溶瘤型新城疫病毒D90株的全長感染性 cDNA及其構建方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了溶瘤型新城疫病毒D90株的全長感染性cDNA及其構建方法和應用。所述溶瘤型新城疫病毒D90株的全長感染性cDNA可以與輔助質粒組成反向遺傳操作系統。該感染性cDNA及其反向遺傳操作系統可用于拯救具有溶瘤功能的新城疫病毒，本發明為研究新城疫病毒的溶瘤功能及其分子機制、開發抗腫瘤基因工程治療等奠定了實驗基礎。
【專利說明】溶瘤型新城疫病毒D90株的全長感染性cDNA及其構建方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及單股負鏈RNA病毒的感染性克隆，尤其涉及具有溶瘤功能的新城疫病毒感染性cDNA及其構建方法和應用，本發明由該新城疫病毒感染性cDNA、微基因組及其輔助質粒所組成的新城疫病毒反向遺傳操作系統。
【背景技術】
[0002]新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)屬副粘病毒科禽腿腺炎病毒屬的成員，為單股負鏈RNA病毒，其基因組RNA全長約15kb。RNA基因組在3’末端為55個核苷酸的前導序列，5'末端為114個核苷酸的尾隨序列，這兩個序列對病毒的轉錄和復制都至關重要。病毒的六個基因RNA的順序依次為3’ -NP-P-M-F-HN-L-5’。新城疫病毒的這六個基因編碼主要的六種結構蛋白:核衣殼蛋白(Nucleocapsid protein, NP)、磷蛋白(Phosphateprotein, P)、基質蛋白(Matrix protein, Μ)、融合蛋白(Fusion protein, F)、血凝素神經氨酸酶(Hemagglutinin Neuraminidase protein, HN)和 RNA 聚合酶(Large RNA-dependentRNA polymerase protein, L)。P基因的RNA編輯產生另外兩個非結構蛋白V和W(Mebatsionet al., 2001; Steward et al.，1993)。病毒基因組RNA和NP、P、L共同形成核糖核蛋白復合體(RNP)，RNP能夠作為RNA轉錄和復制的模板，是病毒具有功能活性的最小感染單位(Hamaguchi et a1., 1983)。
[0003]腫瘤治療的最終目的是在對健康細胞不產生明顯損傷的條件下清除癌癥細胞。多種溶瘤型病毒已經被鑒定和并對其潛在的抗腫瘤功能、特異性、效果和安全性進行檢測。在眾多溶瘤病毒中，新城疫病毒已經被認為是有希望的溶瘤制劑被作為實驗治療應用于臨床已40余年。一些臨床試驗表明NDV是安全有效的治療制劑。新城疫病毒現已成為臨床評估作為溶瘤、基因及免疫刺激治療載體的五種病毒之一，極具開發價值。
[0004]反向遺傳操作系統是在分子水平研究病毒的重要工具之一。通過在DNA水平上對RNA病毒基因組進行各種體外人工操作，如進行基因突變、基因缺失、基因插入、基因替換和基因互補(構建嵌合病毒)等改造，以解決對RNA病毒基因組難以操作這一難題，極大地方便了人們在分子水平上研究病毒基因的功能及其具有的生物學特性的分子機制。
[0005]研究表明，新城疫病毒溶瘤株73-T可以殺死多種人癌癥細胞。在裸鼠模型中，腫瘤內注射73-T能明顯抑制多種異種移植的腫瘤，包括纖維肉瘤和神經膠質瘤。溶瘤型MTH-68株能明顯部分或全部抑制癌細胞轉移型腫瘤。一期臨床試驗表明，溶瘤新城疫PV701株具有廣譜的抗腫瘤功能。

【發明內容】

[0006]本發明的目的之一在于提供一種具有溶瘤作用的新城疫病毒D90株的全長感染性 cDNAo
[0007]所述溶瘤型新城疫病毒的全長感染性cDNA克隆與親本新城疫D90株天然序列(SEQ ID NO:1所示)相比，缺失掉一個KpnI酶切位點，僅具有單一 KpnI酶切位點是全長感染性cDNA克隆的分子標簽。
[0008]本發明的溶瘤型新城疫病毒D90株的全長感染性cDNA，其特征在于:所述的全長感染性cDNA序列為SEQ ID NO: 2所示。
[0009]本發明的目的之二在于提供一種構建所述的溶瘤型新城疫病毒D90株的全長感染性cDNA的方法，包括:
[0010]I)以新城疫病毒D90株的RNA為模板，分11段擴增D90株基因組，進行全基因組序列測定，得到的新城疫D90株病毒的全基因組序列如SEQ ID NO:1所示；
