專利名稱：檢測細胞nkd2基因啟動子區dna甲基化狀態的引物對及試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種用于檢測細胞NKD2基因啟動子區甲基化狀態的引物對及試劑
品.ο
背景技術：
胃癌是人類最常見的消化道原發惡性腫瘤之一，在人類惡性腫瘤導致死亡的排位中居第二位，每年新增病例數超過600，000例，以日本、中國、東歐、南美為高發地區， 其中中國占到全世界胃癌發病例數的42% (Washington K :7th edition of the AJCC cancer staging manual stomach. Ann Surg Oncol 2010,17 :3077-3079 ；Parkin DM,Bray F, Ferlay J, Pisani P. Global cancer statistics,2002. CA J Clin.2005 ；5 :77-108 ； Juan Shang, AS Pena. Muhidisciplinary approach to underamnd the pathogenesis of gastric cancer. World J Gastroenterol, 2005,11 (27) :4131-4139.)。在我國男性、女性的胃癌死亡率均高于世界、發達及發展中國家的平均水平，男性居全世界排位中的第6位， 女性居第10位(段紀俊，陳萬青，張思維.中國惡性腫瘤死亡率的國際比較.中國社會醫學雜志 2009 年 12 月第洸卷第 6 期 Chinese Journal ofSocial Medicine,December2009, Vol. 26 (6) :377-378.)。胃癌起病隱襲，臨床癥狀往往不典型，病程的不同階段可出現不規律的腹痛、藥物不緩解、早飽、乏力、消瘦、便潛血陽性等癥狀。胃鏡檢查雖然能夠較直觀的觀測胃內粘膜病變，但最終診斷還是依賴于胃鏡下胃組織的病理活檢及手術標本的病理診斷。單純外科手術切除并不能取得滿意的臨床效果，目前手術切除為主的綜合治療后， M分期I期患者的5年生存率僅為60-70%，而III、IV期患者的5年生存率甚至不超
20% (Hundahl SA, Phillips JL, Menck HR. The National Cancer Data Base Report on poor survival of U. S. gastric carcinoma patients treated withgastrectomy Fifth Edition American Joint Committee on Cancer staging, proximal disease, and the "different disease"hypothesis. Cancer 2000，88 :921-932.)，因此胃癌預后不良。 多項大規模多中心對照研究均提示早診斷、早治療、尋求更為有效的化療藥物是提高胃癌生存率的有效措施。因此發現胃癌的早期診斷和治療的有效方法具有十分重要的意義。胃癌是嚴重危害人類健康的惡性腫瘤，目前由于尚缺乏早期診斷和治療的有效方法，病人預后常不良。因此針對胃癌的診斷和治療手段，尤其是對腫瘤的早期診斷、殘留病灶及復發的檢測方法仍然十分有限，是目前迫切需要解決的問題。近年來，表觀遺傳學(Epigenetics)已逐漸成為生命科學研究領域的前沿和熱點。表觀遺傳學是相對于遺傳學而言的，其定義是指研究不依賴于DNA序列改變的可遺傳的基因表達變化的科學。表觀遺傳學概念的提出可以解釋部分經典遺傳學所不能解釋的問題如同卵雙生的雙胞胎具有完全相同的基因型，并在相同環境下成長，但僅其中一人罹患腫瘤，而另一人身體健康，因此表觀遺傳改變為這一現象提供了合理的解釋。在腫瘤研究中，表觀遺傳學研究的范疇主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾和非編碼RNA調控。DNA甲
