轉(zhuǎn)化寇氏隱甲藻的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)化寇氏隱甲藻(Crypthecodinium cohnii)的方法，該方法包括以下步驟：預(yù)培養(yǎng)寇氏隱甲藻；預(yù)培養(yǎng)農(nóng)桿菌；在滲透壓調(diào)節(jié)劑的存在下懸浮寇氏隱甲藻及農(nóng)桿菌，然后將完整的寇氏隱甲藻細(xì)胞與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)；和獲得農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的寇氏隱甲藻。
【專(zhuān)利說(shuō)明】轉(zhuǎn)化寇氏隱甲藻的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域。具體涉及用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化寇氏隱甲藻的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 寇氏隱甲藻（Crypthecodinium cohnii)按照 NCBI Taxonomy 數(shù)據(jù)庫(kù)分類(lèi)， 屬于 Eukaryota 界 Alveolata(囊泡蟲(chóng)類(lèi)）Dinophyceae (甲藻門(mén)）Gonya μ Iacales 目 Crypthecodiniaceae科Crypthecodinium屬。該藻是一種比較原始的真核生物，具有核膜 不連續(xù)、染色體始終高度凝集、細(xì)胞壁厚等特性[劉曉玲等，寇氏隱甲藻染色體的提取及其 獨(dú)特的超微結(jié)構(gòu)，實(shí)驗(yàn)生物學(xué)報(bào)，2000, 33 (2) :189-1]。
[0003] 寇氏隱甲藻有較好的二十二碳六烯酸（DHA)合成能力。DHA占細(xì)胞脂質(zhì)的30% 以上[Wynn 等· Production of single cell oils by dinoflagellates, in Single Cell 0il(ZVi Cohen&Colin Ratledge)pp.86_98，A0CS Press，Urbana]，尤其是產(chǎn)物脂質(zhì)組分少。 如ATCC30772菌株的生物量可達(dá)17. 2g/L，DHA占總脂肪酸組成的59%，且脂肪酸組成簡(jiǎn)單 [Colin等· Production of docosahexaenoic acid by Crypthecodinium cohnii grown in a pH-auxostat cμ lture with acetic acid as principal carbon source. 2001,Lipid, 36(11) :1241-1246]。隱甲藻的脂肪酸一般含有DHA及棕櫚酸、油酸、硬脂酸等，少見(jiàn)魚(yú)油或 裂壺藻油中的EPA、DPA等不適合嬰幼兒服用或不確定功能的組分，因此一度成為唯一適用 嬰幼兒配方食品的DHA藻油。
[0004] 目前對(duì)寇氏隱甲藻生產(chǎn)性能的優(yōu)化主要集中在發(fā)酵改良上，典型如Colin等人的 US7674609、Martek公司的US7678931，以及商業(yè)化生產(chǎn)產(chǎn)品DHASC0。De Swaaf的文獻(xiàn)報(bào) 道實(shí)現(xiàn)了 l〇9g/L 生物量 19g/L DHA 產(chǎn)量的流加發(fā)酵[De Swaaf ME. High-cell-density fed-batch cultivation of the docosahexaenoic-acidproducing marine alga Crypthecodinium cohnii on ethanol. Applied Microbiology and Biotechnology, 2003,61(1) :40-43]。對(duì)隱甲藻的培養(yǎng)，一般使用較高鹽濃度，常見(jiàn)25g/L的海鹽，也有見(jiàn) 使用 25g/L NaCl 的[da Silva TL. Effect of n-dodecane on Crypthecodinium cohnii fermentations and DHA production. J Ind Microbiol Biotechnol, DOI10. 1007/ S10295-006-0081-8]，ATCC建議的隱甲藻活化培養(yǎng)基ATCC460也要求使用23. 48g/L的 NaCl并含有其他鹽分。其他因素如溫度、pH、碳源、氮源對(duì)寇氏隱甲藻合成DHA的影響也有 報(bào)道[王菊芳等.隱甲藻懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)DHA.無(wú)錫輕工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002,21(4) :344-346]。 個(gè)別專(zhuān)利提及了對(duì)隱甲藻進(jìn)行改造，如通過(guò)離子束進(jìn)行誘變（CN201110138270. 5)。
