輔助鑒定h9亞型禽流感病毒的引物對及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種輔助鑒定H9亞型禽流感病毒的引物對及其應用。本發明保護的特異引物對由序列表的序列1所示單鏈DNA分子和序列表的序列2所示單鏈DNA分子組成。本發明還保護所述特異引物對在制備輔助鑒定H9亞型禽流感病毒的試劑盒中的應用。本發明還保護所述特異引物對在制備輔助鑒定待測樣本中是否含有H9亞型禽流感病毒的試劑盒中的應用。采用本發明提供的特異引物對輔助鑒定H9亞型禽流感病毒，具有靈敏度高、特異性強、普適性強、所需時間短、成本低等優點，可以對多種臨床樣本進行檢測，操作簡單、容易推廣，便于基層操作和應用。本發明對于H9亞型禽流感病毒的臨床診斷和流行病控制具有重大價值。
【專利說明】輔助鑒定H9亞型禽流感病毒的引物對及其應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種輔助鑒定H9亞型禽流感病毒的引物對及其應用。

【背景技術】
[0002] H9亞型禽流感是目前危害我國養禽業的主要疫病。H9亞型禽流感病毒可以感染 多種禽和哺乳動物，并可導致禽類發病死亡，嚴重影響養禽業的健康發展。H9亞型禽流感感 染導致肉雞生長緩慢和蛋雞產蛋率下降，給養禽業造成嚴重的經濟損失。雖然我國已全面 采取免疫措施，但H9亞型禽流感仍然在雞群中反復發生。
[0003] 對于傳統的檢測方法，如病毒分離、血凝抑制試驗、神經氨酸酶抑制試驗等，費時、 費力。采用雞胚進行病毒分離培養(需時2-3天)，然后采用血凝抑制試驗進行流感病毒亞 型的鑒定（需時1天)，難以做出快速而及時的診斷。此外，H9亞型禽流感病毒基因和抗原 特性的變異，導致常規血清學方法及分子生物學監測方法無法檢出流行毒株。因此，建立一 種快速有效的鑒別流行毒株的診斷方法，對于及時采取有效控制措施和防止疫情擴散具有 重要的意義。


【發明內容】

[0004] 本發明的目的是提供一種輔助鑒定H9亞型禽流感病毒的引物對及其應用。
[0005] 本發明保護特異引物對甲和特異引物對乙。
[0006] 所述特異引物對甲由序列表的序列1所示單鏈DNA分子和序列表的序列2所示單 鏈DNA分子組成。
[0007] 所述特異引物對乙由與序列表的序列1所示單鏈DNA分子反向互補的單鏈DNA分 子和與序列表的序列2所示單鏈DNA分子反向互補的單鏈DNA分子組成。
[0008] 本發明還保護所述特異引物對甲或所述特異引物對乙在制備輔助鑒定H9亞型禽 流感病毒的試劑盒中的應用。所述H9亞型禽流感病毒具體可為H9N2亞型禽流感病毒。
[0009] 本發明還保護一種輔助鑒定H9亞型禽流感病毒的試劑盒，包括所述特異引物對 甲或所述特異引物對乙。所述H9亞型禽流感病毒具體可為H9N2亞型禽流感病毒。
[0010] 本發明還保護所述特異引物對甲或所述特異引物對乙在制備輔助鑒定待測樣本 中是否含有H9亞型禽流感病毒的試劑盒中的應用。所述H9亞型禽流感病毒具體可為H9N2 亞型禽流感病毒。所述待測樣本可為雞的肝、腦、肺等組織，也可為雞的口腔拭子、泄殖腔拭 子等拭子樣品。所述待測樣本還可為食品，所述食品為雞的內臟組織(肝、腦、肺等）或雞的 內臟組織(肝、腦、肺等）加工得到的生鮮食品或熟食。
[0011] 本發明還保護一種輔助鑒定待測樣本中是否含有H9亞型禽流感病毒的試劑盒， 包括所述特異引物對甲或所述特異引物對乙。所述H9亞型禽流感病毒具體可為H9N2亞型 禽流感病毒。所述待測樣本可為雞的肝、腦、肺等組織，也可為雞的口腔拭子、泄殖腔拭子等 拭子樣品。所述待測樣本還可為食品，所述食品為雞的內臟組織(肝、腦、肺等）或雞的內臟 組織(肝、腦、肺等）加工得到的生鮮食品或熟食。
[0012] 本發明還保護所述特異引物對甲或所述特異引物對乙在輔助鑒定H9亞型禽流感 病毒中的應用。所述H9亞型禽流感病毒具體可為H9N2亞型禽流感病毒。所述應用中不包 括疾病治療和診斷方法。