3基化是表觀遺傳學調控的主要方式，基因啟動子區CpG島的高甲基化或全基因組范圍的低甲基化可以導致腫瘤。DNA甲基化是指在甲基化轉移酶作用下，以S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體，將甲基轉移到CG 二核苷酸胞嘧啶的5號碳原子上，形成5-甲基胞嘧啶。DNA甲基化改變可以是細胞癌變過程中的早期、頻發事件，因此特定基因的異常甲基化往往可以作為腫瘤早期診斷的分子標志物、治療靶點和預后判斷的手段等。近年來甲基化檢測手段不斷豐富，目前主要包括兩大類一是亞硫酸氫鈉法(Sodium Bisulfite)，包括亞硫酸氫鈉法依賴的基因測序法、亞硫酸氫鈉聯合限制性內切酶分析法(COBRA)、甲基化特異性 PCR(Methylation Specific PCR，MSP)、甲基化敏感的單核苷酸擴增法(Ms-SNuE)等；另一類是甲基化敏感的限制性內切酶法，包括Southern法、甲基化敏感的限制性圖譜(MSRF)、 限制性標記基因組掃描技術(RLGQ、差異性甲基化雜交分析(DMH)、甲基化CpG島擴增子分析(MCA)等。特別是 1996 年 Herman 等(Herman JG, Graff JR, Myohanen S, Nelkin BD, Baylin SB. Methylation-specific PCR :a novel PCR assay for methylation status of CpG islands. Proc Nafl Acad Sci USA 1996 ；93 (18) :9821-9826.)發明了甲基化特異性 PCR(Methylation Specific PCR,MSP)技術后，優化了 DNA甲基化的檢測方法，其突出優點在于高特異性、高靈敏度、操作簡便、費用及耗時均較少、不受限制性內切酶的限制。MSP的基本原理是DNA經過亞硫酸鹽硫化修飾后，CpG島上沒有發生甲基化的CG二核苷酸中的胞嘧啶就轉化為尿嘧啶，最后轉化為胸腺嘧啶，而發生甲基化的胞嘧啶則保持不變，因此設計甲基化引物及非甲基化引物，分別進行PCR擴增，產物進行凝膠電泳分析結果，得出是否為甲基化的結論。果蠅裸角質層基因(Naked Cuticle, NKD)于 1992 年由 Monnie 等(Monnier D, Colas JF,Rosay P, Hen R, Borrelli E, Maroteaux L. NKD,a developmentally regulated tachykinin receptor in Drosophila. J Biol Cheml992 ；267 (2) : 1298—1302.)首次發現， 后逐漸被證實其是經典WNT/^-catenin信號通路的拮抗分子(Zeng，W.，Wharton, K. Α.， Jr. , Mack, J. Α., Wang, K. , Gadbaw, Μ. , et al. Naked cuticle encodes an inducible antagonist of Wnt signalling. Nature 2000 ；403, 789-795) 哺乳動物 NKD 基因直接與 Dishevelled作用、并在細胞內對Dishevelled介導的多種WNT信號通路發揮自主作用(Yan D,Wallingford JB,Sun TQ,Nelson AM,Sakanaka C,Reinhard C,et al. Cell autonomous regulation of multiple Dishevelled-dependent pathways by mammalian Nkd. Proc Natl Acad Sci USA 2001 ；98(7) :3802-3807)。裸角質層同系物 2 (naked cuticle homolog 2，NKD2)，也被稱為Naked2，是NKD家族的一個451氨基酸的細胞膜蛋白。NKD2通過與 DVl-l、Dvl-2、Dvl-3和PP2A-B72/B130的相互作用，對經典WNT信號通路有拮抗作用；另一方面，由于影響平面細胞極性(planar cell polarity,PCP)對非經典WNT信號通路也有作用。離02結合在16 (1胞漿尾端的底外側分選基序上。TGF α的加工需要NKD2參與，并且離02護送了6 0到極化的上皮細胞的底外側細胞膜上(Li C，Franklin幾，Graves-Deal R, Jerome WG, Cao Ζ, Coffey RJ. Myristoylated Naked2 escorts transforming growth factor α to the basolateral plasma membrane of polarized epithelial cells.Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2004 ；101 :5571-5576.)。人源 NKDl 和 NKD2 基因具有與果蠅 NKD 基因保守的EFX結構域，其包括假定的EF手性序列和側翼序列。EFX是果蠅或脊椎動物NKD分別作用于果蠅Dsh的基礎結構域或脊椎動物Dvl的PDZ結構域(Wharton ΚΑ, Jr. ,ZimmermannG, Rousset R, Scott MP. Vertebrate proteins related to Drosophila Naked Cuticle bind Dishevelled and antagonize Wnt signaling. Dev Biol2001 ；234(1) :93_106·)。巨前NKD2基因在人類腫瘤包括胃癌中的表觀遺傳學改變及功能的研究尚未見報道。本發明人應用甲基化特異性PCR(MSP)方法率先對胃癌細胞系及腫瘤組織進行檢測，首次發現細胞NKD2基因呈高甲基化狀態，預實驗結果提示細胞NKD2基因可能是胃癌中新的抑癌基因，此外細胞NKD2基因的啟動子區高甲基化狀態可能是一個嶄新的腫瘤分子標記物。在此基礎上，本發明人應用MSP方法對大量胃癌腫瘤組織標本以及正常的胃組織標本進行檢測，以明確細胞NKD2基因啟動子區甲基化狀態。

發明內容
本發明的目的是提供一種檢測細胞NKD2基因啟動子區甲基化狀態的引物對，即用于檢測細胞NKD2基因啟動子區甲基化和非甲基化狀態的一對特異性引物對，其包括甲基化引物和非甲基化引物，同時本發明還提供一種含有上述甲基化引物或非甲基化引物的試劑盒。本發明提供一種用于檢測細胞NKD2基因啟動子區甲基化狀態的引物對，包括甲基化引物和非甲基化引物，其中，所述甲基化引物的上游引物核苷酸序列為5’ -GATCGTAGGGGATAGTTTCGTGGC-3’，下游引物核苷酸序列為 5’ -AAAACAACTCTAACACCGCTCCCCG-3’ ；所述非甲基化引物的上游引物核苷酸序列為5’ -TGG ATTGTAGGGGATAGTTTTGTGGT-3，，下游引物核苷酸序列為5，-CAAAAACAACTCTAACACCACTCCCC A-3，。本發明還提供一種用于檢測胃癌細胞的試劑盒，其中，該試劑盒含有上述甲基化引物或非甲基化引物。本發明具有如下優點利用本發明所述引物對及試劑盒檢測胃組織細胞，在胃癌細胞中NKD2基因啟動子區呈高甲基化狀態，甲基化率為46%，而在正常胃組織中，NKD2基因啟動子區呈非甲基化狀態，表明該基因啟動子區的甲基化狀態對于胃癌細胞具有特異性；同時應用本發明所述引物對及試劑盒可使檢測胃癌細胞的靈敏度達到0.5%，S卩1000 個細胞中有5個甲基化的細胞就能夠被檢測出，這說明NKD2基因啟動子區甲基化狀態可作為胃癌中新的分子標志。本試劑盒首次選用細胞NKD2基因作為目標基因，該基因是本發明人應用MSP技術率先在胃癌中篩選出的啟動子區呈高甲基化狀態的基因，具有首創性。因此，應用本發明引物及試劑盒來檢測細胞NKD2基因啟動子區高甲基化狀態可作為胃癌診斷、療效觀察、預后判斷、殘留病灶及復發檢測等的有力手段，而且，操作簡便、穩定性好，具有深遠的臨床意義和推廣性。


圖1以硫化修飾后的正常胃組織細胞DNA(非甲基化對照)、硫化修飾后的胃癌 BGC823細胞系DNA(甲基化對照)和ddH20(系統對照)建立對照體系，分別用甲基化引物及非甲基化引物對胃癌組織標本進行MSP檢測，擴增產物瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖所
7J\ ο圖2以硫化修飾后的正常胃組織細胞DNA(非甲基化對照)、硫化修飾后的胃癌 BGC823細胞系DNA(甲基化對照)和ddH20(系統對照)建立對照體系，分別用甲基化引物及非甲基化引物對正常胃組織標本進行MSP檢測，擴增產物瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖所示。圖3將胃癌BGC823細胞系DNA(NKD2基因啟動子區100%甲基化)與正常胃組織細胞DNA(NKD2基因啟動子區100%非甲基化)按比例混合，進行硫化修飾，此后用甲基化引物進行擴增，擴增產物電泳結果如圖所示。