[0005] 隱甲藻分子生物學(xué)方向的研究還較少，1998年Lohuis Michael R. ten和 MillerDavid J.使用金剛砂（silicon carbide)對(duì)隱甲藻完整細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化后（效率 每 IO7 個(gè)細(xì)胞得到 5-24 個(gè)轉(zhuǎn)化子）[Lohuis Michael R. ten and Miller David J. 1998. Genetic transformation of dinoflagellates(Amphidinium and Symbiodinium)： expression of GUS in microalgae using heterologous promoter constructs. The Plant Journal，13(3) :427-435]后，未見(jiàn)對(duì)寇氏隱甲藻進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的公開(kāi)報(bào)道；也 未見(jiàn)對(duì)隱甲藻DHA合成的機(jī)理進(jìn)行探索的嘗試，無(wú)法解釋其具有優(yōu)良脂肪酸組成的原 因。目前僅在 BASF 公司專(zhuān)利《Method For the Production of Myltiple-Unsaturated Fatty Acids in Transgenic Organisms》提到兩個(gè)寇氏隱甲藻Δ-5延長(zhǎng)酶基因序列（如 US20080155705中SEQ47/49)，但僅表示該基因可用于構(gòu)建產(chǎn)油的轉(zhuǎn)基因生物中，未涉及隱 甲藻的基因工程研究。目前對(duì)隱甲藻的分子生物學(xué)改造、研究公開(kāi)文獻(xiàn)資料很少。
[0006] 寇氏隱甲藻的DHA產(chǎn)量較高，油脂組分非常簡(jiǎn)單，是很好的DHA生產(chǎn)菌株。但目前 尚無(wú)對(duì)隱甲藻進(jìn)行基因工程改造的報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)，在農(nóng)桿菌與寇氏隱甲藻懸浮時(shí)，如果加入調(diào)節(jié)滲透壓的 物質(zhì)，可以實(shí)現(xiàn)農(nóng)桿菌對(duì)寇氏隱甲藻完整細(xì)胞的成功轉(zhuǎn)化，達(dá)到比現(xiàn)有技術(shù)高的轉(zhuǎn)化效率。
[0008] 具體地，本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)化寇氏隱甲藻（Crypthecodinium cohnii)的方法，該方法 包括以下步驟：在滲透壓調(diào)節(jié)劑的存在下懸浮寇氏隱甲藻及農(nóng)桿菌，然后將完整的寇氏隱 甲藻細(xì)胞與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)；和獲得農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的寇氏隱甲藻。所述滲透壓調(diào)節(jié)劑是添加在 IMN中，所述IMN使用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化常用的誘導(dǎo)培養(yǎng)基（Induction medium,簡(jiǎn)稱(chēng)IM),通過(guò)選 自鈉鹽、鎂鹽、鉀鹽、鈣鹽、有機(jī)物的滲透壓調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)頂?shù)臐B透壓來(lái)配制。具體地，所述滲 透壓調(diào)節(jié)劑可以是鈉鹽。具體地，所述滲透壓調(diào)節(jié)劑可以是氯化鈉、硫酸鈉、氯化鉀、氯化 鈣、葡萄糖或山梨醇。上述滲透壓調(diào)節(jié)劑的濃度可以是100mM-700mM，優(yōu)選是100mM-650mM， 更優(yōu)選是200mM-400mM。在本發(fā)明的方法中，可以預(yù)培養(yǎng)寇氏隱甲藻到對(duì)數(shù)初期將寇氏隱甲 藻細(xì)胞與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)。在本發(fā)明的方法中，可以將寇氏隱甲藻細(xì)胞與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)。具 體地，在本發(fā)明中使用的寇氏隱甲藻可以是ATCC30772和ATCC40750。
[0009] 在寇氏隱甲藻的預(yù)培養(yǎng)過(guò)程中，可以使用常規(guī)的CA培養(yǎng)基。其成分可以是葡萄糖 9-3(^/1，酵母粉1.5-7.5 8/1，50-75%海水（或人造海鹽配制），？?jī)?cè).0-7.0。其中還可以額 外添加硫酸鈉或氯化鈉，以調(diào)節(jié)其滲透壓。
[0010] 在寇氏隱甲藻細(xì)胞與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)中，使用常規(guī)的頂培養(yǎng)基效果不佳。發(fā)明人出 乎意料地發(fā)現(xiàn)，在IM中添加上文所述的調(diào)節(jié)滲透壓的物質(zhì)，可以實(shí)現(xiàn)良好的轉(zhuǎn)化效果。
