豬流行性腹瀉病毒rt-pcr鑒別診斷試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)一種豬流行性腹瀉病毒RT-PCR鑒別診斷試劑盒，所述試劑盒包含：針對(duì)PEDV弱毒疫苗株ORF3基因第245～294位核苷酸序列缺失區(qū)設(shè)計(jì)的一對(duì)引物，該對(duì)引物的上下游引物分別位于所述ORF3基因缺失區(qū)兩端的保守區(qū)。本發(fā)明基于ORF3基因的豬流行性腹瀉病毒RT-PCR鑒別診斷試劑盒，具有特異性強(qiáng)、靈敏性高的特點(diǎn)，不僅能快速檢測(cè)出仔豬腹瀉腹瀉樣品中是否存在PEDV，而且還能快速、準(zhǔn)確地區(qū)分自然感染野毒株和弱毒疫苗毒株，對(duì)于豬流行性腹瀉病的早期快速診斷和防控具有重要意義。
【專利說(shuō)明】豬流行性腹瀉病毒RT-PCR鑒別診斷試劑盒及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及豬流行性腹瀉病毒感染檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種豬流行性腹瀉病 毒RT-PCR鑒別診斷試劑盒及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 豬流行性腹瀉病（Porcine epidemic diarrhea, PED)在歐洲和亞洲一些養(yǎng)豬業(yè) 發(fā)達(dá)的國(guó)家都曾有相關(guān)報(bào)道，是一種危害較為嚴(yán)重的傳染病。最近兩年來(lái)在我國(guó)部分養(yǎng)豬 場(chǎng)再度爆發(fā)了以未斷奶仔豬發(fā)生水樣腹瀉、嘔吐和高死亡率為特征仔豬腹瀉疫情，該病以 7日齡內(nèi)仔豬發(fā)病為主，病程急、傳播迅速、仔豬死亡率高，而且在同一豬場(chǎng)易呈反復(fù)發(fā)作， 曾一度造成部分豬場(chǎng)出現(xiàn)階段性產(chǎn)房無(wú)仔的嚴(yán)重局面，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了重大的經(jīng)濟(jì)損失。 在對(duì)發(fā)生仔豬腹瀉疫情的臨床樣品檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)豬流行性腹瀉病毒（PEDV)的陽(yáng)性檢出率很 高，推測(cè)PEDV是此次腹瀉疫情主要病因之一。疫苗免疫是控制疫情的首選，韓國(guó)、日本等已 經(jīng)將弱毒疫苗用于該病的預(yù)防控制，國(guó)內(nèi)也有一些豬場(chǎng)在使用弱毒疫苗，在臨床上如何區(qū) 分疫苗免疫與自然感染毒株，對(duì)仔豬腹瀉疫情進(jìn)行有效地預(yù)警具有重要意義。
[0003] 對(duì)于PEDV感染的診斷方法已有多種，如對(duì)采集的臨床樣品進(jìn)行處理后，利用病毒 適應(yīng)性細(xì)胞進(jìn)行病毒分離的方法；利用免疫膠體金試紙條直接檢測(cè)樣品中的病毒抗原；根 據(jù)PEDV病毒的保守性內(nèi)部基因設(shè)計(jì)引物，利用RT-PCR的方法對(duì)病毒的基因進(jìn)行檢測(cè)等方 法。其中，病毒分離不僅耗時(shí)耗力，而且由于該病毒的特性難于細(xì)胞上進(jìn)行分離培養(yǎng)，因此 不利于對(duì)疫情的及時(shí)診斷，后兩種方法可以實(shí)現(xiàn)對(duì)病毒的及時(shí)、快速診斷，但是卻不能很好 的滿足對(duì)自然感染與疫苗免疫毒株進(jìn)行鑒別診斷的需求。PEDV的0RF3基因位于S基因與 E基因之間，有研究認(rèn)為冠狀病毒0RF3編碼的輔助蛋白具有離子通道的特性與病毒的釋放 有關(guān)，0RF3基因沉默可以降低病毒在Vero細(xì)胞上的滴度。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決目前診斷PEDV感染的方法，不能實(shí)現(xiàn)對(duì)自然感染與疫苗免疫毒株 進(jìn)行鑒別診斷的技術(shù)問(wèn)題，提供一種豬流行性腹瀉病毒RT-PCR鑒別診斷試劑盒，該試劑盒 特異性強(qiáng)、靈敏性高，可快速、準(zhǔn)確地區(qū)分自然感染的野毒和弱毒疫苗免疫毒株，對(duì)于豬流 行性腹瀉病毒疫情的早期快速診斷、防控、以及流行病學(xué)的全面監(jiān)測(cè)具有重要意義。
[0005] 為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0006] 在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種一種豬流行性腹瀉病毒RT-PCR鑒別診斷試劑 盒，所述試劑盒包含：
[0007] 針對(duì)PEDV弱毒疫苗株0RF3基因第245?294位核苷酸序列缺失區(qū)設(shè)計(jì)的一對(duì)引 物，該對(duì)引物的上下游引物分別位于所述0RF3基因缺失區(qū)兩端的保守區(qū)。
[0008] 優(yōu)選的，所述上下游引物的序列如SEQ ID N0 :3和SEQ ID N0 :4所示。
[0009] 更優(yōu)選的，所述引物的使用濃度為25mmol/L。
[0010] 所述試劑盒還包含：〇RF3基因第245?294位核苷酸序列沒(méi)有發(fā)生缺失的PEDV野 毒株對(duì)照。
[0011] 所述試劑盒還包含：〇RF3基因第245?294位核苷酸序列發(fā)生缺失的PEDV弱毒 疫苗株對(duì)照。
