嗜水氣單胞菌適體及其篩選方法與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及嗜水氣單胞菌適體及其篩選方法與應(yīng)用。提供嗜水氣單胞菌適體以及所述嗜水氣單胞菌適體的篩選方法與應(yīng)用。所述嗜水氣單胞菌適體的篩選方法的具體步驟包括：構(gòu)建并合成待篩選的嗜水氣單胞菌適體ssDNA文庫(kù)，并設(shè)計(jì)合成相應(yīng)的引物；取適量所述ssDNA文庫(kù)與嗜水氣單胞菌進(jìn)行結(jié)合；分離獲得與嗜水氣單胞菌結(jié)合的ssDNA，以該ssDNA為模板進(jìn)行PCT擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物再次進(jìn)行SELEX篩選直至獲得相應(yīng)適體。本發(fā)明采用SELEX技術(shù)篩選出致病性嗜水氣單胞菌的高親和力寡核苷酸適體，所述適體可廣泛應(yīng)用于嗜水氣單胞菌的檢測(cè)與分析。
【專利說(shuō)明】嗜水氣單胞菌適體及其篩選方法與應(yīng)用【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及水產(chǎn)養(yǎng)殖中常見(jiàn)的致病病原菌一嗜水氣單胞菌，特別涉及嗜水氣單胞菌適體及其篩選方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]嗜水氣單胞菌(Aerotnoims hydrophila)在自然界分布廣泛，是多種水生動(dòng)物的原發(fā)性致病菌，可產(chǎn)生多種致病因子，對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物，畜禽和人類均有致病性，可引起多種動(dòng)物的敗血癥和人類腹瀉，給人類健康帶來(lái)了威脅，同時(shí)也給養(yǎng)殖業(yè)造成較大的經(jīng)濟(jì)損失(1.張翠娟，于宙亮，趙寶華，何宏軒.嗜水氣單胞菌研究進(jìn)展[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志，2008，42(7):46-50.)。因此，對(duì)于作為水源污染指示菌的嗜水氣單胞菌污染，其檢測(cè)力度仍需進(jìn)一步加強(qiáng)。目前嗜水氣單胞菌的檢測(cè)一直是個(gè)棘手的問(wèn)題，傳統(tǒng)的化學(xué)病理檢測(cè)過(guò)程繁瑣，耗費(fèi)時(shí)間；酶聯(lián)免疫、多重PCR技術(shù)則成本過(guò)高(2.王利.魚(yú)類嗜水氣單胞菌的幾種檢測(cè)方法[J].內(nèi)陸水產(chǎn)，2006，(2):22-23.)。因此，開(kāi)發(fā)一種操作簡(jiǎn)便，成本低廉，快速方便的嗜水氣單胞菌檢測(cè)方法，成為本領(lǐng)域技術(shù)人員迫切需要解決的技術(shù)難題。
[0003]SELEX ( Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)即指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)，是1990年由美國(guó)的Tuerk和Gold創(chuàng)建的一種體外合成篩選寡核苷酸適體的化學(xué)組合技術(shù)(3.孟慶玲，陳創(chuàng)夫.SELEX技術(shù)及其應(yīng)用前景[J].塔里木大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，20 (3):44-48.4.廖世奇，劉巍，王黎.SELEX技術(shù)應(yīng)用研究進(jìn)展[J].甘肅醫(yī)藥，2009，(02):96-97.)。由于適體具有特異性高、庫(kù)容量大、合成時(shí)間短(5.王聰艷，孫偉，李建國(guó)，等.SELEX技術(shù)應(yīng)用研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通報(bào)，2006，(SI):232-236.)等優(yōu)點(diǎn)，SELEX技術(shù)現(xiàn)在廣泛應(yīng)用在疾病防控、藥物篩選、臨床診斷等不同的【技術(shù)領(lǐng)域】，隨著技術(shù)的不斷創(chuàng)新與發(fā)展，逐漸產(chǎn)生了一些新的SELEX篩選方法，如導(dǎo)向SELEX技術(shù)、復(fù)合靶分子SELEX技術(shù)、基因組SELEX技術(shù)等新的研究手段(6.孟慶玲，陳創(chuàng)夫.SELEX技術(shù)及其應(yīng)用前景[J].塔里木大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，20 (3):44-48.)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的第一目的在于提供嗜水氣單胞菌適體。