[0011]2)通過RT-PCR方法獲得新城疫病毒D90株基因組各部分的4個片段，將所擴增的PCR片段采用同源重組的方法組裝克隆到質粒載體中，構建帶有溶瘤型新城疫病毒的全長感染性cDNA的質粒載體。
[0012]其中所述的新城疫病毒D90株(新城疫病毒D90株對肺癌A549細胞的抑制作用，符芳等，《中國預防獸醫學報》，2007年02期)由中國農業科學研究哈爾濱獸醫研究所豬傳染病室豬病分子診斷組分離并保存。
[0013]在本發明中，優選的，所述的全長感染性cDNA的序列如SEQ ID NO:2所示，與SEQID NO:1所示的親本新城疫D90株天然序列相比,其缺失掉一個KpnI酶切位點。
[0014]在本發明中，優選的，所述的質粒載體為加入T7啟動子、核酶和T7終止子的PBR322 載體。
[0015]本發明的目的之三在于提供一種溶瘤新城疫病毒反向遺傳操作系統，其特征在于:該溶瘤型新城疫病毒反向遺傳操作系統包括包含本發明所述的溶瘤型新城疫病毒D90株的全長感染性cDNA的質粒載體和三個輔助質粒，其中所述的三個輔助質粒是將溶瘤型新城疫病毒D90株核蛋白NP，磷蛋白P和聚合酶蛋白L基因的開放閱讀框ORF cDNA分別克隆在pC1-neo載體T7啟動子下游的多克隆位點構建得到的。
[0016]在本發明中，優選的，所述溶瘤型新城疫病毒D90株核蛋白NP基因的開放閱讀框ORF cDNA如SEQ ID N0:3所示，溶瘤型新城疫病毒D90株磷蛋白P基因的開放閱讀框ORFcDNA如SEQ ID NO:4所示，溶瘤型新城疫病毒D90株聚合酶蛋白L基因的開放閱讀框ORFcDNA 如 SEQ ID NO:5 所示。
[0017]本發明的目的之四在于提供所述全長感染性cDNA在拯救新城疫病毒中的應用，其包括將所述的全長感染性cDNA和三個輔助質粒共轉染哺乳動物細胞，拯救得到新城疫病毒，其中所述的三個輔助質粒是將溶瘤型新城疫病毒D90株核蛋白NP，磷蛋白P和聚合酶蛋白L基因的開放閱讀框ORF cDNA分別克隆在pC1-neo載體T7啟動子下游的多克隆位點構建得到的。
[0018]在本發明中，優選的，溶瘤型新城疫病毒D90株核蛋白NP基因的開放閱讀框ORFcDNA如SEQ ID NO: 3所示，溶瘤型新城疫病毒D90株磷蛋白P基因的開放閱讀框ORF cDNA如SEQ ID N0:4所示，溶瘤型新城疫病毒D90株聚合酶蛋白L基因的開放閱讀框ORF cDNA如 SEQ ID NO:5 所示。
[0019]在本發明中，優選的，所述的哺乳動物細胞為BHK-21細胞。
[0020]本發明的目的之四在于提供所述的反向遺傳操作系統在拯救新城疫病毒中的應用。[0021]實驗表明，利用本發明所構建的溶瘤型新城疫病毒的全長感染性cDNA可以成功拯救出溶瘤型新城疫病毒。
[0022]本發明的感染性cDNA的成功構建將為研究溶瘤型新城疫病毒提供一個有力的基因操作技術平臺，方便對新城疫病毒度基因組的操作。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1為D90全長cDNA質粒KpnI單酶切結果；
[0024]M =Marker DL15, 000 ；1:D90全長質粒;2:D90全長質粒KpnI單酶切產物;
[0025]圖2為微基因組及輔助質粒功能驗證結果；
[0026]A:D90minigenome 和輔助質粒 pC1-NP、pCI_P、pC1-L ；B:D90minigenome
[0027]圖3:拯救病毒F1、F5 和FlO代分子標簽測序結果；
[0028]圖4拯救病毒和親本病毒在雞胚成纖維細胞CEF上的生長動力學曲線；
[0029]圖5MTT法檢測拯救病毒的溶瘤特性；
[0030]圖6為pBR322-THT載體圖譜。
【具體實施方式】
[0031]下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。
[0032]實施例1:D90株全基因組序列測定
[0033]1、生物材料準備:
[0034]新城疫病毒D90株(新城疫病毒D90株對肺癌A549細胞的抑制作用，符芳等，《中國預防獸醫學報》，2007年02期)由中國農業科學研究哈爾濱獸醫研究所豬傳染病室豬病分子診斷組分離并保存。
[0035]用包含NDV F裂解位點的引物4501-6484U/4501-6484L擴增，經序列比對，結果表明，D90株F裂解位點具有強毒R-R-Q-K-R-F-1序列特征，因此，根據NDV強毒序列設計如表I所示引物，擴增D90株全基因組序列。