[0013] 本發明還保護一種輔助鑒定H9亞型禽流感病毒的方法，包括如下步驟：以待測病 毒的cDNA為模板，用所述特異引物對甲或所述特異引物對乙進行PCR擴增，如果得到PCR 擴增產物、待測病毒為候選的H9亞型禽流感病毒，如果沒有得到所述PCR擴增產物、待測病 毒為候選的非H9亞型禽流感病毒。所述H9亞型禽流感病毒具體可為H9N2亞型禽流感病 毒。所述PCR擴增產物的大小可為400-500bp，具體可為473bp。所述待測病毒可為H9N2 亞型禽流感病毒、雞傳染性支氣管炎病毒、H4N6亞型禽流感病毒、H3N8亞型禽流感病毒、傳 染性喉氣管炎病毒、減蛋綜合癥病毒或新城疫病毒。所述方法為非疾病治療和診斷方法。
[0014] 本發明還保護所述特異引物對甲或所述特異引物對乙在輔助鑒定待測樣本中是 否含有H9亞型禽流感病毒中的應用。所述H9亞型禽流感病毒具體可為H9N2亞型禽流感 病毒。所述待測樣本可為死亡的雞的肝、腦、肺等組織，也可為死亡的雞的口腔拭子、泄殖腔 拭子等拭子樣品。所述待測樣本還可為食品，所述食品為雞的內臟組織(肝、腦、肺等）或雞 的內臟組織(肝、腦、肺等)加工得到的生鮮食品或熟食。所述應用中不包括疾病治療和診斷 方法。
[0015] 本發明還保護一種輔助鑒定待測樣本中是否含有H9亞型禽流感病毒的方法，包 括如下步驟：以待測樣本的cDNA為模板，用所述特異引物對甲或所述特異引物對乙進行 PCR擴增，如果得到PCR擴增產物、待測樣本疑似含有H9亞型禽流感病毒，如果沒有得到所 述PCR擴增產物、待測樣本疑似不含有H9亞型禽流感病毒。所述H9亞型禽流感病毒具體 可為H9N2亞型禽流感病毒。所述PCR擴增產物的大小為400-500bp，具體可為473bp。所 述待測樣本可為死亡的雞的肝、腦、肺等組織，也可為死亡的雞的口腔拭子、泄殖腔拭子等 拭子樣品。所述待測樣本還可為食品，所述食品為雞的內臟組織(肝、腦、肺等）或雞的內臟 組織(肝、腦、肺等）加工得到的生鮮食品或熟食。所述方法為非疾病治療和診斷方法。
[0016] 采用本發明提供的特異引物對和方法輔助鑒定H9亞型禽流感病毒，具有靈敏度 高、特異性強、普適性強、所需時間短、成本低等優點，可以對多種臨床樣本(如臨床采集的 樣品如口腔拭子、泄殖腔拭子，病毒尿囊液等）進行檢測，操作簡單、容易推廣，便于基層操 作和應用。本發明對于H9亞型禽流感病毒的臨床診斷和流行病控制具有重大價值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017] 圖1為特異性實驗的結果。
[0018] 圖2為靈敏度實驗的結果。
[0019] 圖3為普適性實驗的結果。

【具體實施方式】
[0020] 以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平 均值。以下實施例中，用于提取總RNA的試劑盒為Viral genome RNA rapid extraction Kit (名稱：QIAamp Viral RNA Mini Kit)，廠家QIAGEN，貨號52904。以下實施例中，用于 將總 RNA 反轉錄為 cDNA 的試劑盒為 The reverse transcription(RT)reaction (名稱： RevertAid? First Strand cDNA Synthesis Kit)，廠家 Fermentas，貨號 K1622〇
[0021] H9N2 亞型禽流感病毒（H9N2influenza viruses):參考文獻：Yipeng Sun，Juan Pu, Zhanlei Jiang，Tao Guan, Yingju Xia，Qi Xu，Linqing Liu, Bo Ma, Fulin Tian, E. G. Brown, Jinhua Liu. Genotypic evolution and antigenic drift of H9N2influenza viruses in China froml994to2008, Veterinary Microbiologyl46(2010)215 - 225〇