[0005]本發(fā)明的第二目的在于提供所述嗜水氣單胞菌適體的篩選方法。
[0006]本發(fā)明的第三目的在于提供所述嗜水氣單胞菌適體在檢測(cè)述嗜水氣單胞菌中的應(yīng)用。
[0007]所述嗜水氣單胞菌適體的核酸序列如序列表中1-22號(hào)中的序列所示。
[0008]所述嗜水氣單胞菌適體的篩選方法是將指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(即SELEX篩選)應(yīng)用于嗜水氣單胞菌適體的篩選，所述SELEX篩選的具體步驟包括:
1）構(gòu)建并合成待篩選的嗜水氣單胞菌適體ssDNA文庫(kù)，并設(shè)計(jì)合成相應(yīng)的引物；
2)取適量所述ssDNA文庫(kù)與嗜水氣單胞菌進(jìn)行結(jié)合；
3)分離獲得與嗜水氣單胞菌結(jié)合的ssDNA，以該ssDNA為模板進(jìn)行PCT擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物再次進(jìn)行SELEX篩選直至獲得相應(yīng)適體。
[0009]在步驟I)中，所述 ssDNA 文庫(kù)可為::5 ' -GGG AGC TCA GAA TAA ACG CTCAA-N35-TT CGA CAT GAG GCC CGG ATC-3'。
[0010]所述引物可為:
引物 1:5' -GGG AGC TCA GAA TAA ACG CTC AA-3'；
引物 II:5/ -GAT CCG GGC CTC ATG TCG AA-3'；
引物III:5/ -地高辛-GGG AGC TCA GAA TAA ACG CTC AA-3'；
引物IV:5/ -生物素-GAT CCG GGC CTC ATG TCG AA-3'。
[0011]在步驟3)中，所述SELEX篩選共進(jìn)行12輪。
[0012]本發(fā)明采用SELEX技術(shù)篩選出致病性嗜水氣單胞菌的高親和力寡核苷酸適體，所述適體為嗜水氣單胞菌的快速檢測(cè)技術(shù)的開(kāi)發(fā)以及在水產(chǎn)病害控制方面的應(yīng)用提供參考，可廣泛應(yīng)用于嗜水氣單胞菌的檢測(cè)與分析。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0013]圖1為PCR產(chǎn)物3%瓊脂糖凝膠電泳圖。在圖1中，M為50bp DNA marker, 1、3、
5、7、9、11、12 分別表示第 1、3、5、7、9、11、12 輪的 PCR 產(chǎn)物。
[0014]圖2為適體與嗜水氣單 胞菌結(jié)合的吸光度。在圖2中，橫坐標(biāo)為篩選輪數(shù)，縱坐標(biāo)為A450nm時(shí)的吸光度。
[0015]圖3-圖5為本發(fā)明所篩選的核酸適體二級(jí)結(jié)構(gòu)圖。圖3中的結(jié)構(gòu)最小自由能為-7.60千卡/摩，圖4中的結(jié)構(gòu)最小自由能為1.83千卡/摩，圖5中的結(jié)構(gòu)最小自由能為-3.11千卡/摩。
【具體實(shí)施方式】
[0016]一、ssDNA文庫(kù)及引物的合成
參照文獻(xiàn)(7、劉豐偉，蘭小鵬.體外篩選銅綠假單胞菌適體的研究及初步應(yīng)用[D].福州福建醫(yī)科大學(xué)，2007.)中公開(kāi)的方法，用于SELEX篩選的隨機(jī)ssDNA文庫(kù)和引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。
[0017]所用文庫(kù)為:5'-GGG AGC TCA GAA TAA ACG CTC AA-N35-TT CGA CAT GAG GCCCGG ATC-3'。
