激酶Lats2在調(diào)控前體脂肪細(xì)胞增殖中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及激酶Lats2及Hippo信號(hào)通路在調(diào)控動(dòng)物前體脂肪細(xì)胞增殖中的應(yīng)用，所述應(yīng)用為過表達(dá)激酶Lats2，激活Hippo信號(hào)通路，從而抑制動(dòng)物前體脂肪細(xì)胞增殖。本發(fā)明首次揭示了Lats2和Hippo信號(hào)通路對(duì)于動(dòng)物脂肪發(fā)育的調(diào)控作用，尤其是調(diào)控前體脂肪細(xì)胞增殖的作用。本發(fā)明可應(yīng)用于減少動(dòng)物脂肪沉積，提高瘦肉率；也可為畜牧業(yè)的遺傳育種、改善肉質(zhì)等提供新的候選基因及信號(hào)通路。
【專利說明】激酶Lats2在調(diào)控前體脂肪細(xì)胞增殖中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)領(lǐng)域，具體地說，涉及激酶 Lats2及Hippo信號(hào)通路在調(diào)控前體脂肪細(xì)胞增殖中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 在生物體內(nèi)，脂肪組織主要分布在皮下和器官周圍，稱為皮下脂肪墊和圍器官脂 肪墊，這些脂肪墊對(duì)于維持動(dòng)物體溫平衡和保護(hù)器官具有重要的作用。在生物體系統(tǒng)中脂 肪組織發(fā)揮著舉足輕重的作用，其主要作用為維持機(jī)體的能量平衡，以甘油三酯的形式儲(chǔ) 存多余能量，當(dāng)能量消耗大于能量攝入時(shí)，動(dòng)員脂肪將能量以游離脂肪酸和甘油的形式釋 放出來(lái)繼續(xù)代謝產(chǎn)能。此外，皮下脂肪可以保持動(dòng)物體溫，對(duì)機(jī)械碰撞也具有緩沖作用。由 于脂肪組織對(duì)于機(jī)體具有重要的作用，因此對(duì)脂肪發(fā)育調(diào)控機(jī)制的研究也顯得尤為重要。
[0003] Hippo信號(hào)通路首先在果蠅中發(fā)現(xiàn)，在哺乳動(dòng)物中也存在這樣的通路，在物種間高 度保守。Hippo信號(hào)通路控制器官的大小，是一種激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，由一些對(duì)生長(zhǎng)起負(fù)調(diào)節(jié)作 用的因子組成，最終引起轉(zhuǎn)錄輔活化子的磷酸化和失活，從而調(diào)控一些靶基因的表達(dá)，抑制 細(xì)胞增殖和控制器官大小。
[0004] Lats2屬于Ser/Thr激酶的AGC家族，C-端激酶結(jié)構(gòu)域高度保守。Lats2作為Hippo 信號(hào)通路中的一個(gè)核心激酶，通過與下游的轉(zhuǎn)錄輔助因子YAP和TAZ相互作用從而調(diào)控靶 基因的表達(dá)，對(duì)細(xì)胞的增殖和凋亡發(fā)揮調(diào)控作用。
[0005] Hippo信號(hào)通路和激酶Lats2參與多種組織和器官的發(fā)育調(diào)控，但是對(duì)于脂肪組 織的發(fā)育調(diào)控卻沒有明確的報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對(duì)上述問題，本發(fā)明的目的是提供激酶Lats2及Hippo信號(hào)通路在控制動(dòng)物脂 肪發(fā)育中的新用途。
[0007] 本發(fā)明提供了激酶Lats2在調(diào)控動(dòng)物脂肪細(xì)胞增殖中的應(yīng)用，所述應(yīng)用為過表達(dá) 激酶Lats2,激活Hippo信號(hào)通路，從而抑制動(dòng)物脂肪細(xì)胞增殖。
[0008] 優(yōu)選地，所述脂肪細(xì)胞為前體脂肪細(xì)胞。
[0009] 所述動(dòng)物為哺乳動(dòng)物。優(yōu)選地，所述動(dòng)物為小鼠、牛或羊。
[0010] 本發(fā)明還提供了一種過表達(dá)激酶Lats2的小鼠前體脂肪細(xì)胞的制備方法，所述方 法包括如下步驟：
[0011] (1)提取小鼠大腦組織RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以CDNA為模板，以引物Fl和Rl為引 導(dǎo)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，獲得 Lats2 基因；引物 Fl :AGATCTATGAGGCCAAAGACTTTTCC(SEQ ID No. 1); 引物 Rl :CTCGAGTTACACGTACACCGGCTGGC (SEQ ID Νο·2);
[0012] (2)將Lats2基因克隆至表達(dá)載體pPB-CAG-EBNXN，獲得重組表達(dá)載體 pPB-CAG-EBNXN-Lats2 ；
