專利名稱：嗜水氣單胞菌核酸標準品的應用的制作方法
嗜水氣單胞菌核酸標準品的應用技術領域
本發明主要涉及海產品疾病檢測技術領域，具體涉及一種嗜水氣單胞菌核酸標準品的應用。
背景技術：
我國海域遼闊，自然條件優越，海洋資源十分豐富。但目前開發利用的程度還很低。這也說明我國開發利用海洋資源的潛力巨大，遼寧海域是中國重要的海洋生物資源、漁業資源寶庫，其盛產水生動物、扇貝、貽貝、牡蠣和魚、蝦以及藻類等，帶動海洋經濟發展。加強多邊和雙邊的海洋開發國際合作，集中集約開發利用海域及海島資源，合理配置優勢海洋產業，科學高效開發海洋資源，積極開展科研與試驗、開發與利用，海水養殖標準化是合理開發海水養殖資源的重要手段，研究制定海產品養殖標準，合理開發海水灘涂養殖資源， 提高養殖海產品疾病是當今養殖業的重點內容。海產品養殖是一項高風險的養殖業，傳統的小戶的海產品養殖給養殖戶帶來了巨大的市場和技術風險。為了將養殖戶養殖風險降到最低，開展對各類養殖業，包括魚、蝦、蟹、水生動物、鮑魚、貝類、海藻等各類海產品的疾病防治工作任務舉足輕重。有報道稱，霍亂弧菌、漂浮弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、創傷弧菌等有害細菌，是引起海產品各種疾病的罪魁禍首。
嗜水氣單胞菌(A. hydrophila)廣泛分布于自然界的各種水體，是多種水生動物的原發性致病菌，為條件致病菌，是典型的人-獸-魚共患病病原菌。該菌是弧菌科氣單胞菌屬，為革蘭氏陰性短桿菌，極端單鞭毛，沒有芽胞和莢膜，剛從病灶上分離的病原菌常兩個相連。在普通瓊脂平板培養基上進行培養形成的菌落園形、邊緣光滑、中央凸起、肉色、灰白色或略帶淡桃紅色有光澤，發育良好。嗜水氣單胞菌在水溫14. O 40. 5°C范圍內都可繁殖，以28. O 30. (TC為最適溫度。PH值在6 11范圍內均可生長；最適PH值為7. 27 ;嗜水氣單胞菌可在含鹽量0%。 4%。的水生存，最適鹽度為O. 5%。。嗜水氣單胞菌可以產生毒性很強的外毒素，因嗜水氣單胞菌的變異菌株較多，所以要特別注意療效。發明內容
由背景技術可見，提高嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)的檢出率,增強其檢測精度是解決多種水生動物病害問題的重要途徑。本研究采用以下技術方案實現嗜水氣單胞菌核酸標準品的應用，其包括下述步驟
采用CTAB法提取樣品的核酸；以嗜水氣單胞菌核酸標準品作為陽性對照，對提取的樣品核酸進行PCR特異性擴增^PCR特異性擴增產物進行電泳，對比樣品和陽性對照的結果判斷結果；
所述嗜水氣單胞菌核酸標準品的制備方法包括以下步驟
將提取的嗜水氣單胞菌ATCC 35654和/或嗜水氣單胞菌ATCC 7966的基因組核酸經冷凍干燥后獲得，其中所述的冷凍干燥條件為啟動凍干機，當干燥室溫度降至_35°C 時開啟冷卻阱；冷卻阱溫度降至_40°C時，將在_80°C預凍2h的核酸樣品放入干燥室后抽真空；待真空度降至O. 5Torr結束冷凍；并將樣品于15°C干燥，當真空度降至O.1Torr時，取出樣品，蓋緊西林瓶獲得基因組核酸標準樣品，于_20°C中避光貯存。
對于上述技術方案中所述的樣品的核酸提取方法，可以由本領域技術人員根據共知常識確定。
在上述技術方案中，所述的提取樣品核酸的方法為步驟(3)，所述嗜水氣單胞菌核酸標準品的制備方法包括以下步驟
(I)增菌從嗜水氣單胞菌標準菌株接種到普通LB培養基中，進行發酵，37°C培養12h制得發酵產物；將發酵產物再接入嗜水氣單胞菌培養基中進行發酵，32 37°C培養 24 48h，至菌懸液菌含量的終濃度為IO7 101QCfu/g ；
所述的嗜水氣單胞菌培養基，其配制方法如下胰 蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉IOg,葡萄糖5g,無需調節pH, 121°C下滅菌20min ;冷卻備用；
(2)洗滌將步驟(I)獲得的菌懸液重復下述操作2飛次以清洗，以1:10的體積比與PBS緩沖液充分混合，在800(Tl2000rpm條件下離心5 lOmin，收集菌體；