[0018]所用引物分別為:
引物 1:5' -GGG AGC TCA GAA TAA ACG CTC AA-3'；
引物 II:5/ -GAT CCG GGC CTC ATG TCG AA-3'；
引物III:5/ -地高辛-GGG AGC TCA GAA TAA ACG CTC AA-3'；
引物IV:5/ -生物素-GAT CCG GGC CTC ATG TCG AA-3'。
[0019]上述引物在合成后用分子生物學(xué)中常用的TE緩沖液(pH8.0)稀釋至濃度為10 μ mol, -20°c保存?zhèn)溆谩?br> [0020]二、實(shí)驗(yàn)試劑及緩沖液制備
Dynabeads 鏈酶親和素磁珠 M-280 試劑盒、2 X Taq PCR MasterMix、50bp DNA LadderMarker、牛血清白蛋白(BSA)均購(gòu)自廈門鷺隆生物技術(shù)有限公司，PCR膠回收純化試劑盒購(gòu)自omega公司，抗地高辛堿性磷酸酶購(gòu)自Roche公司，對(duì)硝基苯磷酸二鈉為Amresco公司產(chǎn)品。緩沖液參照參考文獻(xiàn)(劉豐偉，蘭小鵬.體外篩選銅綠假單胞菌適體的研究及初步應(yīng)用[D].福州福建醫(yī)科大學(xué)，2007.)配制。
[0021]三、菌種:嗜水氣單胞菌ASl.1801購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。
[0022]四、SELEX篩選
取一定量隨機(jī)ssDNA文庫(kù)(首輪篩選用量為600pmol，隨后每輪減少用量)，加入600 μ L選擇緩沖液稀釋ssDNA，于95°C變性5min，冷卻lOmin。加入30 μ L的嗜水氣單胞菌菌懸液(菌的數(shù)量約為1.5Χ108個(gè))，混勻置搖床室溫結(jié)合30min，15000r/min，4°C下離心lOmin。之后棄上清液，加入600 μ L選擇緩沖液重懸，如此重復(fù)洗滌3次，洗去未與嗜水氣單胞菌結(jié)合的ssDNA,結(jié)合了 ssDNA的嗜水氣單胞菌沉淀用100 μ L ddH20重懸,96°C加熱5min,離心后取上清為模板，用引物1、IV進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得標(biāo)記生物素的雙鏈DNA (dsDNA)，利用M-280磁珠通過(guò)生物素一鏈親和素之間的相互作用分離ssDNA，作為下一輪篩選的次級(jí)庫(kù)。依照上述方法，對(duì)次級(jí)庫(kù)再次進(jìn)行SELEX篩選，先后進(jìn)行12輪SELEX篩選。
[0023]五、各輪適體與嗜水氣單胞菌結(jié)合率的測(cè)定以及適體的序列測(cè)定與分析
將第1、3、5、7、9、11、12輪SELEX篩選的產(chǎn)物(即該輪的洗脫上清)，用引物III和引物IV進(jìn)行PCR擴(kuò)增，各輪均擴(kuò)增320 μ L。PCR擴(kuò)增體系為:2X Taq PCR MasterMix 10ul，上游引物(IOum)、下游引物(IOum)各0.4ul，模板lul，用去離子水補(bǔ)足到20ul。PCR反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性 3min ;94°C變性 30s，58°C _70°C退火 30s，72°C延伸 20s，24 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 3min。
[0024]將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用膠 回收純化試劑盒進(jìn)行純化，純化產(chǎn)物利用3%的瓊脂糖電泳檢測(cè)，可以看出電泳條帶越來(lái)越致密，同時(shí)彌散現(xiàn)象越來(lái)越少，條帶隨著篩選次數(shù)的增加越來(lái)越整齊且亮度有所增加。說(shuō)明隨著篩選次數(shù)的增加，特異性適體得到了富集，其同源性可能比較高