[0011] 農(nóng)桿菌是一種本領(lǐng)域技術(shù)人員常用的轉(zhuǎn)化工具。如本領(lǐng)域工作者所熟知的，決 定農(nóng)桿菌毒性的基因在野生型農(nóng)桿菌中以質(zhì)粒形式存在，根瘤農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens)中稱(chēng)為T(mén)i質(zhì)粒，發(fā)根農(nóng)桿菌（Agrobacterium rhizogenes)中稱(chēng)為Ri質(zhì)粒。 這兩種質(zhì)粒均含有毒力基因 Vir (Virulence)區(qū)和轉(zhuǎn)移DNA (transfer DNA，T-DNA)區(qū)。Vir 區(qū)的基因表達(dá)出來(lái)后，將T-DNA邊界序列之間的區(qū)域轉(zhuǎn)移并整合到宿主基因組中。Vir區(qū) 包含許多基因，有些基因的表達(dá)需要酚類(lèi)化合物的誘導(dǎo)，通常植物的受傷部位或天然地分 泌這類(lèi)化合物，實(shí)驗(yàn)室條件下常用如乙酰丁香酮來(lái)人為促使Vir基因的表達(dá)。誘導(dǎo)培養(yǎng)基 (IM)中適當(dāng)?shù)膒H、糖類(lèi)濃度、磷酸濃度，以及誘導(dǎo)時(shí)的溫度條件會(huì)促進(jìn)Vir基因受酚類(lèi)物質(zhì) 誘導(dǎo)表達(dá)的效果[鄒智.農(nóng)桿菌vir基因誘導(dǎo)因子研究進(jìn)展.中國(guó)生物工程雜志，2011， 31 (7) :126-132]，從而提高農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化效率。通常農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，需要宿主細(xì)胞適當(dāng)?shù)乇┞?或創(chuàng)傷，如使植物組織形成創(chuàng)傷、真核生物先制備成原生質(zhì)體等。本發(fā)明使用經(jīng)滲透壓調(diào)節(jié) 劑調(diào)整后的頂來(lái)懸浮預(yù)培養(yǎng)的細(xì)胞，可以使農(nóng)桿菌高效地轉(zhuǎn)化完整的寇氏隱甲藻，無(wú)需麻 煩的原生質(zhì)體制備過(guò)程。本發(fā)明的關(guān)鍵在于預(yù)培養(yǎng)細(xì)胞懸浮液中滲透壓調(diào)節(jié)劑的加入，而 所舉例的頂配方可經(jīng)本領(lǐng)域技術(shù)人員適當(dāng)?shù)男薷摹Ｍ瑯拥模景l(fā)明頂N的鹽及糖或醇的濃 度條件，主要作用對(duì)象為寇氏隱甲藻，因此本發(fā)明的應(yīng)用不限于本發(fā)明實(shí)施例所列農(nóng)桿菌， 常見(jiàn)的根瘤農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌工具菌株，包括但不限于EHA105、LBA4404、AGLO等都可以 用于本發(fā)明。本發(fā)明實(shí)施例使用雙元載體系統(tǒng)模式，通過(guò)K7載體構(gòu)建重組農(nóng)桿菌，但本發(fā) 明的重點(diǎn)不是重組農(nóng)桿菌的構(gòu)建方式，因此本發(fā)明的應(yīng)用包括但不限于雙元載體系統(tǒng)、一 元載體系統(tǒng)。外源基因轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中的方式以及外源基因轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌借助的載體并不是本 發(fā)明的關(guān)鍵，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)常識(shí)進(jìn)行選擇。本發(fā)明實(shí)施例為了鑒定陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子， 特別在農(nóng)桿菌中用k7載體導(dǎo)入了 zeocin抗性基因和⑶S基因作為標(biāo)記基因，這些基因并 不是轉(zhuǎn)化方法所必須的，因?yàn)樗鼈儾⒉粵Q定轉(zhuǎn)化的效率，只是篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子所需要的。本 領(lǐng)域研究者可以簡(jiǎn)單地通過(guò)成熟的技術(shù)導(dǎo)入其它元件，包括但不限于藥物抗性基因、酶基 因、基因表達(dá)調(diào)控元件、基因敲除元件、基因定點(diǎn)突變?cè)龋话ê琓-DNA邊界序列的載 體為出發(fā)載體，不限于pCAMBIA系列載體。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0012] 圖1 :構(gòu)建重組農(nóng)桿菌用K7質(zhì)粒示意圖。載體上含在重組寇氏隱甲藻內(nèi)起作用的 篩選標(biāo)記zeocin抗性基因，含有在重組農(nóng)桿菌內(nèi)起作用的篩選標(biāo)記卡那霉素抗性基因，含 有CaMV35S啟動(dòng)子以及EcoR I-Hind III等限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)組成的多克隆位點(diǎn)區(qū)（MCS)、 含有左邊界T-DNA重復(fù)及右邊界T-DNA重復(fù)兩個(gè)T-DNA邊界區(qū)域。農(nóng)桿菌將左邊界T-DNA 重復(fù)、CaMV35S PolyA、zeocin、CaMV35S 啟動(dòng)子、MCS、CaMV35S 啟動(dòng)子、⑶S、Nos PolyA、右 邊界T-DNA重復(fù)這一段轉(zhuǎn)到寇氏隱甲藻中，并整合到基因組上。