(3)采用CTAB法提取菌懸液DNA ;將提取的DNA用pH8. O的TE溶液溶解，獲得基因組核酸溶液；其操作步驟參見國家海洋局908專項辦公室編，海洋生物生態調查技術規程，海洋出版社，2006、4，p23-26，于西林瓶中分裝核酸樣品；
(4)冷凍干燥啟動凍干機，當干燥室溫度降至_35°C時開啟冷卻阱；冷卻阱溫度降至_40°C時，將在_80°C預凍2h的核酸樣品放入干燥室后抽真空；待真空度降至O. 5Torr 結束冷凍；并將樣品于15°C干燥，當真空度降至O.1Torr時，取出樣品，蓋緊西林瓶獲得基因組核酸標準樣品，于-20 V中避光貯存。
對于以上所述的所有技術方案中，所述的嗜水氣單胞菌標準菌株為嗜水氣單胞菌 ATCC35654和/或嗜水氣單胞菌ATCC 7966 ；
對于以上所述的所有技術方案中，較優的條件如下提取的DNA用紫外分光光度計測260nm和280nm處的光密度值，當0D26(l/0D28(l比值在1. 7 1. 9之間較佳；
對于以上所述的所有技術方案中，較優的條件如下所述的PCR特異性擴增的條件為
上游引物5 ’ -GAAAGGTTGATGCCTAATACGTA-3，
下游引物5 ’ -CGTGCTGGCAACAAAGGACAG-3
PCR 擴增反應體系(25 μ L)為:2· 5μ L 的 IOX 緩沖液 Buffer ;1μ L 的MgC12 ;1μ L 的 dNTPMix ;lyL 的引物 Pl (20mM) ;1 μ L 的引物 P2 (20mM) ;0· 2 μ L 的 TaqDNA 聚合酶； 18. 3 μ L超純水；
PCR反應條件為94°C預變性IOmin ;然后94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸 45s，循環30次；并于72°C延伸IOmin ；
PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電壓6V/cm，電泳20分鐘。
本發明中，上述產品制備方法中，均未限定方法的其他等效條件，因其可根據現有技術確定，也未限定所用試劑的級別，因其對結果影響小，并可以通過配制或商業途徑購買獲得，技術人員可以依據實施例中所列條件做參考依據進行調整。這些關于制劑方式和方法的選擇，相信本領域技術人員可以從現有技術中得到充分的啟示，本發明不再贅述。
本發明的優點是適用于水生動物的疾控或檢測；本標準品的處理過程簡單，耗時少；制備成本低，本發明粉劑保存時間長，不易污染。本發明對解決水生動物養殖的嗜水氣單胞菌病的防治具有重要的現實意義。
具體實施方式
以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。
實施例1
嗜水氣單胞菌標準菌株選擇嗜水氣單胞菌ATCC 35654 ；
(I)增菌從嗜水氣單胞菌標準菌株接種到LB培養基中，進行發酵，37°C培養1此制得發酵產物；將發酵產物再接入嗜水氣單胞菌培養基中進行發酵，37°C培養48h，至菌懸液菌含量的終濃度為109cfu/g ；
所述的嗜水氣單胞菌培養基配制方法胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g， 葡萄糖5g,無需調節pH, 121°C下滅菌20min ；
(2)洗滌將步驟(I)獲得的菌懸液重復下述清洗操作3次，以1:10的體積比與 PBS緩沖液充分混合,在12000rpm條件下離心5min,收集菌體；
(3 )采用CTAB法提取菌懸液DNA