純化后的PCR產(chǎn)物用鏈霉親和素磁珠將純化的dsDNA解鏈成ssDNA，此ssDNA即帶有地高辛標(biāo)記，測(cè)定其含量。再按ssDNA:嗜水氣單胞菌=300pmol: 1.5 X IO8的比例，將兩者在500 μ L選擇緩沖液中結(jié)合30min，離心后加入100 μ L I: 15000稀釋的抗地高辛抗體標(biāo)記的堿性磷酸酶反應(yīng)IOmin,離心棄上清并用500 μ L選擇緩沖液懸浮嗜水氣單胞菌,重復(fù)洗滌3次，洗去未與嗜水氣單胞菌上ssDNA-地高辛結(jié)合的抗地高辛抗體標(biāo)記的堿性磷酸酶，然后加入100 μ L對(duì)硝基苯磷酸鹽溶液顯色，顯色好后加入IOOyL 2mol/L NaOH終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀于405 nm測(cè)定吸光度值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果參見(jiàn)圖1。該親和力測(cè)定結(jié)果表明，隨著篩選輪數(shù)的增加，適體與菌液的親和力逐漸增大，在第九輪時(shí)達(dá)到最大，之后親和力變化不大、趨于平緩，說(shuō)明適體達(dá)到了飽和。
[0025]再用引物I和引物II將第12輪的PCR產(chǎn)物大量擴(kuò)增，純化后送于英駿生物技術(shù)有限公司克隆、克隆之后隨機(jī)取24個(gè)克隆子測(cè)序，獲得22條符合要求的適體序列。按照隨機(jī)序列堿基的數(shù)目分為A群、B群兩個(gè)群。A群(見(jiàn)表1)包括13條適體序列，與預(yù)期長(zhǎng)度一致，B群(見(jiàn)表2)包含9條序列，均短于預(yù)期長(zhǎng)度。測(cè)序結(jié)果見(jiàn)表1。用Macaw 2.05軟件包分析22個(gè)適體的同源序列，獲得4個(gè)保守序列=GTTTTX (見(jiàn)于Al-1、Al_8、Al-13、A1-17、Α1-20、Α1-21、Α1-26、Α1-30 號(hào)適體);GTGGGT (見(jiàn)于 A1-1、A1-7、A1-12、A1-15、A1-22、A1_29);GTTTX (見(jiàn)于 Α1-1、Α1-5、Α1-7、Α1-10、Α1-13、Α1-14、Α1-15、Α1-18、Α1-21、Α1-22、Α1-29)；XTTTT (見(jiàn)于Al-14、Al-26、A1-27)。有的適體中同一保守序列出現(xiàn)多次，如Al-18中三次
出現(xiàn)GTTTG ;有的適體中則出現(xiàn)多個(gè)保守序列，但沒(méi)有發(fā)現(xiàn)存在于所有適體中的保守序列ο
[0026]表1 A群嗜水氣單胞菌適體_
適體序歹瞭中的編號(hào)_核酸序歹Li_
表2 B群嗜水氣單胞菌適體
用DNAMAN軟件對(duì)所測(cè)得的22條序列進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，根據(jù)結(jié)構(gòu)可將其分為三類:第一類:5'端的固定序列區(qū)堿基與:V端的第6個(gè)堿基起形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，中間隨機(jī)區(qū)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，3'端的5個(gè)固定堿基形成一個(gè)小的口袋結(jié)構(gòu)(圖3)。這種結(jié)構(gòu)的適體有Α1-3、Α1-5、Α1-7、Α1-13、Α1-14、Α1-20、Α1-22 共七條；
第二類:5'端的第3個(gè)至21個(gè)堿基形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，3'端固定序列區(qū)堿基與中間隨機(jī)區(qū)堿基形成莖環(huán)并凸起，然后再由5'端、3'端固定序列區(qū)堿基和中間隨機(jī)區(qū)形成一個(gè)口袋結(jié)構(gòu)(圖 4)，這種結(jié)構(gòu)的適體有 Al-1、Al-4、Al-12、Al-15、Al-17、Al-18、Al-21、A1-27、Α1-28、Α1-29、Α1-30、A1_31 共十二條；
第三類:5'端、3'端固定序列區(qū)部分堿基分別與隨機(jī)區(qū)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，然后由5'端、3'端固定序列區(qū)堿基和中間隨機(jī)區(qū)再形成一個(gè)大的口袋結(jié)構(gòu)(圖5)。這種結(jié)構(gòu)的適體有 Α1-8、Α1-10、Α1-26 三條。
