人微小rna啟動子甲基化擴增及測序引物及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了人微小RNA啟動子甲基化擴增及測序引物及應用。一種人微小RNA啟動子甲基化擴增及測序引物，為Hsa-microRNA-145-5p啟動子區域存在高甲基化位點堿基序列的PCR擴增引物及焦磷酸定量甲基化測序的特異引物；所述的擴增引物包括3對，所述的甲基化測序檢測的特異引物包括miR-145-S2、miR-145-S5、miR-145-S4。本發明對喉鱗癌或者其他人類惡性腫瘤的篩查和風險評估、早期診斷、分期分型、預后判斷及治療監測具有重要的醫學價值及臨床意義。
【專利說明】人微小RNA啟動子甲基化擴增及測序引物及其應用
[0001]【技術領域】
本發明涉及一種人屬微小RNA,具體涉及Hsa-microRNA-145_5p (Hsa-miR-145_5p)啟動子區域甲基化位點堿基序列的PCR擴增引物及焦磷酸定量甲基化水平測序的特異性引物，這些引物在腫瘤或其他疾病研究中的應用。【背景技術】
頭頸鱗癌為全世界第六位高發腫瘤，位居歐洲男性高發腫瘤的第4位，而喉鱗癌(laryngeal squamous cell carcinoma, LSCC)源于喉黏膜上皮，發病率居頭頸鱗癌的第2位。據統計，目前全世界范圍內喉鱗癌發病略有上升，且年輕化趨勢逐漸顯現。
[0002]喉解剖結構局限且黏膜下淋巴管豐富，因此喉鱗癌具有局部侵襲及頸淋巴結轉移的惡性生物學特性，成為患者治療后復發及預后不良的重要風險因素，這也是近30年來喉鱗癌5年生存率并未有明顯提升的一個重要因素。在喉鱗癌侵襲轉移的過程中勢必伴有一些抑癌基因和/或癌基因的異常表達，如抑癌基因的下調表達，癌基因的上調表達。因此探索這些與喉鱗癌侵襲轉移相關的基因表達紊亂的分子生物學機制著重要的臨床意義。
[0003]microR NAs (miRNAs)是目前新發現的一類長度約為22nt的內源性非蛋白編碼單鏈小分子RNA，廣泛存在于真核生物中，它能夠與其相應靶基因信使RNA (mRNA)的3’端非翻譯區(3’ -UTR區)結合，從而降解mRNA或抑制其翻譯。研究表明miRNAs與腫瘤關系密切，充當癌基因或抑癌基因的角色，在腫瘤細胞生長、增殖、分化、凋亡、惡性間質轉化、干細胞分化等方面發揮重要作用。
[0004]甲基化是蛋白質和核酸的一種重要的修飾，與癌癥、衰老、老年癡呆等許多疾病密切相關，是表觀遺傳學的重要研究內容之一。DNA甲基化則是最常見的甲基化修飾方式之一，可引起染色質結構、DNA構象、DNA穩定性及DNA與蛋白質相互作用方式的改變，從而控制基因表達。其是指在DNA甲基轉移酶(DNA methyltransferase,DMT)的催化下，以s_腺苷甲硫氨酸(SAM)為甲基供體，將甲基轉移到特定的堿基上的過程。在哺乳動物中，DNA甲基化主要發生在5’ -CpG-3’的C上生成5-甲基胞嘧啶(5mC)。CpG是指由胞嘧啶(C)和鳥嘧啶(G)組成的一個2個核苷酸的鏈，當中的P是C和G之間的磷酸，在哺乳動物中CpG以兩種形式存在:一種是分散于DNA序列中；另一種呈現高度聚集狀態，人們稱之為CpG島(CpG island)，其是由胞嘧啶(C)和鳥嘧啶(G)組成的串聯重復序列，常位于CATbox附近，可以調控轉錄的效率。人類基因組中大小為IOO-1OOObp左右，富含CpG 二核苷酸的CpG島則總是處于未甲基化狀態，并且CpG島常位于轉錄調控區附近，與56%的人類基因組編碼基因相關，因此DNA甲基化能關閉某些基因的活性，去甲基化則誘導了基因的重新活化和表達。
[0005]由于DNA甲基化與人類腫瘤疾病的密切關系，特別是CpG島甲基化所致抑癌基因轉錄失活問題。以往研究表明大量抑癌基因CpG島的局部高度甲基化要早于細胞惡性增生，故其甲基化的檢測可用于腫瘤的預測、診斷、分級以及預后評估。因此抑癌基因轉錄區CpG島的甲基化狀態研究已經成為腫瘤領域中表觀遺傳學和表觀基因組學的重要研究內容。