[0022] 雞傳染性支氣管炎病毒（Avian Infectious Bronchitis Virus):參考文獻： Jinling Feng,Yanxin Hu，Zhijun Ma，Qi Yu,Jixun Zhao, Xiaodong Liu,and Guozhong Zhang. Virulent Avian Infectious Bronchitis Virus，People' s Republic of China. Emerging Infectious Diseases. Vol. 18,No. 12,December2012〇
[0023] H4N6亞型禽流感病毒：參考文獻：李昀海，趙煥云，張文東，呂粵，岳亮，宋建領，范 泉水，張應國，張富強.云南2株H4N6亞型禽流感病毒株的分離與鑒定畜牧與獸醫2011 年第43卷第6期。
[0024] H3N8 亞型禽流感病毒（H3N8influenza viruses):參考文獻：Juan Pu，Qin-Fang Liu,Ying-Ju Xia, Yu-Lei Fan, Earl G.Brown, Fu-Lin Tian,Jin-Hua Liu.Genetic analysis of H3subtype influenza viruses isolated from domestic ducks in northern China during2004 - 2005Virus Genes (2009)38:136 - 142〇
[0025] 傳染性喉氣管炎病毒：參考文獻：謝菲，郝滿良，王蔚宇，路衛星，王慎行，雞傳染 性喉氣管炎人工模擬自然感染模型的建立，黑龍江畜牧獸醫，2008年第5期。
[0026] 減蛋綜合癥病毒：參考文獻：劉吉山，沈志強，王艷，李書光，肖躍強，喬建光， 減蛋綜合癥在櫻桃鴨父母代中的流行病學調查.山東畜牧獸醫.2010年第31期（總第166 期）。
[0027] 新城疫病毒：參考文獻：張鶴曉，賴平安，高志強1，劉環，劉繼紅，郭晉優，谷 強，張利峰，楊偉，李寧，熒光RT-PCR檢測活禽和禽產品中新城疫病毒中強毒株的研究， 中國獸醫雜志，2006年（第42卷）第3期。
[0028] 實施例1、特異引物對的設計
[0029] 設計一對用于鑒定H9亞型禽流感病毒的HA基因的引物對如下：
[0030] H9-HA99F (序列表的序列 1) :5'-CATCGGCTACCAATCAACAAAC-3' ；
[0031] H9-HA571R (序列表的序列 2) :5' -GATTATTTGTGTATTGGGCGTC-3'。
[0032] 實施例2、特異引物對的特異性檢測
[0033] 實驗樣本分別為：H9N2亞型禽流感病毒、雞傳染性支氣管炎病毒、H4N6亞型禽流 感病毒、H3N8亞型禽流感病毒、傳染性喉氣管炎病毒、減蛋綜合癥病毒和新城疫病毒。
[0034] 一、提取各個待測樣本（即病毒濃度為106 5EID5(I/100 μ L的病毒液）的總RNA并反 轉錄為cDNA。
[0035] 二、引物對的特異性
[0036] 1、以步驟一得到的cDNA為模板，用實施例1的特異引物對進行PCR擴增，得到PCR 擴增產物。
[0037] PCR 擴增的反應體系（25μ 1) :2XMix Bufferl2. 5μ 1、H9-HA99F0. 5μ 1、 H9-HA571R0. 5μ l、cDNA2y 1，加雙蒸水至 25μ 1。
[0038] PCR 擴增的反應程序：94 °C 5min ;94 °C 45s、59 °C 45s、72 °C 2min，30 個循環； 72〇C lOmin ；4°C 10h〇
[0039] 2、將步驟1的PCR擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，電泳圖見圖1。圖1中，1 為H4N6亞型禽流感病毒，2為H3N8亞型禽流感病毒，3為傳染性喉氣管炎病毒，4為減蛋 綜合癥病毒，5為新城疫病毒，6為H9N2亞型禽流感病毒，7為雞傳染性支氣管炎病毒，Μ為 TransDNA Marker I (自上至下依次代表700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp)。 結果表明，H9N2亞型禽流感病毒樣本在400-500bp之間顯示特異條帶，其他病毒則無相應 條帶。回收所述特異條帶并進行測序，為473bp。
[0040] 實施例3、特異引物對的靈敏度檢測