[0027] 申請(qǐng)人:人工合成的ssDNA文庫(kù)全長(zhǎng)78bp，中間35bp為隨機(jī)核苷酸，由于每個(gè)位點(diǎn)有A、G、C、T四種可能，這樣的話中間35個(gè)序列就有435個(gè)可能組合，即其庫(kù)容量達(dá)到了 IO16之多，雖然實(shí)際實(shí)驗(yàn)中可能只到IO14左右，但這也滿足了篩選目的寡核苷酸的需要(8、李衛(wèi)濱，蘭小鵬，楊湘越，等.SELEX技術(shù)在篩選環(huán)孢霉素A適體中的運(yùn)用[J].福州總醫(yī)院學(xué)報(bào)，2007，(03):171-173)。在前兩輪篩選的過(guò)程中， 申請(qǐng)人:添加的文庫(kù)量比較多，這樣的目的是盡可能的獲得比較多的與嗜水氣單胞菌特異性結(jié)合的適體。但隨著篩選輪數(shù)的增加，次級(jí)文庫(kù)的量就要相應(yīng)的減少，這是因?yàn)槲膸?kù)的濃度越來(lái)越大的緣故。為了增加適體的特異性， 申請(qǐng)人:相應(yīng)增加了洗脫次數(shù)，同時(shí)文庫(kù)與菌液結(jié)合的時(shí)間也相從前幾輪的30min減少到后來(lái)的20min。PCR條件的優(yōu)化對(duì)適體的篩選也十分重要，每一輪篩選， 申請(qǐng)人:都要先做一個(gè)梯度PCR，在得到最適退火溫度的前提下再做PCR擴(kuò)增，這樣有效的避免了非特異性擴(kuò)增等問(wèn)題。[0028] 申請(qǐng)人:實(shí)驗(yàn)用的是鏈霉親和素磁珠來(lái)富集次級(jí)文庫(kù)，它操作簡(jiǎn)單、不需要離心，只要在磁場(chǎng)的作用下即可達(dá)到分離的效果，同時(shí)它得到的次級(jí)文庫(kù)比較穩(wěn)定，純度更高，不易出現(xiàn)不對(duì)稱PCR中的非特異性擴(kuò)增的問(wèn)題。通過(guò)12輪篩選、克隆測(cè)序得到的22條適體中，有13條適體與預(yù)期長(zhǎng)度一直一致。
[0029]利用DNAMAN軟件對(duì)其二級(jí)結(jié)構(gòu)分析,從結(jié)果中可以看出，這些序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)都是由莖環(huán)和口袋(勺狀)結(jié)構(gòu)組成，這說(shuō)明了莖環(huán)和口袋結(jié)構(gòu)可能是適體與嗜水氣單胞菌結(jié)合的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，莖可能起著穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的作用，環(huán)可能是其結(jié)合部位。有些二級(jí)結(jié)構(gòu)中含有勺狀的口袋，這些口袋也可能起著同環(huán)一樣的作用，即可能是與受體結(jié)合的結(jié)合部位。在這些莖結(jié)構(gòu)中，其堿基主要是G-C為主，由于G-C的結(jié)構(gòu)能大于A-T，這一點(diǎn)也說(shuō)明莖可能起著穩(wěn)定作用。
[0030]本發(fā)明初步建立了 SELEX法篩選嗜水氣單胞菌適體的方法，同時(shí)獲得了具有特異性的嗜水氣單胞菌的適體，并對(duì)適體群的二級(jí)結(jié)構(gòu)初步進(jìn)行了研究，得到其二級(jí)結(jié)構(gòu)的一些結(jié)構(gòu)組成，這為以后研究嗜水氣單胞菌的分子結(jié)構(gòu)打下了一定的基礎(chǔ)，同時(shí)也為嗜水氣單胞菌的檢測(cè)提供了一種新的方法。
【權(quán)利要求】
1.嗜水氣單胞菌適體，其特征在于，其序列如序列表中18號(hào)所示。
2.如權(quán)利要求1所述嗜水氣單胞菌適體在檢測(cè)嗜水氣單胞菌中的應(yīng)用，所述應(yīng)用為非疾病診斷目的的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103468699SQ201310365220
【公開(kāi)日】2013年12月25日 申請(qǐng)日期:2012年1月5日 優(yōu)先權(quán)日:2012年1月5日
【發(fā)明者】李元躍, 王雷, 段博文, 陳融斌, 黎中寶 申請(qǐng)人:集美大學(xué)