液，沉淀用lmL蒸餾水懸浮并全部轉(zhuǎn)移至UlOOmL容量瓶中加蒸餾水至刻度,搖勻。然后取該懸浮液l^L滴在孔徑為75^m的銅網(wǎng)上，室溫干燥后在電鏡下放大10000倍直接計(jì)數(shù)。4.3.5計(jì)算茶尺蠖核型多角體病毒含量計(jì)算x,按式(1)計(jì)算。x尸ax105............................................................(1)式中^一樣品的病毒含量，單位為PIB/mL;a—電鏡下的病毒計(jì)數(shù)，單位為PIB。4.3.6允許差取其算術(shù)平均值為測定結(jié)果，但每個(gè)樣品2次重復(fù)測定結(jié)果最大偏差不得超過15%。4.4蘇云金桿菌毒蛋白含量測定毒素蛋白含量用SDS-PAGE—洗脫比色法進(jìn)行測定。4.4.1方法提要用堿性溶液處理蘇云金桿菌伴孢晶體，使其降解為毒素蛋白，然后通過SDS-PAGE，依蛋白質(zhì)相對分子量的差異，使毒素蛋白與其他蛋白質(zhì)分離，再割膠，洗脫，測定吸光度。4.4.2儀器分光光度計(jì)；電泳儀；離心機(jī)10000r/min;分析天平精確至0.0001g。莢芯式垂直電泳槽(1.5mm凹形帶槽橡膠模框)、凝膠面積145mmxi00mm(1.5mm、12孔樣品槽模具；高速薄層層析掃描儀或電泳圖像掃描儀；4.4.3試劑和溶液吡咯；過硫酸銨(AP);十二垸基硫酸鈉(SDS);四甲基乙胺(TEMED);氫氧化鈉。30%丙烯酰胺稱取丙烯酰胺30g,亞甲基雙丙烯酰胺(原稱甲插雙丙烯酰胺)0.8g，溶于100mL蒸餾水中，過濾，于4"暗處貯存?zhèn)溆谩moL/L、pH8.8三羥基甲基甲烷一HCl緩沖液稱取三羥基甲基甲烷30.25g溶于蒸餾水中，用濃鹽酸調(diào)至pH8.8，用蒸餾水定容至250mL。lmoL/L、pH6.8三羥基甲基甲垸一HCl緩沖液稱取三羥基甲基甲垸12.10g溶于蒸餾水中，用濃鹽酸調(diào)至pH6.8，用蒸餾水定容至100mL。電極緩沖液稱取三羥基甲基甲烷3.03g,甘氨酸14.42g，十二垸基硫酸鈉lg，用蒸餾水溶解并定容至1000mL。3x樣品稀釋液lmoL/L、pH6.8三羥基甲基甲烷一HCl緩沖液18.75mL，十二烷基硫酸鈉6g，甘油30mL。巰基乙醇15mL，少許溴酚藍(lán)，用蒸餾水定容至100mL。染色液稱取考馬斯亮藍(lán)(CBB)R-250lg加入甲醇450mL，冰乙酸100mL，蒸餾水450mL，溶解過濾后使用。脫色液量取甲醇100mL，冰乙酸35mL，用蒸餾水定容至1000M1.漂洗液量取無水乙醇30mL，冰乙酸10mL，蒸餾水60mL,混合均勻后使用。毒素蛋白標(biāo)樣毒素蛋白(相對分子量為130000)含量為9.3%的原粉。4.4.4試樣的處理稱取標(biāo)樣20mg(準(zhǔn)確至0.1mg)，移至5mL離心管，力B2mL水充分懸浮。量取待測試樣10mL(準(zhǔn)確至0.01mL),用蒸餾水溶解并定容至100mL，充分搖勻后取2mL溶液，移至5mL離心管中。在上述2mL試樣溶液中加入0.55mol/L氫氧化鈉溶液0.45mL(使氫氧化鈉溶液的終濃度為0.01mol/L)放置約5min，再加入3x樣品稀釋液1.30mL，使最終體積為3.75mL，于100。C沸蒸餾水中煮6min，離心(2000r/min)10min后取上層清液，以備電泳上樣。