取菌體加ρΗ8· O的TE懸浮，加O. 5mL濃度為100g/L SDS和30 μ L濃度為30mg/mL 的蛋白酶K，混勻，37°C溫浴Ih ;加2mL濃度為5mol/L NaCl，混勻，加1. 5mL CTAB-NaCl混合溶液，混勻，65°C溫浴 20min ;其中，CTAB-NaCl 混合溶液為 100g/L CTAB 和 0. 7mol/L NaCl ； 取上清，加與上清等體積的酚-氯仿-異戊醇混合液，混勻，6000g離心IOmin ;其中，酚-氯仿-異戊醇混合液中酚氯仿異戊醇的體積比為25 24 1 ;取上清，加與上清等體積的氯仿-異戍醇混合液，混勻，6000g離心 IOmin ;其中，氯仿-異戍醇混合液中氯仿異戍醇的體積比為24 1 ;取上清，加上清0. 6倍體積的異丙醇，混勻，13000g離心IOmin ;取沉淀，用 70%乙醇清洗2次，干燥，將提取的DNA用pH8. O的TE溶液溶解，提取的樣品DNA用紫外分光光度計測260nm和280nm處的光密度值，取0D26(l/0D28(l比值在1. 8之間的樣品DNA于西林瓶中分裝核酸樣品；
(4)冷凍干燥啟動凍干機，當干燥室溫度降至_35°C時開啟冷卻阱；冷卻阱溫度降至_40°C時，將在_80°C預凍2h的核酸樣品放入干燥室后抽真空；待真空度降至0. 5Torr 結束冷凍；并將樣品于15°C干燥，當真空度降至0.1Torr時，取出樣品，蓋緊西林瓶獲得基因組核酸標準樣品，于-20 V中避光貯存。
實施例2
嗜水氣單胞菌標準菌株選擇嗜水氣單胞菌ATCC 7966 ；
(I)增菌從嗜水氣單胞菌標準菌株接種到LB培養基中，進行發酵，37°C培養1此制得發酵產物；將發酵產物再接入嗜水氣單胞菌培養基中進行發酵，35°C培養48h，至菌懸液菌含量的終濃度為108cfu/g ；
所述的嗜水氣單胞菌培養基配制方法胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g， 葡萄糖5g,無需調節pH, 121°C下滅菌20min ；
(2)洗滌將步驟(I)獲得的菌懸液重復下述清洗操作2次，以1:10的體積比與 PBS緩沖液充分混合,在12000rpm條件下離心IOmin,棄上清,收集菌體；
(3 )采用CTAB法提取菌懸液DNA
取菌體加ρΗ8· O的TE懸浮，加O. 5mL濃度為100g/L SDS和30 μ L濃度為30mg/mL 的蛋白酶K，混勻，37°C溫浴Ih ;加2mL濃度為5mol/L NaCl，混勻，加1. 5mL CTAB-NaCl混合溶液，混勻，65°C溫浴 20min ;其中，CTAB-NaCl 混合溶液為 100g/L CTAB 和 O. 7mol/L NaCl ； 取上清，加與上清等體積的酚-氯仿-異戊醇混合液，混勻，6000g離心IOmin ;其中，酚-氯仿-異戊醇混合液中酚氯仿異戊醇的體積比為25 24 1 ;取上清，加與上清等體積的氯仿-異戍醇混合液，混勻，6000g離心IOmin ;其中，氯仿-異戍醇混合液中氯仿異戍醇的體積比為24 1 ;取上清，加上清O. 6倍體積的異丙醇，混勻，13000g離心IOmin ;取沉淀，用 70%乙醇清洗2次，干燥，將提取的DNA用pH8. O的TE溶液溶解，提取的樣品DNA用紫外分光光度計測260nm和280nm處的光密度值，取0D26(l/0D28(l比值在1. 8之間的樣品DNA于西林瓶中分裝核酸樣品；
(4)冷凍干燥啟動凍干機，當干燥室溫度降至_35°C時開啟冷卻阱；冷卻阱溫度降至_40°C時，將在_80°C預凍2h的核酸樣品放入干燥室后抽真空；待真空度降至O. 5Torr 結束冷凍；并將樣品于15°C干燥，當真空度降至O.1Torr時，取出樣品，蓋緊西林瓶獲得基因組核酸標準樣品，于-20 V中避光貯存。
實施例3
取疑似有嗜水氣單胞菌的引起淡水養殖魚類爆發敗血癥的水體中取樣，提取樣品核酸
(I)增菌無菌條件下以1:1的體積比取樣并接種到LB培養基中進行發酵，37°C培養12h制得發酵產物；將發酵產物再接入嗜水氣單胞菌培養基中進行發酵，35°C培養48h， 至菌懸液菌含量的終濃度為108cfu/g ；
所述的嗜水氣單胞菌培養基配制方法胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g， 葡萄糖5g,無需調節pH, 121°C下滅菌20min ；
(2)洗滌將步驟(I)獲得的菌懸液重復下述清洗操作2次，以1:10的體積比與 PBS緩沖液充分混合,在12000rpm條件下離心IOmin,棄上清,收集菌體；
