玉米轉基因檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明是檢測用品領域內的一種玉米轉基因檢測試劑盒，由引物組合和膜芯片組成，其特征在于引物組合為7重PCR引物組合，各對引物為Pat、Bar、Cry1Ab、Cry105、EPSPS、P35S和玉米內源基因序列Zein，膜芯片為順序固定在支持膜表面的7組探針序列和一組陽性對照探針序列，分別為Pat探針、Bar探針、Cry1Ab探針、Cry105探針、EPSPS探針、P35S探針、Zein探針和Positive探針，引物組合中有非對稱PCR擴增引物，為5’端帶生物素標志（biotin）的Tag引物。本發明克服了現有技術費時費力成本高的缺陷，提供的玉米轉基因檢測試劑盒操作簡單，快速靈敏，檢測通量大，檢測結果可視化，成本低廉。
【專利說明】玉米轉基因檢測試劑盒
所屬【技術領域】
[0001]本發明涉及檢測用品領域，具體為一種玉米轉基因檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002]轉基因玉米和轉基因大豆是目前全球最主要的轉基因糧食作物。從1996年開始，抗蟲和耐除草劑玉米開始在美國商業化種植，根據國際農業生物技術應用服務組織(ISAAA)資料顯示，到2011年已有16個國家種植轉基因玉米，其中5個國家種植面積超過100萬公頃。2011年全球轉基因玉米總種植面積已達到5100萬公頃，占玉米總種植面積的32%。由于轉基因產品在全球市場中的大量涌現，其環境和食品安全問題也引起國際性的高度關注。各國相繼制定并出臺了相應的法律法規，對轉基因作物的環境釋放和產品銷售采取嚴格的管理措施。目前已有超過40個國家要求對轉基因生物及其產品實施標識管理。我國于2001年5月23日發布了國務院第304號令《農業轉基因生物安全管理條例》，實現了對轉基因生物的規范管理，并于2002年3月20日起施行《農業轉基因生物標識管理辦法》，要求對包括轉基因玉米和轉基因大豆在內的5類轉基因生物及其產品進行標識。因此，快速、準確、靈敏、廉價和相應通量的轉基因產品檢測技術是非常關鍵的。轉基因產品的檢測技術主要包括基于蛋白的檢測方法和基于核酸的檢測方法。酶聯免疫吸附法(ELISA)、免疫試紙條和Western雜交等方法是目前主要的基于蛋白的檢測方法，其共同特點是需要通過一定的處理步驟從樣品中釋放出目標蛋白(抗原)，然后利用抗體特異性的結合抗原蛋白，最后通過酶標或金屬標偶聯抗體與抗原抗體復合物結合，從而產生可檢測的信號，該類方法的缺點是檢測靈敏度相對較低，并且需要制備高特異性抗體，同時檢測容易受到多種因素的影響，出現假陽性。而基于核酸的檢測方法是目前最普遍、最準確的轉基因檢測技術，檢測方法主要包括PCR (聚合酶鏈式反應)技術和基于分子雜交的基因芯片技術。目前仍以PCR技術應用最為廣泛，·其常用的技術方法包括普通定性PCR、巢式PCR、多重PCR、熒光定量PCR等方法。普通定性PCR方法檢測效率低，尤其檢測多基因對象時更加費時費力；巢式PCR雖然提高了檢測的靈敏度，但同樣存在檢測效率的問題；多重PCR方法可以在一個反應中同時檢測多個基因，但常規的電泳檢測結果很難判斷，容易出現假陽性和假陰性結果；熒光定量PCR方法靈敏度高，但其成本高，并且需要特殊檢測儀器?；蛐酒彩浅Ｓ玫霓D基因產品檢測技術，目前一般采用玻璃片作為固相支持物，實驗過程需要相應的點樣儀和芯片識讀儀，同樣成本較高。因此研發一種快速、方便、靈敏、廉價、可視化和高通量的檢測方法將具有非常好的應用前景。

【發明內容】