具體實施例方式經過反復的試驗與推敲，本發明人選出一對特異性很好的甲基化及非甲基化的引物對，應用瓊脂糖凝膠電泳技術作為結果的檢出手段，得到了可靠的實驗結果。實驗結果表明NKD2基因啟動子區的高甲基化狀態在人類胃癌中具有較高的檢測特異性及靈敏性。利用所述引物對及試劑盒檢測細胞NKD2基因甲基化狀態的靈敏度高，解決了上述現有技術中其他方法的檢出率低、結果不易分析、臨床難以推廣等一系列技術問題，因此本發明所述的引物對及試劑盒可用于胃癌的早期診斷、療效判定、殘留病灶及復發的檢測等。本發明提供的用于檢測細胞NKD2基因啟動子區甲基化狀態的引物對，包括甲基化引物和非甲基化引物，其中，所述甲基化引物的上游引物核苷酸序列如I^rimer-MF 所述，艮P :5’ -GATCGTAGGGGATAGTTTCGTGGC-3，，下游引物核苷酸序列如 Primer-MR 所述， 即5 ’ -AAAACAACTCTAACACCGCTCCCCG-3 ’；所述非甲基化引物的上游引物核苷酸序列如 I^rimer-UF 所述，即5，-TGGATTGTAGGGGATAGTTTTGTGGT-3，，下游引物核苷酸序列如 Primer-UR 所述，即5，-CAAAAACAACTCTAACACCACTCCCCA-3，。利用上述甲基化引物，以硫化修飾后的DNA為模板進行MSP擴增，如果NKD2基因啟動子區存在甲基化，則會得到162bp大小的片段；如果NKD2基因未發生甲基化，則不產生擴增產物。基于此，本申請將該引物稱為甲基化引物。所述甲基化引物，其上游引物的 1^63.68，6(含量54. 17% ；下游引物的 Tm 63. 62，GC 含量 52. 0%。利用上述非甲基化引物，以硫化修飾后的DNA為模板進行MSP擴增，如果NKD2基因未發生甲基化，則會得到166bp大小的片段。基于此，本申請將該引物稱為非甲基化引物。所述非甲基化引物，其上游引物的Tm 60.42，GC含量42.31 % ；下游引物的Tm 62.0， GC 含量 44. 44%。本發明提供的用于檢測胃癌細胞的試劑盒含有上述甲基化引物或非甲基化引物。進一步地，本發明的試劑盒還含有甲基化對照MSP模板，該模板為硫化修飾后的細胞NKD2基因啟動子區為100%甲基化的癌細胞DNA。在此，對該癌細胞沒有特別的限制，只要滿足“硫化修飾后的細胞NKD2基因啟動子區100%甲基化”即可，例如可以為胃癌 BGC823細胞等。進一步地，本發明的試劑盒還含有非甲基化對照MSP模板，該模板為硫化修飾后的細胞NKD2基因啟動子區為100%非甲基化的正常細胞DNA。在此，對該正常細胞沒有特別的限制，只要滿足“硫化修飾后的細胞NKD2基因啟動子區100%非甲基化”即可，例如可以為正常胃組織細胞等。進一步地，本發明的試劑盒還含有作為雙陰性系統對照的ddH20。進一步，本發明的試劑盒還含有MSP反應所需的下列成分50mMMgCl2，10XMSP buffer,IOmM dNTP mixture, Hot start Taq 酶。
為更詳細地了解本發明，以下通過實施例對本發明作進一步的闡述。實施例一1、模板的制備(基因組DNA的提取及硫化修飾過程)DNA的制備獲取胃癌組織標本以及正常胃組織標本。在本實施例中各取6個胃癌組織標本(GCl GC6)，5個正常胃組織標本(NmGl NmG5)。應用酚-氯仿抽提的方法分別對上述樣本進行基因組DNA提取，紫外分光光度儀測定吸光度(A)值確定其含量及純度。亞硫酸鹽修飾參考herman(J. G. Herman, J. R. Graff, S. Myohanen, B. D. Nelkin and S.B.Baylin, Methylation-specific PCR :a novel PCR assay for methylation status of CpG islands, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (1996)，9821-9擬6.)等報道的方法。取上述制備的基因組DNA，經稀釋后精確取2ugDNA，加去離子水至終體積50ul，加入新鮮配制的3M的NaOH 5ul，37°C孵育25min。