[0012] 所述試劑盒還包含：RT-PCR反應(yīng)緩沖液、反轉(zhuǎn)錄酶、聚合酶。
[0013] 優(yōu)選的，所述試劑盒用于檢測(cè)樣品時(shí)的PCR退火溫度為50°C。
[0014] 在本發(fā)明的另一方面，還提供了上述豬流行性腹瀉病毒RT-PCR鑒別診斷試劑盒 在制備診斷豬流行性腹瀉病的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
[0015] 在本發(fā)明的另一方面，還提供了上述豬流行性腹瀉病毒RT-PCR鑒別診斷試劑盒 在制備區(qū)分PEDV弱毒疫苗株與自然感染野毒株的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
[0016] 本發(fā)明基于PEDV 0RF3基因的豬流行性腹瀉病毒RT-PCR鑒別診斷試劑盒，具有特 異性強(qiáng)、靈敏性高的特點(diǎn)，不僅能快速檢測(cè)出仔豬腹瀉腹瀉樣品中是否存在PEDV，而且還能 快速、準(zhǔn)確地區(qū)分自然感染野毒株和弱毒疫苗免疫毒株，可應(yīng)用于豬流行性腹瀉病的臨床 診斷、分子流行病學(xué)調(diào)查等方面，對(duì)于豬流行性腹瀉病的早期快速診斷和防控具有重要意 義。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0017] 下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。
[0018] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例1的PEDV流行毒株0RF3基因缺失區(qū)域核苷酸序列比較圖；
[0019] 圖2是本發(fā)明實(shí)施例1的基于0RF3基因序列建立的進(jìn)化樹(shù)圖；
[0020] 圖3是本發(fā)明實(shí)施例2確定RT-PCR最佳Tm值的結(jié)果圖；
[0021] 圖4是本發(fā)明實(shí)施例2確定RT-PCR最佳引物濃度的結(jié)果圖；
[0022] 圖5是本發(fā)明實(shí)施例3的RT-PCR特異性試驗(yàn)結(jié)果圖；
[0023] 圖6是本發(fā)明實(shí)施例4的RT-PCR方法敏感性鑒定結(jié)果圖；
[0024] 圖7是本發(fā)明實(shí)施例5臨床樣品的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果圖。

【具體實(shí)施方式】
[0025] 下列實(shí)施例中，未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按常規(guī)條件，如《分子克隆實(shí)驗(yàn) 指南》（薩姆布魯克J，拉塞爾D W，著，黃培堂，汪嘉璽，朱厚礎(chǔ)，等譯.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南， 第3版，北京：科學(xué)出版社，2002)中所述的方法進(jìn)行。
[0026] 為了建立一種在臨床上便于區(qū)分豬流行性腹瀉病毒（PEDV)自然感染與疫苗免疫 毒株的方法。本發(fā)明根據(jù)目前使用的PEDV弱毒疫苗均為0RF3基因存在缺失的毒株，而能 引起自然感染發(fā)病的毒株0RF3基因沒(méi)有發(fā)生缺失，研發(fā)出一種基于0RF3基因缺失區(qū)域的 豬流行性腹瀉病毒RT-PCR鑒別診斷方法與試劑盒。本發(fā)明根據(jù)GenBank公布的PEDV 0RF3 基因序列，在其存在基因缺失區(qū)兩端的保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物，對(duì)近兩年采集的仔豬腹 瀉樣品進(jìn)行檢測(cè)，分析流行毒株的0RF3基因，選擇部分陽(yáng)性樣品利用鑒定引物進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增，優(yōu)化其反應(yīng)體系、Tm值等條件，進(jìn)行鑒別診斷方法的特異性、敏感性試驗(yàn)，并對(duì)大量臨 床樣品進(jìn)行檢測(cè)驗(yàn)證。結(jié)果是，從新發(fā)仔豬腹瀉臨床樣品中克隆獲得了 11株P(guān)EDV的0RF3 基因，序列分析顯示新分離的9株0RF3基因不存在缺失，屬于自然感染野毒，其與疫苗株的 核苷酸同源性為95. 8%?97. 1%。建立的鑒別診斷方法可以特異性擴(kuò)增PEDV的0RF3基 因，其中獲得的PEDV自然感染毒株基因片段大小約300bp，而弱毒疫苗株則為250bp左右； 該鑒別診斷方法與其他豬源病毒無(wú)交叉擴(kuò)增，其敏感性可達(dá)到l〇〇TCID5(l/0. lmL，對(duì)仔豬腹 瀉臨床樣品檢測(cè)結(jié)果顯示，PEDV自然感染的陽(yáng)性率為65.4%。因此，本發(fā)明基于PEDV0RF3 基因的RT-PCR鑒別診斷方法和試劑盒，可以用于區(qū)分自然感染的野毒和弱毒疫苗免疫毒 株，為PEDV的疫情診斷和流行病學(xué)監(jiān)測(cè)提供了一種特異、快速、實(shí)用的檢測(cè)方法和檢測(cè)試 劑盒。
[0027] 下面通過(guò)具體實(shí)施例闡述本發(fā)明。
[0028] 材料：
[0029] 1.毒株與樣品來(lái)源