[0013] 圖2 :CA_1體系轉(zhuǎn)化寇氏隱甲藻所獲的抗zeocin菌落PCR檢驗(yàn)的結(jié)果。1泳道樣 品為重組農(nóng)桿菌菌落為模板的PCR陽(yáng)性對(duì)照，2泳道為構(gòu)建重組農(nóng)桿菌所用K7質(zhì)粒為模板 的PCR陽(yáng)性對(duì)照，4-11泳道為隨機(jī)挑選的抗zeocin重組寇氏隱甲藻菌落為模板的PCR擴(kuò)增 產(chǎn)品。虛線框表明重組寇氏隱甲藻菌落得到了與陽(yáng)性對(duì)照一致的PCR檢測(cè)條帶。
[0014] 圖3 :CA-2體系所獲抗性菌落PCR檢驗(yàn)結(jié)果。1、2泳道為重組農(nóng)桿菌、K7質(zhì)粒為模 板進(jìn)行的PCR陽(yáng)性對(duì)照。3-6泳道為四個(gè)隨機(jī)挑選的zeocin抗性寇氏隱甲藻菌落PCR檢測(cè) 結(jié)果。虛線框表明重組隱甲藻菌落獲得了與陽(yáng)性對(duì)照一致的PCR檢測(cè)條帶，M為T(mén)akara公 司DL5000核酸標(biāo)記物。
[0015] 圖4 :優(yōu)化實(shí)驗(yàn)所得抗性菌落PCR檢測(cè)的結(jié)果。M泳道為T(mén)akara公司Ikb DNA ladder，1-12為隨機(jī)挑選的zeocin抗性寇氏隱甲藻菌落。8、9、11泳道為未得到特異性的 PCR產(chǎn)物，為PCR檢測(cè)的陰性樣。
[0016] 圖5 :寇氏隱甲藻培養(yǎng)終點(diǎn)階段對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化效率的影響。結(jié)果顯示，培養(yǎng) 寇氏隱甲藻到對(duì)數(shù)初期比對(duì)數(shù)末期有更好的轉(zhuǎn)化效果。
[0017] 圖6 :MN溶液中氯化鈉濃度對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響。51mM為正常頂誘導(dǎo)液中Na離 子的濃度，200-700mM為任選的幾種Na離子濃度條件。
[0018] 圖7A:相同濃度下（350mM)，使用有機(jī)溶劑糖類(lèi)（葡萄糖為代表）、醇類(lèi)（山梨醇 為代表）配置的頂N溶液處理寇氏隱甲藻后，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的效率與氯化鈉的對(duì)比。
[0019] 圖7B :350mM陽(yáng)離子濃度、不同無(wú)機(jī)鹽配制的MN溶液處理寇氏隱甲藻后，農(nóng)桿菌 轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化效率圖。
[0020] 圖8 :寇氏隱甲藻ATCC40750與寇氏隱甲藻ATCC30772在本發(fā)明條件下轉(zhuǎn)化效率 的對(duì)比。

【具體實(shí)施方式】
[0021] 如無(wú)具體說(shuō)明，本發(fā)明的各種原料均可以通過(guò)市售得到；或根據(jù)本領(lǐng)域的常規(guī)方 法制備得到。除非另有定義或說(shuō)明，本文中所使用的所有專(zhuān)業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域技術(shù)熟 練人員所熟悉的意義相同。此外任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本 發(fā)明方法中。
[0022] 本發(fā)明的其他方面由于本文的公開(kāi)內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn) 的。
[0023] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照國(guó)家標(biāo) 準(zhǔn)測(cè)定。若沒(méi)有相應(yīng)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，則按照通用的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)、常規(guī)條件、或按照制造廠商所建 議的條件進(jìn)行。除非另外說(shuō)明，否則所有的份數(shù)為重量份，所有的百分比為重量百分比。
[0024] 除非另有定義或說(shuō)明，本文中所使用的所有專(zhuān)業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域技術(shù)熟練人 員所熟悉的意義相同。此外任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明 方法中。
[0025] 如本文所用，"含有"、"具有"或"包括"包括了"包含"、"主要由......構(gòu)成"、"基 本上由......構(gòu)成"、和"由......構(gòu)成";"主要由......構(gòu)成"、"基本上由......構(gòu)成" 和"由......構(gòu)成"屬于"含有"、"具有"或"包括"的下位概念。
[0026] 可對(duì)本發(fā)明提到的特征或?qū)嵤├岬降奶卣鬟M(jìn)行組合。本說(shuō)明書(shū)所揭示的所有特 征可與任何組合物形式并用，說(shuō)明書(shū)中所揭示的各個(gè)特征，可以任何可提供相同、均等或相 似目的的替代性特征取代。因此除有特別說(shuō)明，所揭示的特征僅為均等或相似特征的一般 性例子。
