一種制備α-淀粉酶的方法及其專用菌株與相關蛋白的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種制備α-淀粉酶的方法及其專用菌株與相關蛋白。本發明提供的菌株樟絨枝霉（Malbranchea?cinnamomea）S168，其保藏號為CGMCC?NO.6022。本發明還提供了樟絨枝霉（Malbranchea?cinnamomea）S168CGMCC?NO.6022在制備α-淀粉酶中的應用。本發明的實驗證明，本發明提供的菌株具有高產α-淀粉酶的能力，具有很好的工業化應用前景。
【專利說明】—種制備a-淀粉酶的方法及其專用菌株與相關蛋白
【技術領域】
[0001]本發明涉及食品生物【技術領域】，尤其涉及一種制備a -淀粉酶的方法及其專用菌株與相關蛋白。
【背景技術】
[0002]a -淀粉酶[EC.3.2.1.1]屬于糖苷水解酶類第13家族，作用于淀粉分子內部切開a-l，4_糖苷鍵，生成糊精和還原糖，產物的末端殘基碳原子為a構型，故稱為a-淀粉酶。a -淀粉酶是一種重要的工業用酶制劑，也是最早實現工業生產并且迄今為止用途最廣、產量最大的酶制劑品種，已廣泛應用食品、飼料、發酵以及紡織等工業中(張志國等，2005)。a-淀粉酶廣泛存在于細菌、真菌、植物以及動物等各種生物體中，自1956年首次分離a-淀粉酶的報道以來，目前已經有120多種a-淀粉酶得到了分離和鑒定。a-淀粉酶的生產主要以微生物發酵為主，生產菌株主要有不同種屬的細菌如枯草桿菌、地衣芽孢桿菌等，以及真菌如黑曲霉、米曲霉和根霉等。迄今，已有大量的細菌發酵生產a-淀粉酶的研究報道，然而，真菌發酵產a-淀粉酶的研究較少(Ashok et al，2000)。
[0003]隨著a-淀粉酶研究的不斷深入，已發現部分a-淀粉酶能同時水解多種葡聚糖及葡寡糖當中的a-l，4和a-l，6糖苷鍵，即同時具有麥芽糖淀粉酶、普魯蘭酶以及環糊精酶等多功能淀粉酶活性(Shimura et al, 2001; Yang et al, 2004; Yun et al，2004;Takeuchi et al,2006;Champreda et al，2007;Kato et al，2007;Hostinova et al，2010)，其中有少數a-淀粉酶還具有葡萄糖基轉移酶功能(Kim et al, 1992; Shimura et al, 2001; Yun et al，2004)。目前已發現和報道的多功能a -淀粉酶多數屬于耐熱酶， 因此應用于淀粉加工時也較傳統淀粉酶穩定，它們可以水解淀粉生成異麥芽低聚糖、麥芽低聚糖以及少量的葡萄糖。近來，多功能a-淀粉酶以其獨特的催化功能多樣性引起了人們的很大關注。應用多功能a-淀粉酶可以實現單酶生產，即以簡單的一步催化水解淀粉生成異麥芽低聚糖和麥芽低聚糖，而且產品中副產物較少，產品質量較高，有些產品甚至不需要純化而直接應用。因此，多功能a-淀粉酶在現代食品工業以及醫藥工業等領域中占有重要的地位，具有廣闊的應用前景。
[0004]目前，世界各國都在致力于開發多功能淀粉酶，以期待降低生產麥芽低聚糖的成本。我國淀粉資源非常豐富，而且具有分布廣、產量大、價格低等 特點。以淀粉為原料生產高質量的麥芽低聚糖有望成為我國主要的功能性、健康性糖原，但是其生產的前提是要開發出理想的多功能淀粉酶。

【發明內容】

[0005]本發明的一個目的是提供樟域枝霉(Malbranchea cinnamomea) S168。
[0006]本發明提供的樟域枝霉(Malbranchea cinnamomea) S168，其保藏號為CGMCC N0.6022。
[0007]上述的棒域枝霉(Malbrancheacinnamomea) S168 CGMCC N0.6022 在制備 ct -淀粉酶中的應用也是本發明保護的范圍。
[0008]本發明的另一個目的是提供一種制備a-淀粉酶的方法。
[0009]本發明提供的方法，包括如下步驟:發酵上述的樟絨枝霉(Malbranchea cinnamomea) S168 CGMCC N0.6022，收集發酵產物，即得到a-淀粉酶。
[0010]上述方法中，所述發酵溫度為30-45° C，所述發酵時間為3-5天，所述發酵為 180-220rpm震蕩培養。