[0030] PEDV毒株HLJ-1株和ZJCZ4株以及豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV HuN4株）、 豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV)、豬輪狀病毒（PoRV)、豬瘟病毒（CFSV)由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海 獸醫(yī)研究所豬傳染病研究室分離保存，11份已知PEDV陽(yáng)性仔豬腹瀉樣品由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué) 院上海獸醫(yī)研究所豬傳染病研究室鑒定并保存，26份未知仔豬腹瀉樣品2013年初采集自 上海。
[0031] 2.主要試劑
[0032] Taq DNA 聚合酶、DNA Marker、dNTP、pMD18-T 載體購(gòu)自 TaKaRa 公司；RNA 提取試 劑盒 RNeasy Plus Mini Kit 購(gòu)自 QIAGEN 公司；單鏈 cDNA 合成試劑盒 RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit購(gòu)自Fermentas公司；感受態(tài)菌種DH5a由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 上海獸醫(yī)研究所豬傳染病研究室保存。
[0033] 實(shí)施例1仔豬腹瀉樣品的檢測(cè)與流行毒株0RF3基因序列的分析
[0034] (1)引物設(shè)計(jì)
[0035] 根據(jù)PEDV ZJCZ-4(GenBank序列號(hào)JX524137)設(shè)計(jì)并合成一對(duì)擴(kuò)增0RF3全基 因引物 0RF3-P1/0RF3-P2。參考 PEDV CV777(GenBank 序列號(hào)：AF353511)、ZJCZ-4 及疫 苗株DR13 (GenBank序列號(hào)：EU054930)的0RF3基因序列，設(shè)計(jì)并合成了 一對(duì)鑒定引物 0RF3-JD1/0RF3-JD2,鑒定引物位于0RF3缺失區(qū)（245nt?294nt)兩端的保守區(qū)，其擴(kuò)增范 圍覆蓋整個(gè)缺失區(qū)域。以上兩對(duì)引物如表1所示，所有引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司 合成。
[0036] 表1擴(kuò)增PEDV 0RF3基因引物及鑒定引物
[0037]

【權(quán)利要求】
1. 一種豬流行性腹瀉病毒RT-PCR鑒別診斷試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含： 針對(duì)PEDV弱毒疫苗株0RF3基因第245?294位核苷酸序列缺失區(qū)設(shè)計(jì)的一對(duì)引物， 該對(duì)引物的上下游引物分別位于所述0RF3基因缺失區(qū)兩端的保守區(qū)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬流行性腹瀉病毒RT-PCR鑒別診斷試劑盒，其特征在于，所 述上下游引物的序列如SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4所示。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬流行性腹瀉病毒RT-PCR鑒別診斷試劑盒，其特征在于，所 述試劑盒還包含：〇RF3基因第245?294位核苷酸序列沒(méi)有發(fā)生缺失的PEDV野毒株對(duì)照。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬流行性腹瀉病毒RT-PCR鑒別診斷試劑盒，其特征在于，所 述試劑盒還包含：〇RF3基因第245?294位核苷酸序列發(fā)生缺失的PEDV弱毒疫苗株對(duì)照。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬流行性腹瀉病毒RT-PCR鑒別診斷試劑盒，其特征在于，所 述試劑盒還包含：RT-PCR反應(yīng)緩沖液、反轉(zhuǎn)錄酶、聚合酶。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的豬流行性腹瀉病毒RT-PCR鑒別診斷試劑盒，其特征在于，所 述引物的使用濃度為25mmol/L。
7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的豬流行性腹瀉病毒RT-PCR鑒別診斷試劑盒，其特征在于，所 述試劑盒用于檢測(cè)樣品時(shí)的PCR退火溫度為50°C。
8. 權(quán)利要求1所述的豬流行性腹瀉病毒RT-PCR鑒別診斷試劑盒在制備診斷豬流行性 腹瀉病的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
9. 權(quán)利要求1所述的豬流行性腹瀉病毒RT-PCR鑒別診斷試劑盒在制備區(qū)分PEDV弱毒 疫苗株與自然感染野毒株的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12Q1/70GK104152578SQ201310217682
【公開(kāi)日】2014年11月19日 申請(qǐng)日期:2013年6月3日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月3日
【發(fā)明者】童光志, 周艷君, 吳玉璐 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所