4.4.5SDS-PAGE分離毒素蛋白a)制備8%10%聚丙烯酰胺凝膠釆用不連續(xù)緩沖系統(tǒng)，制膠方法見HG3616一1999附錄A(提示的附錄)。b)上樣取上述標(biāo)樣溶液上層清液，于上樣空中分別上樣15、20、30、40、50nL(毒素蛋白含量約為7.525pg)，作為標(biāo)準(zhǔn)曲線，再取一定體積溶液上層清液(毒素蛋白含量約為15嗎)，加入到上樣孔中，注入電極緩沖液后，接通電源。c)電泳電泳初期電壓控制在100V左右，待試樣進(jìn)入分離膠后，加大電壓到120V，繼續(xù)電泳，當(dāng)指示劑的前沿到達(dá)距底端lcm左右時(shí)停止電泳，取出膠板，在7.5%(體積百分?jǐn)?shù))的乙酸中浸泡30min。d)染色將分離膠部分取下，用考馬斯亮藍(lán)(CBB)R-250染色液染色過夜。e)脫色倒去染色液，用漂洗液洗滌凝膠，然后加入脫色液，于37'C下加熱使其脫色，更換幾次脫色液，直至背景清晰為止。4.4.6測定用手術(shù)刀刮下待測區(qū)帶，放于玻璃試管中，再加25X吡咯(體積百分比)3.0mL，于37'C下振蕩洗滌脫毒素蛋白所吸附的考馬斯亮藍(lán)(CBB)R-250，平衡后用分光光度計(jì)，以25%吡咯為參比，于605nm下，測定溶液的吸光度。4.4.7計(jì)算蘇云金桿菌毒素蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)X2按式(2)計(jì)算。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage34</formula>式中m,—從標(biāo)準(zhǔn)曲線上査得的樣品中毒素蛋白的量，單位為微克0ig);m2—2mL稀釋液中樣品的質(zhì)量，單位為毫克(mg);V!—樣品中最終定容體積，毫升(mL)G.75mL);V2—注入凝膠上樣控的樣品體積，微升OlL)。4.4.8允許差取其算術(shù)平均值為測定結(jié)果。兩次平行測定結(jié)果相對偏差小于8%。4.5pH值的測定按GB/T1601—1993進(jìn)行測定。4.6懸浮率測定量取試樣5mL(精確至0.01mL)，于IOOmL三角玻璃瓶中，加入標(biāo)準(zhǔn)硬水IOOmL，用手左右振蕩50次。制得的懸浮液全部轉(zhuǎn)移到250mL具塞量筒中，用標(biāo)準(zhǔn)硬水稀釋到250mL。將處理后量筒底部剩余部分(25mL)取1^L按照4.3中的方法對病毒含量進(jìn)行測定，取lmL按照4.4中的方法對蘇云金桿菌毒素蛋白含量進(jìn)行測定，按GB/T14825-1993中的計(jì)算式計(jì)算茶尺蠖核型多角體病毒和蘇云金桿菌毒素蛋白的懸浮率。'4.7篩析測定吸取20mL試樣(準(zhǔn)確至0.01mL)，按GB/T16150—1995方法中的濕篩法進(jìn)行。4.8產(chǎn)品的檢驗(yàn)與驗(yàn)收應(yīng)符合GB/T1604的規(guī)定，極限數(shù)值處理按GB/T1250采用修約值比較法。5標(biāo)志、標(biāo)簽、包裝、貯運(yùn)5.11千萬PIB/毫升茶尺蠖核型多角體病毒'2000IU/微升蘇云金桿菌懸浮劑的標(biāo)志、標(biāo)簽和包裝，應(yīng)符合GB3796中的規(guī)定。5.21千萬PIB/毫升茶尺蠖核型多角體病毒.2000IU/微升蘇云金桿菌懸浮劑用鋁箔袋包裝。