專利名稱：一種高活力β-淀粉酶的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種植物中的淀粉酶的分離提純方法，尤其是一種工業化生產高活力β -淀粉酶的方法。
背景技術：
β-淀粉酶(E.C3.2.1.2)是淀粉酶的一種，又稱1，-3-麥芽糖苷酶。β -淀粉酶廣泛存在于大麥，小麥，甘薯，豆類等植物中，還有不少微生物能產生β_淀粉酶。β_淀粉酶在食品工業中作為生物催化劑，可以應用于麥芽糖、啤酒、面包等的生產和制造。在食品點心上使用β_淀粉酶可以防止淀粉老化，在醫藥工業上制造注射用麥芽糖，可以和α-淀粉酶一起作為消化劑。近年來，以β_淀粉酶作為生物催化劑制造麥芽糖漿，補足了我國食糖不足的狀況。隨著科技進步，人們對高麥芽糖漿，超高麥芽糖漿研究非常活躍。但國內由甘薯，小麥來生產淀粉酶的活力低(50萬u/ml)，耐溫性差(58°C)，不符合高麥芽糖，超高麥芽糖漿的生產要求。進口的高活力β -淀粉酶雖然能夠符合高麥芽糖漿的生產，但由于其耐溫性不及大豆β-淀粉酶，在用于生產高麥芽糖時β-淀粉酶的使用量大，且生產高麥芽糖時所必需的普羅蘭酶用量也要大于大豆β_淀粉酶(大麥β_淀粉酶的使用PH窄和普羅蘭酶pH不一致所造成的)。上述高活力大豆β_淀粉酶的工藝應用于工業化生產，使用范圍受到限制，價格高，不能滿足需求。與此同時，國內科研部門雖然取得了不少淀粉酶的制備方法科研成果，但是大部分能耗高，環境污染高(鹽析方法`)，原料的綜合利用率低，成本高(原料采用低溫豆柏，價格3500元/噸以上)(參見名稱為《大豆β -淀粉酶的制備工藝》、專利號為99102506的中國發明專利)。

發明內容
本發明的目的是提供一種消耗資源少，得率高、活力高、性能好的β -淀粉酶制備方法。依據該制備方法獲得的產品具有耐溫、耐酸優于同類產品的優點，且保存穩定性好，是應用效果較好的高活力β_淀粉酶。本發明提供了一種β -淀粉酶的制備方法，包括分離水收集，預處理，沉淀并溶出β -淀粉酶，采用聚丙烯酸與溶液中的β -淀粉酶形成復合沉淀物，溶解復合沉淀物，調節PH大于等于6.0溶出β-淀粉酶，經凈化，濃縮，配以穩定劑，精制后獲得高活力淀粉酶
上述方法中，可以采用廢棄的植物提取液作為原料。例如，本發明的優選例中，以大豆蛋白分離水作為分離水原料。上述方法中，可以采用聚凝劑及篩選的濾材對分離水進行固液分離，使濾液不會堵塞超濾膜。其中，分離水收集后，調整溫度10-50°c，pH 3.2-5.0。
加入濃度為0.05-5%的PAA (聚丙烯酸)。加入PAA后分離沉淀物，再中和沉淀物溶出淀粉酶。在本發明的一個優選實施例中，上述的PAA.Ε (聚丙烯酸.淀粉酶)復合沉淀物，加水溶解并加入碳酸鈣中和至ΡΗ6.0以上，促進Ca2+能與沉淀物中PAA形成溶解度更小的復合物沉淀，而使酶蛋白釋放溶于水中。上述方法中，溶出淀粉酶后，還包括聚凝除雜質，超濾的步驟。超濾過程中，可以采用10Κ-30Κ道爾頓分子量的濾材進行濃縮。所述的濾材可以是有機膜、無機膜或者金屬膜。超濾到一定倍數后，調整pH和聚凝劑使得殘余蛋白及膠體物質沉淀。超濾可以分二段進行，第一段對濃縮液進行聚凝處理并調整pH，使得濃縮液中非含酶物質得到沉淀；第二段對第一段獲得的產物過濾后再進行二次濃縮。超濾分二次進行，首先對粗酶液進行聚凝處理并調整PH4.5-5.5，使得非酶物質得到沉淀，過濾后的粗酶液再進行超濾濃縮。從而有效地提高了濃縮倍數從而得到高活性的β _淀粉酶。在本發明的優選例中，加入了酶穩定劑(含有食鹽，糊精，醋酸鈉)，以進一步提升所得大豆淀粉酶的性能。上述方法中，可以采用助濾劑進行固液分離或微孔膜進行精制，和去除微生物 本發明的制備方法，以廢棄植物提取液為原料，不僅變廢為寶，綠色環保，而且能夠大
幅度的減少大豆蛋白質工·廠分離水中C0D。化學需氧量COD (Chemical Oxygen Demand)是以化學方法測量水樣中需要被氧化的還原性物質的量。水樣在一定條件下，以氧化I升水樣中還原性物質所消耗的氧化劑的量為指標，折算成每升水樣全部被氧化后，需要的氧的毫克數，以mg/L表示。它反映了水中受還原性物質污染的程度。該指標也作為有機物相對含量的綜合指標之一。利用本發明的制備方法，生產I噸高活力β -淀粉酶可以節約10余噸豆柏，同時還可以減少大豆蛋白質工廠分離水中COD約20-30%。另一方面，本發明還提供了依據上述制備方法生產的大豆淀粉酶，其特性為最適作用溫度60-63°C，作用溫度范圍40-65°C，最適作用pH5.5，作用pH范圍3.8-7.0。