[0027] 可使用本發(fā)明方法轉(zhuǎn)化的寇氏隱甲藻（Crypthecodinium cohnii)包括但不限 于：ATCC40750，TEX L1649，ATCC30556，ATCC50051，UTEX L1649，RJH，ATCC30772，CCMP316， ATCC50297, ATCC30556 等。
[0028] 可用于本發(fā)明方法的農(nóng)桿菌可以是本領(lǐng)域已知的各種用于基因轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌，包 括但不限于根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens)EHA105、EHA101、LBA4404、AGL-0、 AGL-1、NT1、C58-Z707、GV3101: :pMP90 等。
[0029] 本發(fā)明方法中，使用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化完整的寇氏隱甲藻細(xì)胞。"完整的寇氏隱甲藻細(xì) 胞"指細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，包括細(xì)胞壁、細(xì)胞膜等寇氏隱甲藻細(xì)胞應(yīng)有的結(jié)構(gòu)。更具體而言，完整 的寇氏隱甲藻細(xì)胞不是寇氏隱甲藻原生質(zhì)體，后者經(jīng)處理而不含有細(xì)胞壁。
[0030] 本發(fā)明中，農(nóng)桿菌含有感興趣的目標(biāo)基因。所述目標(biāo)基因可以是任意脫氧核糖核 酸。所述目標(biāo)基因相對(duì)于待轉(zhuǎn)化的寇氏隱甲藻而言可以是外源的，即該寇氏隱甲藻自身不 存在的；也可以是內(nèi)源的，即符合寇氏隱甲藻本身遺傳信息的核酸。所述目標(biāo)基因包括但不 限于具有生物學(xué)活性的核酸，如蛋白編碼基因、用于調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的核酸等；以及不具備生 物活性的核酸，如應(yīng)用于基因整合、敲除的核酸片段。在某些實(shí)施例中，目標(biāo)基因編碼感興 趣的酶和各種功能蛋白。
[0031 ] 在本發(fā)明中，共培養(yǎng)時(shí)使用的培養(yǎng)基可以包括但不限于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)培養(yǎng)基。
[0032] 可采用常規(guī)的條件，例如培養(yǎng)時(shí)間、接種量、溫度等，來(lái)培養(yǎng)寇氏隱甲藻，優(yōu)選地， 將寇氏隱甲藻預(yù)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)初期。
[0033] 可采用常規(guī)的條件培養(yǎng)農(nóng)桿菌至對(duì)數(shù)期。將外源基因轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌可使用本領(lǐng)域公 知的方法，例如，包括但不限于熱激法、電擊轉(zhuǎn)化法等。
[0034] 可使用含有滲透壓調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基來(lái)分別洗滌、重懸預(yù)培養(yǎng)的寇氏隱甲藻細(xì)胞和 農(nóng)桿菌。具體而言，可使用含有滲透壓調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基洗滌，然后用含有滲透壓調(diào)節(jié)劑的培 養(yǎng)基重懸。重懸后的體積一般取決于用來(lái)收集的菌液量，一般約是原菌液體積的1/20。可使 用含有滲透壓調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基洗滌，然后重懸到〇. 8-1. 2 X IOltl個(gè)/ml (重懸到I. 5-2. 5ml)。 通常取等體積的兩種懸液混勻。但也可取不同體積比的兩種懸液混勻。
[0035] 在本發(fā)明中，滲透壓調(diào)節(jié)劑優(yōu)選為鈉鹽、鎂鹽、鉀鹽、鈣鹽或糖、醇類(lèi)有機(jī)物中的一 種或多種，更優(yōu)選的所述滲透壓調(diào)節(jié)劑選自氯化鈉、硫酸鈉、氯化鉀、硫酸鎂、氯化鈣、葡萄 糖和山梨醇。培養(yǎng)基中滲透壓調(diào)節(jié)劑的濃度為100mM-700mM，優(yōu)選的，所述滲透壓調(diào)節(jié)劑的 濃度是 100mM-650mM，更優(yōu)選是 200-400mM。
[0036] 在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例中，滲透壓調(diào)節(jié)劑的濃度為：100mM，110mM，120mM， 130mM,140mM,150mM,160mM,170mM,180mM,190mM,200mM,210mM,220mM,230mM,240mM, 250mM,260mM,270mM,280mM,290mM,300mM,310mM,320mM,330mM,340mM,350mM,360mM, 370mM,380mM,390mM,400mM,410mM,420mM,430mM,440mM,450mM,460mM,470mM,480mM, 490mM,500mM,510mM,520mM,530mM,540mM,550mM,560mM,570mM,580mM,590mM,600mM, 610mM，620mM，630mM，640mM，650mM，660mM，670mM，680mM，690mM，或 700mM〇