[0006]發明人通過microRNA 芯片(Agilent human 8*15k mi RNA V12.0)檢測了喉鱗癌患者及同患者癌旁正常黏膜切緣蠟包埋組織中差異表達的microRNA分子，發現Hsa-miR-145-5p在喉鱗癌組織中比癌旁正常黏膜組織中下調了約2.74倍(P〈0.05);而Hsa-miR-145-5p表達水平與喉鱗癌患者不良臨床參數成負相關，且表達水平越低，喉鱗癌患者的預后越差。因此發明人結合Hsa-miR-145-5p啟動子甲基化的思路，探索喉鱗癌中Hsa-miR-145-5p轉錄抑制的分子生物學機制。
【發明內容】
[0007]本發明的目的是提供Hsa-microRNA-145-5p(Hsa-miR-145-5p)啟動子區域甲基化位點堿基序列的PCR擴增引物及焦磷酸定量甲基化水平測序的特異性引物。本發明的思路是:發明人基于microRNA芯片(Agilent human 8*15k miRNA V12.0)檢測了喉鱗癌患者及同患者癌旁正常黏膜切緣蠟包埋組織中差異表達的microRNA分子，發現Hsa-miR-145-5p在喉鱗癌組織中比癌旁正常黏膜組織中下調了約2.74倍(P〈0.05);而Hsa-miR-145-5p表達水平與喉鱗癌患者不良臨床參數成負相關，且表達水平越低，喉鱗癌低表達患者的預后不良越差。因此Hsa-miR-145-5p作為抑癌基因在喉鱗癌中發揮重要生物學作用。為此，本發明在于明確Hsa-miR-145-5p為何在喉鱗癌組織及細胞株H印-2、TU-177中表達減低，進一步結合DNA甲基化的思路，調取了 Hsa-miR-145-5p啟動子1425個堿基序列，并進行甲基化生物信息學預測，瞄定了 336個堿基中可能有11個高甲基化位點(CpG site)，根據這些堿基，設計了 3段PCR擴增引物，及相應的經亞硫酸鹽修飾后的焦磷酸定量測序引物，以明確這11個位點的甲基化水平，從而試圖闡明Hsa-miR-145-5p在喉鱗癌中轉錄抑制的表觀遺傳學機制。
[0008]本發明是通過以下技術方案實現的:
一種人微小RNA啟動子甲基化擴增及測序引物，其中所述的引物為Hsa-microRNA-145-5p啟動子區域存在高甲基化位點堿基序列的PCR擴增引物及焦磷酸定量甲基化測序特異引物；所述的PCR擴增引物包括3對，分別為miR-145-Fl:TTTGGTAGGAGATTGGGGAATAT, miR-145-Rl:Biotin-CTCTTCTACATCCAACCCCATCTA ；m i R -1 4 5 - F I:TTTGGTAGGAGATTGGGGAATAT, m i R -1 4 5 - R I:Biotin-CTCTTCTACATCCAACCCCATCTA ;miR-145_F2:GGGTTGGATGTAGAAGAGAATTT,miR-145-R2:Biotin-TTTCCAAAAATCCCCATCTTAA ;所述的焦磷酸定量甲基化測序特異引物包括 miR-145-S2:AGTTTTGGGGGTGGG ;miR-145_S5:TTATTTTTTTTGAGAGTAATAA ;miR-145_S4:TTAGTTGGTTTTTAGGGATA。
[0009]上述人微小RNA啟動子甲基化擴增及測序引物在制備用于喉鱗癌篩查和風險評估、早期診斷、分期分型、預后判斷及治療監測試劑盒中的用途，尤其應用于喉鱗癌離體組織或喉鱗癌細胞系ifep-2及TU-177中Hsa-microRNA-145-5p啟動子甲基化水平檢測。
[0010]本發明所述焦磷酸定量甲基化測序技術是指PyroMark CpG Assays技術，由QIAGEN公司研發,其是基于焦磷酸測序技術(Pyrosequencing)研發的CpG位點甲基化定量分析檢測體系。PyroMark CpG Assays基于引物延伸的Pyrosequencing技術,通過將鏈合成過程中釋放出的焦磷酸(PPi)轉化成光信號來監測鏈的合成過程，通過檢測CpG對應位點上C/T滲入的比例對 目標位點的甲基化程度進行定量分析，是目前最可靠的甲基化定量分析方法。[0011]與現有技術相比，其可以完全克服BSP法大量挑取單克隆測序的繁瑣及較高假陽性率，以及MSP法不能獲得定量分析結果的缺點。其具有檢測全面、檢測準確、檢測快速并能將甲基化水平定量化的優點。