本發明制備的β_淀粉酶，其酶活最高可以達到100萬u/ml (lu即I個酶活力單位，它是指定適宜反應條件下，每小時產生I毫克麥芽糖的酶量)。由于該產品具備上述優異特性，保證制糖高效率，又增強了抗御微生物對糖化液污染的危害。圖1顯示，本發明的制備方法生產的大豆β -淀粉酶在較高的溫度，不僅活性沒有降低，反而略有提升。而同樣溫度下，大麥淀粉酶的活性就迅速下降。圖2顯示，在其他條件相同的情況下，大麥β -淀粉酶在pH彡4.5時，幾乎沒有活性，當pH大于4.5后，活性逐步提高，在pH=5.5時達到最高峰，隨后立即下降；而本發明的制備方法生產的大豆β-淀粉酶在較寬的PH范圍內，活性穩定。本發明高活力β -淀粉酶制備方法優異效果:
采用廢棄大豆蛋白分離液提取β_淀粉酶達到綜合利用，變廢為寶，能夠減少大豆蛋白質工廠分離水中C0D，對改善環境起到很好作用。
采用PAA沉淀分離獲得β_淀粉酶方法簡單，收率高，采用超濾濃縮可以獲得高活力β_淀粉酶。更重要的是，運用本發明獲得比其他植物提取的β_淀粉酶更優異的產品特性，保證制糖高效率又增強了抗御微生物對糖化液污染的危害。本發明高活力β_淀粉酶適合于上述工業產品的制造。特別是制造高麥芽糖漿，超高麥芽糖糖漿及防止淀粉老化的優選產品。比較試驗顯示，在生產高麥芽糖時，大豆β -淀粉酶的使用量相比大麥β -淀粉酶可以減少20%，普羅藍酶的用量也可減少20%。


圖1是大豆β -淀粉酶和大麥β -淀粉酶對溫度的耐受比較圖。其中，橫坐標是溫度(攝氏度)，縱坐標是相對酶活。SBA是大 β -淀粉酶,BBA是大麥β_淀粉酶。圖1顯示，本發明的制備方法生產的大豆β_淀粉酶在較高的溫度，不僅活性沒有降低，反而略有提升。而同樣溫度下，大麥淀粉酶的活性就迅速下降。圖2是大豆β -淀粉酶和大麥β -淀粉酶對酸堿度的耐受比較圖。其中，SBA=Soyβ-amylase (大豆 β-淀粉酶)，BBA=Barley β -amylase (大麥β -淀粉酶);
橫坐標是pH值，縱坐標是相對酶活。SBA是大豆β -淀粉酶，BBA是大麥β -淀粉酶；圖中顯示，在其他條件相同的情況下，大麥β -淀粉酶在pH彡4.5時，幾乎沒有活性，當pH大于4.5后，活性逐步提高，在 pH=5.5時達到最高峰，隨后立即下降；而本發明的制備方法生產的大豆淀粉酶在較寬的PH范圍內，活性穩定。圖3是330個單位(330u/g淀粉)的大豆β -淀粉酶和各濃度普羅蘭酶的差別。反應條件:pH4.562°C。圖4是330個單位(330u/g淀粉)的大麥β -淀粉酶和各濃度普羅蘭酶的差別。反應條件:pH4.562°C。圖5是在普羅藍酶添加0.5ASPU情況下，大麥β -淀粉酶和大豆β _淀粉酶生成麥芽糖的表現。圖6是在普羅藍酶添加1.0ASPU情況下，大麥β -淀粉酶和大豆β _淀粉酶生成麥芽糖的表現。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計
笪
ο除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練、人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。實施例1優選制備例I取分離水(蛋白分離后的廢水)IOOL (活性4125u/ml)，調整溫度45°C，pH3.4加入
0.P/oPAA獲得沉淀，經溶解加入IOOg碳酸鈣，中和pH6.30，經300cm2過濾器過濾，得到濾液用中孔纖維膜濃縮，配以酶穩定劑(食鹽，糊精，醋酸鈉)，精制得71.64萬u/ml成品416ml。實施例2優選制備例2
取收集分離水1500L (活性4380u/ml)，調整溫度44°C，pH3.3加入0.2%PAA獲得沉淀，加水1:5溶解，加入1.1kg碳酸鈣中和pH6.05，用Im2板框過濾得到濾液，用4寸卷式膜超濾濃縮，配以酶穩定劑(食鹽，糊精，醋酸鈉)，精制得到74.58萬u/ml成品6589ml。實施例3優選制備例3
取收集分離水IOM3 (活性4217u/ml)調整溫度44°C，中和pH3.4加入0.50%PAA獲得沉淀，經溶解加入1:5水溶解，加入IOkg碳酸鈣中和pH6.18，用8寸卷式膜超濾濃縮，經酶穩定劑(食鹽，糊精，醋酸鈉)精制后得到91.64萬u/ml成品34787ml。實施例4優選制備例4