[0037] 在本發(fā)明中，含有滲透壓調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基使用農(nóng)桿菌誘導(dǎo)培養(yǎng)基，由MES(2-嗎啉 乙磺酸）、緩沖體系（一般為磷酸鹽）、碳源、氮源、鹽組成，一般控制在合適的PH條件下（如 pH5. 3)以提高農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的效果。
[0038] 在一個(gè)具體實(shí)施例中，洗滌、重懸時(shí)使用的培養(yǎng)基為包含有100mM-700mM滲透壓 調(diào)節(jié)劑的頂培養(yǎng)基。
[0039] 可采用常規(guī)的方式混勻寇氏隱甲藻懸液和農(nóng)桿菌懸液，并取適量混合菌液（例如 10-200 μ 1，如50 μ 1)涂布到培養(yǎng)平板上。可采用常規(guī)平板制備方法來(lái)制備所述培養(yǎng)平板。 在本發(fā)明中，所述培養(yǎng)平板可以包括但不限于已公開(kāi)的支持隱甲藻生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，如碳源 可選自葡萄糖、半乳糖等糖類(lèi)，短鏈酸如乙酸、丙酸、乳酸或其鹽，醇類(lèi)如乙醇、甘油，糖漿如 角豆?jié){糖漿；氮源可選自使用酵母粉、蛋白胨、肉提取物、谷氨酸或其鹽、硝酸鉀、氯化銨、玉 米漿等；海鹽或海水提供滲透壓。
[0040] 應(yīng)理解，雖然上述對(duì)培養(yǎng)基的各成分和含量進(jìn)行了描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員可根 據(jù)實(shí)際需要對(duì)其成分和含量做出適當(dāng)改動(dòng)。下文將以具體實(shí)施例的方式描述本發(fā)明。實(shí)施 例中所用的試劑、反應(yīng)條件等，除非另有說(shuō)明，否則均為本領(lǐng)域常規(guī)的試劑和反應(yīng)條件。
[0041] 實(shí)施例中使用培養(yǎng)基和溶液配方如下：
[0042] YEB培養(yǎng)基：牛肉浸膏5g/L，酵母粉lg/L，蛋白胨5g/L，ρΗ7· 0-7. 5。
[0043] CA培養(yǎng)基：葡萄糖9g/L，酵母粉I. 5g/L，海鹽25g/L，ρΗ6· 5
[0044] CS培養(yǎng)基：除碳源從葡萄糖換成乙酸鈉外，CS其余組分及含量同CA培養(yǎng)基
[0045] 頂培養(yǎng)基和頂液：7.8g/L2-嗎啉乙磺酸，葡萄糖2g/L，甘油0.6g/L，氯化鈉 0· 15g/L，硫酸銨0· 5g/L，硫酸亞鐵0· 0025g/L，氯化鈣0· 08g/L，硫酸鎂0· 25g/L，磷酸氫二 鉀2. 28g/L，磷酸二氫鉀I. 36g/L，pH5. 3。IM在農(nóng)桿菌及隱甲藻共培養(yǎng)時(shí)，充當(dāng)培養(yǎng)基的作 用，因此稱(chēng)之為培養(yǎng)基；IM在懸浮細(xì)胞及洗脫細(xì)胞時(shí)，并未支持細(xì)胞生長(zhǎng)，僅是起到一種溶 液的作用，因此稱(chēng)作頂液。兩者成分一致。
[0046] 頂固體培養(yǎng)基：頂中補(bǔ)充L 8%的瓊脂粉制得。
[0047] 實(shí)施例一
[0048] 由出發(fā)農(nóng)桿菌菌株，即根瘤農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens) EHA105 (所述菌 株購(gòu)自普如汀生物技術(shù)（北京）有限公司）構(gòu)建所需重組農(nóng)桿菌。EHA105菌株為本領(lǐng)域研 究者熟知的常用工具菌株。本實(shí)驗(yàn)中為了鑒定轉(zhuǎn)化成功與否，在其中導(dǎo)入藥物抗性基因，從 而便于檢測(cè)。
[0049] 具體步驟如下：① PCAMBIA1301載體中潮霉素抗性基因兩端均有XhoI限制性內(nèi)切 酶識(shí)別位點(diǎn)，因此通過(guò)XhoI內(nèi)切酶（購(gòu)自寶生物公司）酶切pCAMBIA1301 (購(gòu)自Cambia公 司），使載體中的潮霉素抗性基因被完全切出；②使用PGAPZ a A載體（購(gòu)自普如汀生物技 術(shù)（北京）有限公司）為模板，使用引物ZEOU(AAAACTCGAGATGGCCAAGTTGACCAGTGC)及ZEO D(AAAACTCGAGTCAGTCCTGCTCCTCGGCCA)PCR 擴(kuò)增 zeocin 抗性基因片段，擴(kuò)增程序?yàn)?95°C 5 分鐘預(yù)變性、32個(gè)循環(huán)的95°C 50s、55°C 50s、72°C 30s擴(kuò)增、最后在72°C延伸10分鐘，得 到兩端含有XhoI酶切位點(diǎn)的zeocin抗性基因片段，并通過(guò)Cycle Pure Kit (Omega公司， D6492-01)試劑盒回收純化后，使用XhoI限制性內(nèi)切酶酶切處理；③酶切的pCAMBIA1301 載體及PCR產(chǎn)物分別通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，切出pCAMBIA1301載體去除了潮霉素 抗性基因片段剩余部分的片段以及PCR產(chǎn)物酶切物的條帶后，通過(guò)Gel Extraction Kit凝 膠回收試劑盒（Omega公司，D2500-02)回收純化，通過(guò)T4DNA連接酶（Ferments，EL0011) 