[0036]2、病毒的純化
[0037]采用SPF雞胚有限稀釋純化的方法純化NDV D90病毒。首先測定D90的HA，將病毒連續梯度稀釋后取最高稀釋倍數的稀釋液接種SPF雞胚(IOOul/枚)，棄掉24小時內死亡的雞胚，每隔3天收獲雞胚尿囊液測定HA，再用同樣方法連續稀釋病毒純化3代，收獲的第3代病毒尿囊液作為種毒用于全基因組序列的測定。
[0038]3、病毒RNA的提取、反轉錄和RT-PCR
[0039]取D90病毒尿囊液，按照QiagenRNA提取試劑盒說明書提取基因組RNA，之后用Promega M-MLV反轉錄酶反轉錄后獲得cDNA,用Primer Star高保真DNA聚合酶PCR擴增PCR產物，每個片段做三個反應，之后PCR產物用純化試劑盒或膠收試劑盒按照說明書純化。純化后的PCR反應產物送北京華大基因公司測序。所用PCR擴增引物見表1:
[0040]表1:D90全基因組測序引物
【權利要求】
1.溶瘤型新城疫病毒D90株的全長感染性CDNA，其特征在于:所述的全長感染性CDNA序列為SEQ ID N0:2所示。
2.—種構建權利要求1所述的溶瘤型新城疫病毒D90株的全長感染性cDNA的方法，包括: O以新城疫病毒D90株的RNA為模板，分11段擴增D90株基因組，進行全基因組序列測定，得到的新城疫D90株病毒的全基因組序列如SEQ ID NO:1所示； 2)通過RT-PCR方法獲得新城疫病毒D90株基因組各部分的4個片段，將所擴增的PCR片段采用同源重組的方法組裝克隆到質粒載體中，構建帶有溶瘤型新城疫病毒的全長感染性cDNA的質粒載體。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于所述的全長感染性cDNA的序列如SEQIDNO: 2所示，與SEQ ID NO:1所示的親本新城疫D90株天然序列相比，其缺失掉一個KpnI酶切位點。
4.如權利要求2或3所述的方法，其特征在于所述的質粒載體為加入T7啟動子、核酶和T7終止子的 pBR322載體。
5.一種溶瘤型新城疫病毒反向遺傳操作系統，其特征在于:該溶瘤型新城疫病毒反向遺傳操作系統包括包含權利要求1所述的溶瘤型新城疫病毒D90株的全長感染性cDNA的質粒載體和三個輔助質粒，其中所述的三個輔助質粒是將溶瘤型新城疫病毒D90株核蛋白NP，磷蛋白P和聚合酶蛋白L基因的開放閱讀框ORF cDNA分別克隆在pC1-neo載體T7啟動子下游的多克隆位點構建得到的。
6.如權利要求5所述的反向遺傳操作系統，其特征在于:溶瘤型新城疫病毒D90株核蛋白NP基因的開放閱讀框ORF cDNA如SEQ ID NO: 3所示，溶瘤型新城疫病毒D90株磷蛋白P基因的開放閱讀框ORF cDNA如SEQ ID NO:4所示，溶瘤型新城疫病毒D90株聚合酶蛋白L基因的開放閱讀框ORF cDNA如SEQ ID NO: 5所示。
7.權利要求1所述的全長感染性cDNA在拯救新城疫病毒中的應用，其特征在于包括將所述的全長感染性cDNA和三個輔助質粒共轉染哺乳動物細胞，拯救得到新城疫病毒，其中所述的三個輔助質粒是將溶瘤型新城疫病毒D90株核蛋白NP，磷蛋白P和聚合酶蛋白L基因的開放閱讀框ORF cDNA分別克隆在pC1-neo載體T7啟動子下游的多克隆位點構建得到的。
8.如權利要求7所述的應用，其特征在于:溶瘤型新城疫病毒D90株核蛋白NP基因的開放閱讀框ORF cDNA如SEQ ID N0:3所示，溶瘤型新城疫病毒D90株磷蛋白P基因的開放閱讀框ORF cDNA如SEQ ID NO: 4所示，溶瘤型新城疫病毒D90株聚合酶蛋白L基因的開放閱讀框ORF cDNA如SEQ ID NO: 5所示。
9.如權利要求7所述的應用，其特征在于:所述的哺乳動物細胞為BHK-21細胞。
10.權利要求5或6所述的反向遺傳操作系統在拯救新城疫病毒中的應用。
【文檔編號】C12N15/86GK103451198SQ201310364591
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年8月20日 優先權日:2013年8月20日
【發明者】李曦, 柴政, 符芳 申請人:中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所