[0011]上述發酵培養基的配方如下:糯米粉35.0g，蛋白胨12.0g，酵母提取物 24.0g, KH2PO4 1.0g, MgSO4 ? 7H20 0.5g, FeSO4 ? 7H20 0.01g, NaCl 0.5g, CaCl2 0.2g, MnSO4 ? 7H20 0.05g，用水定容至 IL0
[0012]本發明的第三個目的是提供一種蛋白。
[0013]本發明提供的蛋白，來源于樟絨枝霉(Malbranchea cinnamomea)S168,是如下(a) 或(b):
[0014](a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；
[0015](b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/ 或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列2衍生的蛋白質。
[0016]上述蛋白中，一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加 。
[0017]編碼上述蛋白的基因也是本發明保護的范圍。
[0018]上述基因是如下(I)- (4)中任一所示的DNA分子:
[0019](I)序列表中序列3所示的DNA分子；
[0020](2)序列表中序列4所示的DNA分子；
[0021 ] (3)在嚴格條件下與(I)或(2)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同功能蛋白的 DNA分子；
[0022](4)與(I)或(2)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼具有相同功能蛋白的DNA分子。
[0023]上述嚴格條件為在6XSSC，0.5%SDS的溶液中，在65° C下雜交，然后用 2 X SSC, 0.1% SDS 和 I X SSC, 0.1% SDS 各洗膜一次。
[0024]含有上述基因的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌也是本發明保護的范圍。
[0025]上述蛋白在作為a-淀粉酶中的應用也是本發明保護的范圍。
[0026]菌株樟絨枝霉S168已于2012年4月19日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所)，保藏登記號為N0.6022,分類命名為樟絨枝霉(Malbranchea cinnamomea)。
[0027]本發明的實驗證明，本發明提供的菌株具有高產a-淀粉酶的能力，通過硫酸銨沉淀及弱陰離子層析得到55.4%回收率的高純度a-淀粉酶，水解特性分析表明此a-淀粉酶具有廣泛的底物特異性，可以用于水解淀粉高效生產低聚麥芽糖，具有較好的工業應用前景，本發明還提供了該a-淀粉酶的編碼基因及其對應的氨基酸序列，為基因重組表達a-淀粉酶奠定了基礎?！緦＠綀D】

【附圖說明】[0028]圖1為菌株菌落形態(A)及顯微鏡下產孢形態(B)[0029]圖2為樟絨枝霉液體發酵產a-淀粉酶的產酶歷程圖[0030]圖3為樟絨枝霉產a-淀粉酶的純化過程電泳圖[0031]圖4為所純化a -淀粉酶的最適pH[0032]圖5為所純化a -淀粉酶的pH穩定性[0033]圖6為所純化a-淀粉酶的最適溫度[0034]圖7為所純化a-淀粉酶的溫度穩定性[0035]圖8為所純化a-淀粉酶水解直鏈淀粉、可溶性淀粉、支鏈淀粉、普魯蘭糖和
Y-環糊精及麥芽寡糖的水解進程圖【具體實施方式】
[0036]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0037]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0038]下述實施例所述引物的合成及測序工作均由上海生工生物工程有限公司(北京公司)完成。
[0039]下述實施例的主要原料及試劑:葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、潘糖、普魯蘭糖、環糊精、直鏈淀粉和可溶性淀粉(底物)均購自Sigma公司；酵母提取物和胰蛋白胨購自英國Oxoid公司；瓊脂和可溶性淀粉(培養基)購自北京康明威培養基技術有限責任公司； KH2PO4, MgSO4.7H20、CaCl2, NaOH、苯酚、MnSO4, CuSO4.5H20以及酒石酸鉀鈉等購自北京化工廠；3，5- 二硝基水楊酸購自上海遠帆制劑廠。