將兩個(gè)純化后片段進(jìn)行連接；④連接產(chǎn)物通過(guò)42°C熱激法轉(zhuǎn)入CaCl 2法制備的DH5 α感受 態(tài)細(xì)胞（購(gòu)自Takara公司）中，預(yù)培養(yǎng)后涂布于卡那抗性LB平板上篩選；⑤抗性克隆經(jīng)過(guò) 菌落PCR及質(zhì)粒測(cè)序篩選，得到zeocin抗性基因取代了 pCAMBIA1301載體中潮霉素抗性基 因的新載體，命名為K7,載體示意圖見(jiàn)圖1所示；⑥按照[李明剛，植物基因操作原理與技 術(shù)[M]，天津科學(xué)技術(shù)出版社，2000, ppl81]的方法制備感受態(tài)農(nóng)桿菌細(xì)胞，具體如下：使用 YEB培養(yǎng)液，28°C振蕩搖床上培養(yǎng)農(nóng)桿菌EHA105菌落過(guò)夜，然后按體積比1 %轉(zhuǎn)接到50ml 新的YEB培養(yǎng)液中，28°C振蕩培養(yǎng)到0D600 = 0. 5 ;冰浴菌液30分鐘后，5000rpm離心5分 鐘收集細(xì)胞，懸浮菌體沉淀到IOml預(yù)冷的0. 5M的無(wú)菌NaCl溶液中，再次5000rpm離心5 分鐘收集細(xì)胞，懸浮菌體沉淀于20ml預(yù)冷的0. 02M無(wú)菌CaCl2溶液中，然后按照200 μ 1/支 分裝，液氮速凍后保存到超低溫冰箱；⑦取Κ7質(zhì)粒溶液20 μ 1 (0. 5-1. 0 μ g)，加入到一支冰 浴融化的200 μ 1農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞液中，混勻，冰浴30分鐘后液氮速凍5分鐘，然后立即 轉(zhuǎn)入37°C水浴中水浴5分鐘，最后加入Iml YEB培養(yǎng)液，28°C振蕩培養(yǎng)2h后，涂布于卡那霉 素抗性的LB平板上，28°C培養(yǎng)性培養(yǎng)至明顯的菌落出現(xiàn)。所得菌落即為重組農(nóng)桿菌。
[0050] 接種通過(guò)以上步驟獲得的重組農(nóng)桿菌單菌落到5ml YEB培養(yǎng)液中，添加卡那霉素 和鏈霉素，28°C培養(yǎng)過(guò)夜；按0. 1 %比例轉(zhuǎn)接到50ml YEB培養(yǎng)液中，添加卡那霉素和鏈霉 素，28°C 200rpm搖床培養(yǎng)過(guò)夜到OD = 0. 4-0. 8,離心收集菌體并用頂液重懸到2ml。
[0051] 從甘油管中接種寇氏隱甲藻ATCC30772(購(gòu)自廣東省微生物菌種保藏中心）到CA 培養(yǎng)基中。211：搖床150印111振蕩培養(yǎng)1周，得到種子液。然后10%比例接種到04、05培 養(yǎng)基中，分別于21°C、28°C振蕩培養(yǎng)3天，檢測(cè)光密度（OD)并鏡檢菌體活力。
[0052] 培養(yǎng)相同時(shí)間，發(fā)現(xiàn)菌體量CA28r= CA2rc> CS2rc> CS2rc,其中，CA28r表示在CA培 養(yǎng)基中于28°C培養(yǎng)，類(lèi)似的，CV e表示在CA培養(yǎng)基中于21°C培養(yǎng)，CVe、CS28d1ij表示在 CS培養(yǎng)基中于21°C、28°C培養(yǎng)。因此本發(fā)明預(yù)培養(yǎng)隱甲藻階段采用CA培養(yǎng)基，以便很方便 觀察隱甲藻是否生長(zhǎng)正常；篩選培養(yǎng)基使用CS，以形成更清晰的菌落。
[0053] 按10%比例，從種子液中轉(zhuǎn)接菌體到不同滲透壓的CA-I和CA-2培養(yǎng)基中進(jìn)行預(yù) 培養(yǎng)。這里所用CA-I和CA-2培養(yǎng)基中，葡萄糖、酵母粉、海鹽及pH條件同上述的CA培養(yǎng) 基，但通過(guò)硫酸鈉調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中的鹽分含量。CA-I和CA-2兩種培養(yǎng)基分別為額外添加了 0 和6. 6g/L的無(wú)水硫酸鈉，使得Na+的濃度分別為240和333mM，以設(shè)計(jì)不同的預(yù)培養(yǎng)滲透 壓。21°C搖床150rpm振蕩培養(yǎng)至ODL 0, 3000rpm離心10分鐘收集寇氏隱甲藻菌體并使用 IM液重懸到2ml。
[0054] 上述農(nóng)桿菌及隱甲藻菌液均需現(xiàn)用現(xiàn)制。分別取新鮮Iml寇氏隱甲藻和Iml重組 農(nóng)桿菌，混勻，50 μ 1/板涂布到M固體培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)16h。使用常見(jiàn)的玻璃三 角涂布棒，在2ml IM潤(rùn)洗作用下，刮洗共培養(yǎng)平板上的菌苔得到菌液，吸出菌液并使用IM 液補(bǔ)充到2ml，混勻后取50 μ 1涂布到CS選擇平板（含50 μ g/ml zeocin)，超凈臺(tái)上經(jīng)無(wú) 菌風(fēng)吹干平板表面后置28°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)1周都未出現(xiàn)抗性菌落。重復(fù)上述 農(nóng)桿菌、隱甲藻預(yù)培養(yǎng)、混勻共培養(yǎng)及篩選實(shí)驗(yàn)并檢查，發(fā)現(xiàn)隱甲藻的細(xì)胞壁似乎較薄，并 不像文獻(xiàn)中"厚"的描述，且對(duì)滲透壓敏感。顯微鏡檢查頂液處理的隱甲藻，發(fā)現(xiàn)有少量的 細(xì)胞在視野下發(fā)生崩解，因此常規(guī)頂液的滲透壓不適用于懸浮隱甲藻。