之后加入新鮮配制的IOmM的氫醌30ul及3M 亞硫酸氫鈉520ul混合均勻(其內已加入新鮮配制的3M的NaOH，計算方法10ml 3M亞硫酸氫鈉中加入3M的NaOH 740ul)，50°C孵育16h，此后應用DNA純化試劑盒(Promega公司產品)純化并回收DNA，應用50ul去離子水洗脫DNA，向其內加入5ul 3M的NaOH以終止硫化修飾，用3倍體積的無水乙醇沉淀DNA，最終硫化修飾后的DNA重新溶解在20ul去離子水中，得到DNA模板，立即使用或-20°C保存備用。2、MSP 擴增以甲基化引物進行擴增的MSP反應體系，以總體積25ul計，包括模板(硫化修飾后的DNA) :2ul ；甲基化引物(50pmol/ul)上游引物(5，-GATCGTAGGGGATAGTTTCGTGGC-3，)0. 5ul,下游引物(5，-AAAACAACTCTAACACCGCTCCCCG-3，)0.5ul ；50mM MgCl2(Invitrogen 公司):0. 75ul ；10XMSP buffer (緩沖液，Invitrogen 公司):2. 5ul ；IOmM dNTP mixture (Invitrogen ^W] ) :1. 25ul ；Hot start Taq 酶(Invitrogen 公司，濃度為 5U/μ L) :0. Iul ；ddH20 :17. 4ul以非甲基化引物進行擴增的MSP反應體系與以甲基化引物進行擴增的MSP反應體系的不同之處僅在于引物不同。具體地，以非甲基化引物進行擴增的MSP反應體系，以總體積25ul計，包括非甲基化引物(50pmol/ul)上游引物(5，-TGGATTGTAGGGGATAGTTTTGTGGT-3，)0. 5ul,下游引物(5，-CAAAAACAACTCTAACACCACTCCCCA-3，)0. 5ul ；其余組分及其用量均與以甲基化引物進行擴增的MSP反應體系中的相同。以上僅分別列舉了以甲基化引物和非甲基化引物進行擴增的MSP反應體系中各組分的用量的一個例子，使用不同公司生產的MgCl2、MSP buffer緩沖液、dNTP mixture,Hot start Taq酶時，反應體系中各組分的用量會有所不同，可以根據實際需要進行調整。本發明對MSP反應體系中各組分的用量沒有特別的限制，使用常規的用量即可。
應用上述MSP反應體系對已制備的DNA模板(6個胃癌組織標本GCl GC6，5個正常胃組織標本NmGl NmG5)分別進行擴增，并以胃癌BGC823細胞系DNA為甲基化對照，以正常胃組織標本(NG)為非甲基化對照，以ddH20作為雙陰性的系統對照，擴增程序為95°C 預變性5min，接著進入循環，在95°C下變性30s，在62°C下退火30s，在72°C下延伸40s，共 35個循環，之后，繼續在72°C下延伸5min。3. MSP反應產物的檢測MSP產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外透射分析儀檢測并照相。4.結果圖1以硫化修飾后的正常胃組織細胞DNA(非甲基化對照)、硫化修飾后的胃癌 BGC823細胞系DNA(甲基化對照)和ddH20(系統對照)建立對照體系，分別用甲基化引物及非甲基化引物對胃癌組織標本進行MSP檢測，擴增產物瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖所不。圖中，GC1、GC2、GC3、GC4、GC5和GC6分別代表胃癌組織標本；BGC823為M陽性的胃癌細胞系，此處作為甲基化對照；ddH20為雙陰性的系統對照，用以評估體系是否存在PCR產物的污染，如ddH20檢測的結果為雙陰性(M和U均為陰性)，則體系結果可信；NG為U陽性的正常胃組織標本，此處作為非甲基化對照。U代表非甲基化結果；M代表甲基化結果；Marker為DL2000 marker (分子量標準)，上下兩條帶分別代表200bp和IOObp ；本體系擴增產物大小，U帶為166bp，M帶為162bp。圖2以硫化修飾后的正常胃組織細胞DNA(非甲基化對照)、硫化修飾后的胃癌 BGC823細胞系DNA(甲基化對照)和ddH20(系統對照)建立對照體系，分別用甲基化引物及非甲基化引物對正常胃組織標本進行MSP檢測，擴增產物瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖所示。