[0040]實施例1、菌株的分離和鑒定
[0041]一、菌株的分離
[0042]本發明提供的樟絨枝霉S168是從陜西西安樹林土壤中篩選得到的。
[0043]初篩培養基:淀粉高滲培養基(YpSs):可溶性淀粉15g，酵母提取物4g，K2HPO4Ig, MgSO4 ? 7H20 0.5g，瓊脂 20g，定容至 1L，調節 pH 至 7.0。I X IO5Pa 下濕熱滅菌 20min。
[0044]發酵培養基:糯米粉(中山市小欖永寧糧油綜合加工廠，Q/WG 0002 S-2010) 15.0g，蛋白胨 8.0g，酵母提取物 8.0g，KH2PO4 1.0g, MgSO4 ? 7H20 0.5g，FeSO4 ? 7H20 0.01g, NaCl 0.5g, CaCl2 0.2g，MnSO4 ? 7H20 0.05g，用水定容至 1L。I X IO5Pa 下濕熱滅菌 20min。
[0045]取新鮮土樣稀釋后涂布于分離培養基平板上，在50° C恒溫培養箱中培養。待分離培養基中有菌落長出，將菌株接種到初篩培養基中，凡在菌落周圍能使培養基形成透明圈的菌株，接種到發酵培養基中培養。培養條件為:50° C，200rpm，培養36h。發酵結束后取ImL發酵液于1.5mL離心管中，離心(10000Xg, IOmin),取上清測定a_淀粉酶酶活力。 選取酶活力較高的菌株S168作為出發菌株進行后續研究。
[0046]酶活力測定方法:a -淀粉酶酶活力測定為100 U L適當稀釋的酶液(上清)加入到
100u L濃度為lOgL—1的可溶性淀粉溶液(用50mM pH 6.5MES緩沖液配置)中，65° C水浴反應10min后米用 DNS法(Miller GL(1959)Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugars.Anal Chem 31:426-428)測定產生的還原糖量，以葡萄糖為標準。酶活力單位(U)定義為在以上條件下，每分鐘反應生成I y mol葡萄糖所需要的酶量。
[0047]二、菌株的鑒定
[0048]1、形態學觀察
[0049]將上述菌株S168在淀粉高滲平板培養基上培育，觀察菌株生長情況如下:生長良好，最適生長溫度為45° C。菌落鋪展生長，初黃色，漸變粉紅色與桔黃色交替環生，后中央深赭棕色，邊緣亮硫磺色，粉狀(圖W。采用顯微鏡觀察，發現菌絲初無色后變黃，粗壯菌絲近隔膜基部有明顯隆起，從頂端到基部依次形成緊密、規則的隔膜，無分化的分生孢子梗；產孢菌絲體生式產孢，厚壁分生(節)孢子和薄壁細胞(腰)相互間插鏈生；薄壁細胞易萎焉、衰退，分生孢子鏈斷裂，形成黃色粉狀孢子堆，分生孢子淡黃至黃色，脫落后兩端有明顯的菌絲外壁殘留物，短圓柱狀，常輕微彎曲(圖1B)。
[0050]2、18SrDNA 的鑒定
[0051]使用18S rDNA 通用引物 NSl:GTAGTCATATGCTTGTCTC, NS8: TCCGCAGGTTCACCTACGGA,以樟絨枝霉S168的總DNA為模板，PCR擴增18SrDNA序列。目標片段經凝膠回收后測序。測序獲得可靠序列1745bp (序列I)。將測序獲得的基因序列再 NCBI數據庫中進行比對，依據相似度高低并結合菌株形態對其進行初步鑒定綜合以上特征，結合該真菌18S rDNA測序結果，證實本發明得到的菌株S168為樟絨枝霉。
[0052]菌株樟絨枝霉S168已于2012年4月19日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所)，保藏登記號為N0.6022,分類命名為樟絨枝霉(Malbranchea cinnamomea)。
[0053]實施例2、棒續枝霉(Malbranchea cinnamomea) S168 CGMCC N0.6022 在制備 a-淀粉酶中的應用
[0054]一、a-淀粉酶的獲得
[0055]1、發酵
[0056]將由實施例1 得到的樟絨枝霉(Malbranchea cinnamomea) S168 CGMCC N0.6022 進行液體發酵培養，并對發酵培養基做了單因素優化，具體如下:
[0057]最優的發酵培養基:糯米粉35.0g，蛋白胨12.0g，酵母提取物24.0g，KH2PO4 1.0g, MgSO4 ? 7H20 0.5g, FeSO4 ? 7H20 0.01g, NaCl 0.5g, CaCl2 0.2g, MnSO4 ? 7H20 0.05g，用水定容至 IL0 I X IO5Pa 下濕熱滅菌 20min, pH 6.5。
[0058]在上述最優的發酵培養基中在35° C、200rpm震蕩培養5d，收集發酵產物，將發酵產物1000OXg冷凍離心lOmin，收集上清液進行a -淀粉酶的酶活力檢測(檢測方法同實施例I的一中的酶活力測定方法)，結果為上清液的a-淀粉酶的酶活力最高達到308.3U ml/ 1 (DNS 法)(圖 2)。
[0059]將發酵3d的發酵產物10000 X g冷凍離心IOmin,收集上清液做進一步純化用。
[0060]2、a-淀粉酶的純化與鑒定
[0061]I) a-淀粉酶的純化
[0062](I)硫酸銨沉淀
[0063]向上述I得到的上清液中緩慢加入60%飽和度的硫酸粉末，冰水浴中攪拌lh，然后 10000 X g冷凍離心lOmin，取上清液繼續添加硫酸銨粉末至酶液達到80%硫酸銨飽和度，冰水浴中攪拌lh，1000OXg冷凍離心lOmin，收集沉淀，將沉淀用少量20mMpH 8.0 Tris-HCl 緩沖液溶解，得到硫酸銨沉淀產物。
[0064](2)DEAE52 柱純化
[0065]將上述得到的硫酸銨沉淀產物用20mM pH 8.0Tris-HCl緩沖液透析，過DEAE52 弱陰離子交換柱(Whatman)，流速為l.0mL mirT1 (前后均一致)，用200mM NaCl溶液梯度洗脫雜蛋白，用300mM NaCl溶液梯度洗脫，收集5個柱體積的洗脫液為a -淀粉酶組分， 得到純化產物。檢測純化產物的酶活，酶活力測定方法同實施例1，采用Lowry法(Lowery OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ(1951)Proteinmeasurement with the folin phenol reagent.J Biol Chem 193:265-275)測定蛋白質含量。
[0066]結果如表1所示:(表中的比酶活=總酶活/總蛋白)
[0067]表1 a -淀粉酶的純化過程
[0068]
【權利要求】
1.棒續枝霉(Malbrancheacinnamomea) S168,其保藏號為 CGMCC N0.6022。
2.權利要求1所述的樟絨枝霉(Malbrancheacinnamomea) S168在制備a -淀粉酶中的應用。
3.一種制備a-淀粉酶的方法，包括如下步驟:發酵權利要求1所述的樟絨枝霉 (Malbranchea cinnamomea) S 168，收集發酵產物，即得到a -淀粉酶。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于:所述發酵溫度為30-45° C，所述發酵時間為3-5天，所述發酵為180-220rpm震蕩培養。
5.一種蛋白，是如下(a)或 (b):Ca)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列2衍生的蛋白質。
6.編碼權利要求5所述蛋白的基因。
7.根據權利要求6所述的基因，其特征在于:所述基因是如下(1)-(4)中任一所示的 DNA分子:(1)序列表中序列3所示的DNA分子；(2)序列表中序列4所示的DNA分子；(3)在嚴格條件下與(I)或(2)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同功能蛋白的DNA 分子;(4)與(I)或(2)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有 99%同源性且編碼具有相同功能蛋白的DNA分子。
8.含有權利要求6或7所述基因的重組載體、表達盒。
9.權利要求5所述蛋白在作 為a-淀粉酶中的應用。
【文檔編號】C12R1/645GK103509720SQ201210210022
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2012年6月19日 優先權日:2012年6月19日
【發明者】江正強, 韓鵬, 楊紹青, 閆巧娟, 周鵬 申請人:中國農業大學