[0041] 一、分別提取病毒濃度為 105EID5Q/100 μ L、104EID5Q/100 μ L、103EID5Q/100 μ L、 102EID5Q/100 μ L或10EID5Q/100 μ L的Η9Ν2亞型禽流感病毒的病毒液(按照病毒濃度由高 至低依次命名為病毒液A、病毒液B、病毒液C、病毒液D和病毒液E)的總RNA并反轉錄為 cDNA。
[0042] 二、引物組合物的靈敏度
[0043] 1、以步驟一得到的cDNA為模板，用實施例1的特異引物對進行PCR擴增，得到PCR 擴增產物。
[0044] PCR擴增的反應體系同實施例2的步驟二的1。
[0045] PCR擴增的反應程序同實施例2的步驟二的1。
[0046] 2、將步驟1的PCR擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，電泳圖見圖2。圖2中，1 至5依次代表病毒液A、病毒液B、病毒液C、病毒液D和病毒液E，Μ為TransDNA Marker I (自上至下依次代表 700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp)。結果表明， 102EID 5Q/100y L及以上的H9N2亞型禽流感病毒的病毒液進行以上步驟后均可在電泳圖中 觀察到400-500bp之間的特異條帶。回收所述特異條帶并進行測序，為473bp。
[0047] 實施例4、特異引物對的普適性
[0048] H9N2亞型禽流感病毒毒株1 :1997年，從中國香港具有發病表型的病雞體內分離 得到。H9N2亞型禽流感病毒毒株2 :1999年，從中國北京市具有發病表型的病雞體內分離 得到。H9N2亞型禽流感病毒毒株3 :2007年，從中國山東省具有發病表型的病雞體內分離 得到。H9N2亞型禽流感病毒毒株4 :2007年，從中國河北省具有發病表型的病雞體內分離 得到。H9N2亞型禽流感病毒毒株5 :2008年，從中國河北省具有發病表型的病雞體內分離 得到。H9N2亞型禽流感病毒毒株6 :2009年，從中國山東省具有發病表型的病雞體內分離 得到。H9N2亞型禽流感病毒毒株7 :2010年，從中國河北省具有發病表型的病雞體內分離 得到。H9N2亞型禽流感病毒毒株8 :2010年，從中國山東省具有發病表型的病雞體內分離 得到。H9N2亞型禽流感病毒毒株9 :2010年，從中國江蘇省具有發病表型的病雞體內分離 得到。H9N2亞型禽流感病毒毒株10 :2011年，從中國山東省具有發病表型的病雞體內分離 得到。H9N2亞型禽流感病毒毒株11 :2011年，從中國廣東省具有發病表型的病雞體內分離 得到。H9N2亞型禽流感病毒毒株12 :2011年，從中國河北省具有發病表型的病雞體內分離 得到。H9N2亞型禽流感病毒毒株13 :2011年，從中國山東省具有發病表型的病雞體內分離 得到。
[0049] 病雞的發病表型為：精神不振，或閉眼沉郁；采食和飲水減少或廢絕；張口呼吸， 呼吸困難；拉黃白色稀便，較少的極綠色糞便，有時肛門處粘附淡綠色或白色糞便。
[0050] 1、提取以上各個毒株的病毒液(病毒濃度為106 5EID5(l/100y L)的總RNA并反轉錄 為 cDNA。
[0051] 2、以步驟1得到的cDNA為模板，用實施例1的特異引物對進行PCR擴增，得到PCR 擴增產物。
[0052] PCR擴增的反應體系同實施例2的步驟二的1。
[0053] PCR擴增的反應程序同實施例2的步驟二的1。
[0054] 3、將步驟2的PCR擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，電泳圖見圖3。圖3中，泳道 1至13依次代表毒株1至13，Μ為TransDNA Marker I (自上至下依次代表700bp、600bp、 500bp、400bp、300bp、200bp、100bp )。13株毒株經上述檢測均可見400-500bp之間的特異條 帶。回收所述特異條帶并進行測序，均為473bp。結果表明，特異引物對的普適性很好。
[0055] 實施例5、應用引物對檢測臨床樣本的方法
[0056] -、樣品的采集
[0057] 組織樣品：病死或撲滅病禽，取肝、腦、肺等組織；