[0055] 重復(fù)上述農(nóng)桿菌、隱甲藻的預(yù)培養(yǎng)以及混勻共培養(yǎng)、篩選抗性菌落操作，但將頂 液更改為頂N液（7. 8g/L2-嗎啉乙磺酸，葡萄糖2g/L，甘油0. 6g/L，硫酸銨0. 5g/L，硫酸亞 鐵0· 0025g/L，氯化鈣0· 08g/L，硫酸鎂0· 25g/L，氯化鈉41g/L，磷酸氫二鉀2. 28g/L，磷酸 二氫鉀1.36g/L，pH5. 3)作為懸浮隱甲藻、農(nóng)桿菌菌體以及刮洗共培養(yǎng)平板的溶液（共培 養(yǎng)時(shí)依然涂布到IM固體培養(yǎng)基平板，該固體培養(yǎng)基未做改動(dòng)），共培養(yǎng)的時(shí)間為20h，所述 MN溶液中NaCl的摩爾濃度為0. 7M。轉(zhuǎn)化結(jié)果見(jiàn)表一所示，其中轉(zhuǎn)化效率=抗性菌落數(shù) 量XPCR檢測(cè)陽(yáng)性率+每平板上涂布的隱甲藻數(shù)量。
[0056] 表一農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化隱甲藻結(jié)果
[0057]

【權(quán)利要求】
1. 轉(zhuǎn)化寇氏隱甲藻（Crypthecodinium cohnii)的方法，其特征在于，所述方法包括以 下步驟： 在滲透壓調(diào)節(jié)劑的存在下懸浮寇氏隱甲藻及農(nóng)桿菌； 將完整的寇氏隱甲藻細(xì)胞與重組農(nóng)桿菌共培養(yǎng)；和 獲得農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的寇氏隱甲藻。
2. -種制備轉(zhuǎn)基因寇氏隱甲藻（Crypthecodinium)的方法，其特征在于，所述方法包 括在滲透壓調(diào)節(jié)劑的存在下，使用含有目標(biāo)基因的重組農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化完整的寇氏隱甲藻。
3. 權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述滲透壓調(diào)節(jié)劑選自鈉鹽、鎂鹽、鉀鹽、 鈣鹽或糖、醇類(lèi)有機(jī)物，優(yōu)選的，所述滲透壓調(diào)節(jié)劑選自氯化鈉、硫酸鈉、氯化鉀、硫酸鎂、氯 化鈣、葡萄糖和山梨醇。
4. 權(quán)利要求3的方法，其特征在于，所述滲透壓調(diào)節(jié)劑的濃度是100mM-700mM，優(yōu)選的， 所述滲透壓調(diào)節(jié)劑的濃度是200mM-400mM。
5. 權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述寇氏隱甲藻和/或所述農(nóng)桿菌經(jīng)預(yù)培 養(yǎng)處理，優(yōu)選的，所述寇氏隱甲藻和所述農(nóng)桿菌預(yù)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，更優(yōu)選的，所述寇氏隱甲 藻為預(yù)培養(yǎng)到對(duì)數(shù)初期的寇氏隱甲藻。
6. 權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，在寇氏隱甲藻細(xì)胞與農(nóng)桿菌共培 養(yǎng)時(shí)添加乙酰丁香酮。
7. 權(quán)利要求1-5的任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述寇氏隱甲藻選自ATCC30772、 ATCC40750、TEX L1649、ATCC30556、ATCC50051、UTEX L1649、RJH、CCMP316、ATCC50297、 ATCC30556;所述農(nóng)桿菌選自：根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens)EHA105、EHA101、 LBA4404、AGL-0、AGL-1、NT1、C58-Z707 和 GV3101: :pMP90。
8. 權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述方法還包括獲得農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化 的寇氏隱甲藻的步驟。
9. 一種用于寇氏隱甲藻轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基中包含滲透壓調(diào)節(jié)劑， 優(yōu)選的，所述滲透壓調(diào)節(jié)劑選自鈉鹽、鎂鹽、鉀鹽、鈣鹽或糖、醇類(lèi)有機(jī)物，更優(yōu)選的滲透壓 調(diào)節(jié)劑選自氯化鈉、硫酸鈉、氯化鉀、硫酸鎂、氯化鈣、葡萄糖和山梨醇。
10. 權(quán)利要求9所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述滲透壓調(diào)節(jié)劑的濃度是100mM-700mM， 優(yōu)選的，所述滲透壓調(diào)節(jié)劑的濃度是200mM-400mM。
【文檔編號(hào)】C12R1/89GK104293824SQ201310302810
【公開(kāi)日】2015年1月21日 申請(qǐng)日期:2013年7月15日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月15日
【發(fā)明者】戴小軍, 許駿, 蔡南海, 姜翠紅 申請(qǐng)人:豐益(上海)生物技術(shù)研發(fā)中心有限公司