規(guī)格為20mL/袋，外包裝為鈣塑箱，400袋/箱。根據(jù)用戶需要和合同協(xié)議可以采取其他形式的包裝，但要符合GB3769中的有關(guān)規(guī)定。5.3包裝件應(yīng)存放在通風(fēng)千燥的庫房中。5.4貯運(yùn)時(shí)，嚴(yán)防潮濕和日曬，不得與食物種子、飼料混合，避免和皮膚接觸，防止由口鼻吸入。5.5安全本品屬于低毒制劑，在使用說明和包裝袋上，應(yīng)有醒目的標(biāo)志，如誤食，可催吐并立即送醫(yī)院救治。施藥時(shí)應(yīng)做好防護(hù)措施。施藥后立即洗手。保證期在規(guī)定的貯運(yùn)條件下，l千萬PIB/毫升茶尺蠖核型多角體病毒'2000IU/微升蘇云金桿菌水懸浮劑的質(zhì)量保證期，從生產(chǎn)日期起為二年。權(quán)利要求1.一種茶尺蠖核型多角體病毒蘇云金桿菌殺蟲劑，它由以下重量百分比的原料制成茶尺蠖核型多角體病毒(1.0×106-1.0×1010)PIB/mL蘇云金桿菌3.0-25.0％苯甲酸鈉0.1-0.5％有機(jī)硅消泡劑0.1-0.4％水44.1-91.6％表面活性劑3-10％助懸劑2-7％增粘劑0.1-3％防凍劑0.1-10％所述的表面活性劑為聚羧酸鹽、木質(zhì)素磺酸鈉、二辛基磺基琥珀酸鈉、烷基磺酸鹽其中的一種或任意組合；所述的助懸劑為白炭黑、硅酸鎂鋁其中的一種或二種組合；所述的增粘劑為黃原膠、羧甲基纖維素、聚乙烯醇其中的一種或任意組合；所述的防凍劑為乙二醇、丙二醇其中的一種或二種組合。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的-種茶尺鑊核型多角體病毒蘇云金桿菌殺蟲劑，它由以下重量百分比的原料制成茶尺鑊核型多角體病毒(l.oxlo氣l.oxlo,o)PIB/mL蘇云金桿菌3.0-20.0%苯甲酸鈉0.1-0.5%有機(jī)硅消泡劑0.1-0.4%水53.8-91.6%表面活性劑3.0-9.0%助懸劑2.0-6.5%增粘劑0.1-1.8%防凍劑0.1-8％。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的-種茶尺鑊核型多角體病毒蘇云金桿菌殺蟲劑，其特征在于它由以下重量百分比的原料制成茶尺蟆核型多角體病毒(l.oxlo6-1.oxlog)PIB/mL蘇云金桿菌5.0-巧.0%苯甲酸鈉0.1-0.5%有機(jī)硅消泡劑0.1-0.4%水64-89.2%表面活性劑3.0-7.0%助懸劑2.0-6.0%增粘劑0.1-1.2%防凍劑0.5-5.0％。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的-種茶尺鑊核型多角體病毒蘇云金桿菌殺蟲劑，它由以下重量百分比的原料制成茶尺鑊核型多角體病毒1.Oxl06PIB/mL蘇云金桿菌15.0%苯甲酸鈉0.3%有機(jī)硅消泡劑0.1%水673%木質(zhì)素磺酸鈉5.0%烷基磺酸鹽2.0%白炭黑5.0%黃原膠0.1%梭甲基纖維素0.1%聚乙烯醇0.1%乙二醇5.0％。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的-種茶尺蟆核型多角體病毒蘇云金桿菌殺蟲劑，它由以下重量百分比的原料制成茶尺鑊核型多角體病毒1.ox1O7PIB/mL蘇云金桿菌8.0%苯甲酸鈉0.5%有機(jī)硅消泡劑0.2%水78.5%聚梭酸鹽2.5%木質(zhì)素磺酸鈉1.5%白炭黑3.0%硅酸鎂鋁0.5%梭甲基纖維素0.1%聚乙烯醇0.2%丙二醇5.0％。