[0012]本發明突出的實質特點和顯著的技術效果是:基于焦磷酸定量甲基化測序技術，利用甲基化生物信息學預測手段，針對Hsa-miR-145-5p啟動子區域1467堿基中可能存在11個高甲基化點的336個堿基區域。為此，本發明提供了三段特異性PCR引物及焦磷酸測序引物，有效檢測出這11個位點的甲基化定量水平，明確了喉鱗癌細胞系H印-2、TU-177中Hsa-miR-145-5p表達下調的表觀遺傳學機制。這無疑對喉鱗癌或者其他人類惡性腫瘤的篩查和風險評估、早期診斷、分期分型、預后判斷及治療監測具有重要的醫學價值及臨床意義。[0013]【專利附圖】
【附圖說明】
圖1:qRT-PCR 檢測 Hsa-miR-145-5p 在 Hep-2, TU-177 及對照株 HOK 中的表達；A:miR-145-5p在HOK中相對表達量為6.79 ± 1.29，分別高于其在H印-2中的相對表達量1.00(P=0.001)及在 TU-177 中的相對表達量 1.17±0.53 (P=0.002)；
圖2:Hsa-mir-145-5p啟動子甲基化位點預測結果I (通過MethPrimer -DNA甲基化CpG島預測及引物設計在線軟件預測)；
圖3:Hsa-mir-145_5p啟動子甲基化位點預測結果2 (通過CpG Island Searcher預
測)；
圖4:H印-2、TU-177及HOK三個細胞株11個位點的甲基化測序定量顯示圖。
[0014]圖5:H印-2、TU_177及HOK 11個位點甲基化水平曲線圖，灰色框所示為高甲基化的2-7位點；
圖6:H印-2、TU-177及HOK中11個位點甲基化平均水平柱狀圖；
圖7: Hep-2, TU-177及HOK中2_7位點甲基化平均水平柱狀圖；
圖8:實施例PCR反應條件。
【具體實施方式】
[0015]以下結合具體實施例對本發明做進一步說明。
[0016]一、實驗所需主要試劑、耗材及儀器
【權利要求】
1.一種人微小RNA啟動子甲基化擴增及測序引物，其特征在于，所述的引物為Hsa-miCiORNA-145-5p啟動子區域存在高甲基化位點堿基序列的擴增引物及焦磷酸定量甲基化測序的特異引物；所述的擴增引物為3對，包括miR-145-Fl:TTTGGTAGGAGATTGGGGAATAT, miR-145-Rl:Biotin-CTCTTCTACATCCAACCCCATCTA ；m i R -1 4 5 - F I:TTTGGTAGGAGATTGGGGAATAT, m i R -1 4 5 - R I:Biotin-CTCTTCTACATCCAACCCCATCTA ;miR-145_F2:GGGTTGGATGTAGAAGAGAATTT,miR-145-R2:Biotin-TTTCCAAAAATCCCCATCTTAA ;所述的焦磷酸定量甲基化測序特異引物包括 miR-145-S2:AGTTTTGGGGGTGGG, miR-145_S5:TTATTTTTTTTGAGAGTAATAA, miR-145_S4:TTAGTTGGTTTTTAGGGATA。
2.權利要求1所述的人微小RNA啟動子甲基化擴增及測序引物在制備用于喉鱗癌篩查和風險評估、早期診斷、分期分型、預后判斷及治療監測試劑盒中的應用。
3.權利要求1所述的人微小RNA啟動子甲基化擴增及測序引物應用于喉鱗癌離體組織或喉鱗癌細胞系ifep-2及TU-177中Hsa-microRNA-145-5p啟動子甲基化水平檢測。
【文檔編號】C12N15/11GK103571830SQ201310359969
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年8月16日 優先權日:2013年8月16日
【發明者】高偉, 王斌全, 張春明, 陳鋼鋼, 皇甫輝, 溫樹信, 張海利, 馮彥 申請人:山西醫科大學第一醫院