圖中，NmGl、NmG2、NmG3、NmG4和NmG5為正常胃組織標本5例；BGC823為M陽性的胃癌細胞系，此處作為甲基化對照；ddH20為雙陰性的系統對照，用以評估體系是否存在PCR產物的污染，如ddH20檢測的結果為雙陰性(M和U均為陰性)，則體系結果可信；NG為U陽性的正常胃組織標本，此處作為非甲基化對照。U代表非甲基化結果；M代表甲基化結果； Marker為DL2000 marker (分子量標準)，上下兩條帶分別代表200bp和IOObp ；本體系擴增產物大小，U帶為166bp，M帶為162bp。結果判讀方法如下應用甲基化引物(圖中以M表示)進行擴增，有擴增產物，并且應用非甲基化引物 (圖中以U表示)進行擴增，無擴增產物的標本則判讀為完全甲基化結果；應用甲基化引物及非甲基化引物進行擴增，均有擴增產物的標本判讀為部分甲基化結果；應用非甲基化引物進行擴增，有擴增產物，并且用甲基化引物進行擴增，無擴增產物的標本則判讀為非甲基化結果。
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部分甲基化及完全甲基化的標本均判讀為甲基化結果。如圖1所示，胃癌組織中，GCl、GC3和GC4為非甲基化結果，GC2、GC5和GC6為甲基化結果。如圖2所示，正常胃組織(NmGl、NmG2、NmG3、NmG4和NmG5)均為非甲基化結果。 對照體系反應正常，結果可信。實施例二臨床標本檢測取112例胃癌組織標本和5例正常胃組織標本，進行MSP擴增，模板制備、MSP擴增體系及條件、擴增產物的檢測均與實施例一中的相同，檢測結果請見下表1 表權利要求
1.一種用于檢測細胞NKD2基因啟動子區甲基化狀態的引物對，包括甲基化引物和非甲基化引物，其中，所述甲基化引物的上游引物核苷酸序列為5，-GATCGTAGGGGATAGTTTCGTGGC-3，，下游引物核苷酸序列為 5’ -AAAACAACTCTAACACCGCTCCCCG-3’ ；所述非甲基化引物的上游引物核苷酸序列為5’ -TGG ATTGTAGGGGATAGTTTTGTGGT-3，，下游引物核苷酸序列為5，-CAAAAACAACTCTAACACCACTCCCC A-3，。
2.一種檢測胃癌細胞的試劑盒，其特征在于含有權利要求1中所述的甲基化引物或非甲基化引物。
3.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于還含有甲基化對照MSP模板，該模板為硫化修飾后的細胞NKD2基因啟動子區100%甲基化的癌細胞DNA。
4.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于還含有非甲基化對照MSP模板，該模板為硫化修飾后的細胞NKD2基因啟動子區100%非甲基化的正常細胞DNA。
5.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于還含有作為雙陰性系統對照的ddH20。
6.根據權利要求2至5任一項所述的試劑盒，其特征在于還含有MSP反應所需的下列成分50mM MgCl2,10XMSP buffer, IOmMdNTP mixture, Hot start Taq 酶。
全文摘要
本發明提供用于檢測細胞NKD2基因啟動子區甲基化狀態的引物對及試劑盒。本試劑盒首次選用細胞NKD2基因作為目標基因，該基因是本發明人應用MSP技術率先在胃癌細胞系及腫瘤組織中篩選出的啟動子區呈高甲基化狀態的基因，具有首創性。利用本發明所述試劑盒及特異性引物對檢測胃癌腫瘤組織甲基化狀態的特異性好，可達到46％；靈敏度高，達到5‰，即1000個細胞中有5個甲基化的細胞就能夠被檢測出。應用本發明試劑盒來檢測細胞NKD2基因啟動子區高甲基化狀態可作為胃癌診斷、療效觀察、預后判斷、殘留病灶及復發檢測等的有力手段，而且，操作簡便、穩定性好，具有深遠的臨床意義和推廣性。
文檔編號C12Q1/68GK102517400SQ20121000877
公開日2012年6月27日 申請日期2012年1月12日 優先權日2012年1月12日
發明者楊云生, 賈巖, 郭亞軍, 郭明洲, 韓為東 申請人:中國人民解放軍總醫院