6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的-種茶尺蝮核型多角體病毒蘇云金桿菌殺蟲劑，其特征在于它由以下重量百分比的原料制成茶尺鑊核型多角體病毒5.0又106PIB/mL蘇云金桿菌巧.0%苯甲酸鈉0.1%有機(jī)硅消泡劑0.4%水75.3%二辛基磺基墟拍酸鈉0.5%烷基磺酸鹽2.5%硅酸鎂鋁2.0%黃原膠0.8%梭甲基纖維素0.4%乙二醇1.5%丙二醇1.5％。7、根據(jù)權(quán)利要求1所述的-種茶尺蝮核型多角體病毒蘇云金桿菌殺蟲劑，它由以下重量百分比的原料制成茶尺鑊核型多角體病毒6.0、107PIB/mL蘇云金桿菌9.0%苯甲酸鈉0.1%有機(jī)硅消泡劑0.3%水75.1%木質(zhì)素磺酸鈉4.0%二辛基磺基唬拍酸鈉2.0%白炭黑5.0%硅酸鎂鋁1.0%聚乙烯醇0.5%乙二醇2.5%丙二醇0.5％。8、根據(jù)權(quán)利要求1所述的-種茶尺蟆核型多角體病毒蘇云金桿菌殺蟲劑，它由以下重量百分比的原料制成茶尺鑊核型多角體病毒1.ox109PIB/mL蘇云金桿菌5.0%苯甲酸鈉0.2%有機(jī)硅消泡劑0.2%水83.6%木質(zhì)素磺酸鈉1.0%烷基磺酸鹽2.5%白炭黑3.0%硅酸鎂鋁1.5%梭甲基纖維素0.5%乙二醇0.5%丙二醇2.0％。9、根據(jù)權(quán)利要求1所述的-種茶尺鑊核型多角體病毒蘇云金桿菌殺蟲劑，其特征在于它由以下重量百分比的原料制成茶尺蟆核型多角體病毒1.0義108PIB/mL蘇云金桿菌10.0%苯甲酸鈉0.5%有機(jī)硅消泡劑0.2%水76.7%聚羧酸鹽0.5%木質(zhì)素磺酸鈉4.0%白炭黑1.5%硅酸鎂鋁1.7%黃原膠0.8%聚乙烯醇0.1%乙二醇4.0%。10、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種茶尺蠖核型多角體病毒蘇云金桿菌殺蟲劑，其特征在于它由以下重量百分比的原料制成茶尺蠖核型多角體病毒2.0x107PIB/mL蘇云金桿菌9.0%苯甲酸鈉0.3%有機(jī)硅消泡劑0.3%水78.9%聚羧酸鹽2.5%二辛基磺基琥珀酸鈉2.0%烷基磺酸鹽0.5%白炭黑1.0%硅酸鎂鋁2.0%羧甲基纖維素0.5%聚乙烯醇0.5%丙二醇2.5%。全文摘要本發(fā)明公開了一種茶尺蠖核型多角體病毒蘇云金桿菌殺蟲懸浮劑及制備方法。該劑型中主要成份是茶尺蠖核型多角體病毒和蘇云金桿菌，其中茶尺蠖核型多角體病毒包涵體含量(1.0×10⁶-1.0×10¹⁰)PIB/mL、蘇云金桿菌含量(3.0-25.0)％，它由茶尺蠖核型多角體病毒、蘇云金桿菌、聚羧酸鹽、木質(zhì)素磺酸鈉、二辛基磺基琥珀酸鈉、烷基磺酸鹽、白炭黑、硅酸鎂鋁、苯甲酸鈉、黃原膠、羧甲基纖維素、聚乙烯醇、乙二醇、丙二醇、有機(jī)硅消泡劑和水按一定比例組成。本發(fā)明對環(huán)境生物、人畜無害，無環(huán)境污染，無殘留，能有效控制茶尺蠖的發(fā)生和危害，適于在茶樹上大量施用，持效期長，又加快病毒殺蟲速度，使病毒殺蟲劑的殺蟲時(shí)間縮短到3-5天。文檔編號A01P7/00GK101366395SQ200810197200公開日2009年2月18日申請日期2008年10月8日優(yōu)先權(quán)日2008年10月8日發(fā)明者萬愛國,飛姜,李勝林,明楊,王柏海,胡家鑫,鄔開朗申請人:武漢武大綠洲生物技術(shù)有限公司