[0058] 棉拭子：口腔拭子、泄殖腔拭子。
[0059] 2-8°C保存，要求送檢病料新鮮。
[0060] 二、樣品處理
[0061] 1、組織樣品處理
[0062] 稱取待檢病料100mg置研磨器中，加入0. 8ml裂解液(含硫氰酸胍0. 8M、硫氰酸銨 0. 4M、甘油5%、苯酚38%的0. 1M醋酸鈉緩沖液）研磨，把研磨好的病料移至1. 5ml離心管 中，4°C、8000rpm離心5min，取250 μ 1上清，置于1. 5ml滅菌離心管中，加入750 μ 1裂解液， 劇烈振蕩混勻，室溫放置5min。
[0063] 2、棉拭子處理
[0064] 將棉拭子置于1. 5ml滅菌離心管中，加入0. 3ml PBS緩沖液，靜置2小時以上，將 浸液中的棉拭子充分捻動，擰干后棄去拭子，4°C、8000rpm離心5min，取250μ 1上清液，置 于1. 5ml滅菌離心管中，加入750 μ 1裂解液，劇烈振蕩混勻，室溫放置5min。
[0065] 3、陰性對照（RNase free 水）
[0066] 取滅菌雙蒸水250 μ 1，置于1. 5ml滅菌離心管中，加入750 μ 1裂解液，劇烈振蕩混 勻，室溫放置5min。
[0067] 三、應用引物組合物檢測
[0068] 1、取步驟二得到的各個樣本，分別提取總RNA并反轉錄為cDNA。
[0069] 2、以步驟1得到的cDNA為模板，用實施例1的特異引物對進行PCR擴增，得到PCR 擴增產物。
[0070] PCR擴增的反應體系同實施例2的步驟二的1。
[0071] PCR擴增的反應程序同實施例2的步驟二的1。
[0072] 3、將步驟2的PCR擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，根據電泳結果進行判定，如 出現400-500bp之間的特異條帶(具體為473bp)，表明樣品中含有H9亞型禽流感病毒。
【權利要求】
1. 特異引物對甲，由序列表的序列1所示單鏈DNA分子和序列表的序列2所示單鏈DNA 分子組成。
2. 特異引物對乙，由與序列表的序列1所示單鏈DNA分子反向互補的單鏈DNA分子和 與序列表的序列2所示單鏈DNA分子反向互補的單鏈DNA分子組成。
3. 權利要求1所述特異引物對甲或權利要求2所述特異引物對乙在制備輔助鑒定H9 亞型禽流感病毒的試劑盒中的應用。
4. 一種輔助鑒定H9亞型禽流感病毒的試劑盒，包括權利要求1所述特異引物對甲或權 利要求2所述特異引物對乙。
5. 權利要求1所述特異引物對甲或權利要求2所述特異引物對乙在制備輔助鑒定待測 樣本中是否含有H9亞型禽流感病毒的試劑盒中的應用。
6. -種輔助鑒定待測樣本中是否含有H9亞型禽流感病毒的試劑盒，包括權利要求1所 述特異引物對甲或權利要求2所述特異引物對乙。
7. 權利要求1所述特異引物對甲或權利要求2所述特異引物對乙在輔助鑒定H9亞型 禽流感病毒中的應用。
8. -種輔助鑒定H9亞型禽流感病毒的方法，包括如下步驟：以待測病毒的cDNA為模 板，用權利要求1所述特異引物對甲或權利要求2所述特異引物對乙進行PCR擴增，如果得 到PCR擴增產物、待測病毒為候選的H9亞型禽流感病毒，如果沒有得到所述PCR擴增產物、 待測病毒為候選的非H9亞型禽流感病毒。
9. 權利要求1所述特異引物對甲或權利要求2所述特異引物對乙在輔助鑒定待測樣本 中是否含有H9亞型禽流感病毒中的應用。
10. -種輔助鑒定待測樣本中是否含有H9亞型禽流感病毒的方法，包括如下步驟：以 待測樣本的cDNA為模板，用權利要求1所述特異引物對甲或權利要求2所述特異引物對乙 進行PCR擴增，如果得到PCR擴增產物、待測樣本疑似含有H9亞型禽流感病毒，如果沒有得 到所述PCR擴增產物、待測樣本疑似不含有H9亞型禽流感病毒。
【文檔編號】C12N15/11GK104232625SQ201310231172
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2013年6月9日 優先權日:2013年6月9日
【發明者】蒲娟, 劉金華, 魏延迪, 俞晨芳, 裴星瑤, 齊魯, 張谞霄 申請人:中國農業大學