[0013] (3)將重組表達(dá)載體pPB-CAG-EBNXN-Lats2轉(zhuǎn)染小鼠前體脂肪細(xì)胞，藥物篩選得 到穩(wěn)定整合Lats2的細(xì)胞，即得到過表達(dá)激酶Lats2的小鼠前體脂肪細(xì)胞。
[0014] 步驟（1)中，反轉(zhuǎn)錄成cDNA的方法為M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄方法。
[0015] 步驟（1)中，PCR擴(kuò)增所用引物為Fl和Rl，PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為50微升KOD高 保真酶PCR擴(kuò)增體系：

【權(quán)利要求】
1. 激酶Lats2在調(diào)控動(dòng)物脂肪細(xì)胞增殖中的應(yīng)用。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用為過表達(dá)激酶Lats2,激活Hippo 信號(hào)通路，抑制動(dòng)物脂肪細(xì)胞增殖。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述脂肪細(xì)胞為前體脂肪細(xì)胞。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述動(dòng)物為哺乳動(dòng)物；優(yōu)選地，所述 動(dòng)物為小鼠、牛或羊。
5. -種過表達(dá)激酶Lats2的小鼠前體脂肪細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述方法包 括如下步驟： (1) 提取小鼠大腦組織RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，以引物F1和R1為引導(dǎo)進(jìn) 行PCR擴(kuò)增，獲得Lats2基因； 引物 FI :AGATCTATGAGGCCAAAGACTTTTCC ; 引物 R1 :CTCGAGTTACACGTACACCGGCTGGC ; (2) 將Lats2基因克隆至表達(dá)載體pPB-CAG-EBNXN，獲得重組表達(dá)載體 pPB-CAG-EBNXN-Lats2 ； (3) 將重組表達(dá)載體pPB-CAG-EBNXN-Lats2轉(zhuǎn)染小鼠前體脂肪細(xì)胞，藥物篩選得到穩(wěn) 定整合Lats2的細(xì)胞，即得到過表達(dá)激酶Lats2的小鼠前體脂肪細(xì)胞。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟（1)中，PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為50微 升K0D高保真酶PCR擴(kuò)增體系： 組分 體積 ddH20 32 ^il l〇x緩沖液 5{il dNTP Mix 5 pi MgS04 2 引物 FI 1.5 ^1 引物 R1 1.5 il\ cDNA 模板 2 ill KOD 酶 1 ill 總體積 50 |il; PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性2分鐘；94°C變性30秒，62 °C退火30秒，72 °C延伸 3分鐘，重復(fù)30次；72 °C延伸7分鐘。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟（2)中，重組表達(dá)載體 pPB-CAG-EBNXN-Lats2的制備方法為將步驟（1)中的PCR產(chǎn)物與表達(dá)載體pPB-CAG-EBNXN 分別進(jìn)行Bglll和Xhol雙酶切，PCR產(chǎn)物目的片段和表達(dá)載體pPB-CAG-EBNXN骨架的酶切 產(chǎn)物分別回收后用T4 DNA連接酶連接，得到重組表達(dá)載體pPB-CAG-EBNXN-Lats2。
8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟（3)中，所述藥物篩選為嘌呤霉素藥 物篩選。
9. 激酶Lats2在減少動(dòng)物脂肪沉積，提高瘦肉率中的應(yīng)用。
10. 激酶Lats2在動(dòng)物優(yōu)化遺傳育種中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N5/10GK104278054SQ201310279922
【公開日】2015年1月14日 申請(qǐng)日期:2013年7月4日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月4日
【發(fā)明者】胡曉湘, 安楊, 李寧 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)