[0003]本發明的目的是為了克服現有技術費時費力成本高的缺陷，提供一種操作簡單，快速靈敏，檢測通量大，檢測結果可視化，成本低廉的玉米轉基因檢測試劑盒。
[0004]本發明的目的是通過以下技術方案實現的:
本發明的玉米轉基因檢測試劑盒由引物組合和膜芯片組成，其特征在于引物組合為7重PCR引物組合，各對引物的堿基序列5’ -3’如下:
【權利要求】
1.一種玉米轉基因檢測試劑盒由引物組合和膜芯片組成，其特征在于引物組合為7重聚合酶鏈式反應(PCR)引物組合，各對引物的堿基序列5’ -3’如下:
2.根據權利要求1所述的玉米轉基因檢測試劑盒，其特征在于所述引物組合中有非對稱PCR擴增引物，為5’端帶生物素標志(biotin)的Tag引物，其堿基順序如下所示: Tag 引物:biotin-5，-AGACGCCACCGCCAGCGTATTATCCGAGC C-3，。
3.根據權利要求1或2所述的玉米轉基因檢測試劑盒，其特征在于所述玉米轉基因檢測試劑盒由引物組合、膜芯片和輔料組成，輔料為脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、EX-Taq聚合酶(Polymerase)和5’端帶生物素標志的陽性寡核苷酸單鏈DNA，5’端帶生物素標志的陽性寡核苷酸單鏈DNA的堿基順序為biotin-5’ -CTGGTACTTTGGAC
ACTCGTTCTTCTCGCACTGCTCATTATTGCTTCTGATCTGGATGC-3，。
4.根據權利要求3所述的玉米轉基因檢測試劑盒，其特征在于所述玉米轉基因檢測試劑盒由引物組合、膜芯片、輔料和配液組成，配液為IOXPCR緩沖液、預雜交液、雜交液、洗液、封閉液、鏈酶親和素標記辣根過氧化物酶和四甲基聯苯胺(TMB)顯色液。
5.根據權利要求4所述的玉米轉基因檢測試劑盒，其特征在于所述預雜交液為5XSSC,0.1%重量百分比十二烷基磺酸鈉和10XDenhardtJ s液，其中，SSC為0.75M氯化鈉，0.075M檸檬酸鈉，DenhardtJ s液為1% Ficoll聚蔗糖，1%聚乙烯吡咯烷酮，1%牛血清白蛋白；雜交液為5XSSC，0.1%重量百分比十二烷基磺酸鈉，5XDenhardt’ s液，50%重量百分比去離子甲酰胺和100ug/ml酵母tRNA ;洗液分別為洗液1、洗液2、洗液3和洗液4，其中，洗液I為2XSSC和0.1%重量百分比十二烷基磺酸鈉，洗液2為0.5XSSC和 0.1%重量百分比十二烷基磺酸鈉，洗液3為100 mM(毫摩爾/升)Tris-HCl，PH7.5，150 mMNaCl,洗液 4 為 100 mMTris-HCl, PH9.5，100 mMNaCl 和 100 mM MgCl2 ;封閉液為 3% 重量百分比牛血清白蛋白，100 mMTris-HCl,PH7.5,150 mMNaCl ;四甲基聯苯胺顯色液由四甲基聯苯胺顯色液A液和四甲基聯苯胺顯色液B液使用前等量混合配成，其中，四甲基聯苯胺顯色液A液為200mM檸檬酸鈉，PH5.4,0.2mg/ml四甲基聯苯胺，四甲基聯苯胺顯色液B液為3%重量百分比的H2O2用800體積的雙蒸水稀釋液。
6.根據權利要求1所述的玉米轉基因檢測試劑盒，其特征在于所述支持膜為硝酸纖維素膜或尼龍膜。
【文檔編號】C12Q1/68GK103589781SQ201310271719
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年7月2日 優先權日:2013年7月2日
【發明者】黃廣平, 王勇強, 秦子蘇 申請人:黃廣平