取收集分離水1000L (4530u/ml)，采用篩選的硅藻土過濾處理，濾液用膜超慮濃縮到20倍，第一次濃縮液用聚合氯化鋁(PAC)0.03%聚凝并調整pH到4.0-6.0,使濃縮液中的蛋白及膠體物質得到沉淀，過濾去除雜質，濾液進行二次超濾，二次濃縮液經酶穩定劑(食鹽，糊精，醋酸鈉)精制得到90萬u/ml成品4836ml。實施例5大豆β-淀粉酶和大麥β-淀粉酶生成麥芽糖的性能比較
用實施例3獲得的大豆β-淀粉酶和目前中國普遍在用的大麥β-淀粉酶作比較制造麥芽糖方面的應用。所使用的普羅蘭酶(GCI 0ΡΤΙΜΑΧ L-1000)活性為1000 ASPU/g。所使用的大豆β-淀粉酶和大麥β -淀粉酶的活性相近，分別為大豆β淀粉酶705870U/ml，大麥β淀粉酶 708840u/mlo糖化試驗的條件設定如下:
基質濃度:日本淀粉 100，33%W/V濃度(DE = 11相當)/50mM冰醋酸-醋酸鈉緩沖溶液。酶的添加量:根據表I和表2的組合添加。
糖化pH溫度:大豆β -淀粉酶為ρΗ4.5，62.(TC ;大麥β -淀粉酶為ρΗ5.5，58.5°C。
糖化時間:O 48小時。
糖化目標:70%以上。按照大豆β -淀粉酶和大麥β -淀粉酶的最適合條件，就糖化能力作比較。表I中大豆β -淀粉酶在比大麥β -淀粉酶減少20%添加量時,糖化40小時后能夠同樣達到相同的糖化效果。另外由于大麥β -淀粉酶的適用pH和普羅藍酶不一致，因此對普羅藍酶有依存性(添加大于2ASPU)，而大豆β -淀粉酶和普羅藍酶的適用pH —致，因此當普羅藍酶添加到
0.75ASPU后對麥芽糖的增長作用不大了，所以生產高麥芽糖時普羅藍酶的添加量可以減少20%。這說明本發明的大豆淀粉酶生產制造麥芽糖時，成本相對較低。

注:Gl=葡萄糖，G2=麥芽糖，G3=麥芽三塘，G4=四糖。表I大豆β -淀粉酶和大麥β -淀粉酶的糖化比較試驗
權利要求
1.一種β-淀粉酶的制備方法，包括分離水收集，預處理，沉淀并溶出β-淀粉酶，其特征在于，其包括步驟:采用聚丙烯酸與溶液中的β-淀粉酶形成復合沉淀物，溶解復合沉淀物，調節PH大于等于6.0溶出β -淀粉酶，經凈化，濃縮，配以穩定劑，精制獲得高活力的β -淀粉酶。
2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，分離水收集后，調整溫度10-50°C，pH3.2_5.0 ο
3.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，加入聚丙烯酸的終濃度為0.05-5%。
4.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，溶出淀粉酶后，還包括超濾和除雜質的步驟。
5.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于，超濾采用10Κ-30Κ道爾頓分子量的有機膜、無機膜或者金屬膜進行濃縮。
6.如權利要求4所述的制備方法，其特征在于，超濾到一定倍數后，調整pH和聚凝劑使得殘余蛋白及膠體物 質沉淀。
7.如權利要求4所述的制備方法，其特征在于，超濾分二段進行，第一段對濃縮液進行聚凝處理并調整PH，使得濃縮液中非含酶物質得到沉淀；第二段對第一段獲得的產物過濾后再進行二次濃縮。
8.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于采用助濾劑進行固液分離或微孔膜進行精制和去除微生物。
9.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，采用大豆蛋白分離水作為分離水原料。
10.根據權利要求1所述的制備方法獲得的β-淀粉酶。
全文摘要
本發明涉及一種植物中的淀粉酶的分離提純方法，尤其是一種工業化生產高活力β-淀粉酶的方法。本發明的β-淀粉酶的制備方法，包括分離水收集，預處理，沉淀并溶出β-淀粉酶，采用聚丙烯酸與溶液中的β-淀粉酶形成復合沉淀物，溶解復合沉淀物，調節pH大于等于6.0溶出β-淀粉酶。本發明是一種消耗資源少，得率高(收率75%左右)，活力高(通常70-90萬u/ml)的β-淀粉酶制備方法，所得產品對溫度和酸堿度的耐受性好，應用于麥芽糖生產成本較低。
文檔編號C12N9/24GK103232982SQ201310177110
公開日2013年8月7日 申請日期2013年5月15日 優先權日2013年5月15日
發明者霍國昌, 許建中 申請人:常熟市諾科生化工程有限公司