(3 )采用CTAB法提取菌懸液DNA
取菌體加ρΗ8· O的TE懸浮，加0. 5mL濃度為100g/L SDS和30 μ L濃度為30mg/mL 的蛋白酶K，混勻，37°C溫浴Ih ;加2mL濃度為5mol/LNaCl，混勻，加1. 5mL CTAB-NaCl混合溶液，混勻，65°C溫浴 20min ;其中，CTAB-NaCl 混合溶液為 100g/L CTAB 和 0. 7mol/L NaCl ； 取上清，加與上清等體積的酚-氯仿-異戊醇混合液，混勻，6000g離心IOmin ;其中，酚-氯仿-異戊醇混合液中酚氯仿異戊醇的體積比為25 24 1 ;取上清，加與上清等體積的氯仿-異戍醇混合液，混勻，6000g離心IOmin ;其中，氯仿-異戍醇混合液中氯仿異戍醇的體積比為24 1 ;取上清，加上清0. 6倍體積的異丙醇，混勻，13000g離心IOmin ;取沉淀，用 70%乙醇清洗2次，干燥，將提取的DNA用pH8. O的TE溶液溶解，提取的樣品DNA用紫外分光光度計測260nm和280nm處的光密度值，取0D26(l/0D28(l比值在1. 8之間的樣品DNA用于 PCR檢測；
利用嗜水氣單胞菌ATCC 35654核酸標準品作為陽性對照；對待測樣品進行PCR特異性擴增，采用現有技術中公開的嗜水氣單胞菌的保守基因16SrDNA部分序列特異性引物完成擴增
上游引物5 ’ -GAAAGGTTGATGCCTAATACGTA-3 ’
下游引物 5 ’ -CGTGCTGGCAACAAAGGACAG-3
PCR 擴增反應體系(25 μ L)為:2· 5μ L 的 IOX 緩沖液 Buffer ;1μ L 的MgC12 ;1μ L 的 dNTPMix ;lyL 的引物 Pl (20mM) ;1 μ L 的引物 P2 (20mM) ;0· 2 μ L 的 TaqDNA 聚合酶； 18. 3 μ L超純水；
PCR反應條件為94°C預變性IOmin ;然后94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸 45s，循環30次；并于72°C延伸IOmin。
PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電壓6V/cm，電泳20分鐘，從電泳圖中條帶的位置分辨待測樣品中是否含有嗜水氣單胞菌；電泳結果顯示帶檢樣品與標準菌株一樣， 均在目的條帶686bp處呈現陽性擴增，且條帶單一，亮度較好，此結果證明帶檢樣品中含有嗜水氣單胞菌。
利用本發明實施例f 2所述方法制得的嗜水氣單胞菌核酸標準品的應用，適用于水生動物的疾病預防 ；處理過程簡單，耗時少；制備成本低，本發明粉劑保存時間長，無污染。本發明對解決大批量水生動物養殖的嗜水氣單胞菌的防治具有重要的現實意義。
以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明技術原理的前提下，還可以做出若干改進也應視為本發明的保護范圍。
權利要求
1.一種嗜水氣單胞菌核酸標準品的應用，其特征在于，其包括下述步驟CTAB法提取樣品的核酸；以嗜水氣單胞菌核酸標準品作為陽性對照，對提取的樣品核酸進行PCR特異性擴增J^PCR特異性擴增產物進行電泳，對比樣品和陽性對照的結果判斷結果;所述嗜水氣單胞菌核酸標準品的制備方法包括以下步驟將提取的嗜水氣單胞菌ATCC 35654和/或嗜水氣單胞菌ATCC 7966的基因組核酸經冷凍干燥后獲得，其中所述的冷凍干燥條件為啟動凍干機，當干燥室溫度降至_35°C時開啟冷卻阱；冷卻阱溫度降至_40°C時，將在_80°C預凍2h的核酸樣品放入干燥室后抽真空； 待真空度降至O. 5Torr結束冷凍；并將樣品于15°C干燥，當真空度降至O.1Torr時，取出樣品，蓋緊西林瓶獲得基因組核酸標準樣品，于_20°C中避光貯存。
2.根據權利要求1所述核酸標準品的應用，其特征在于，所述的基因組核酸的提取方法為CTAB法提取嗜水氣單胞菌ATCC 35654和/或嗜水氣單胞菌ATCC 7966的菌懸液DNA， 并將提取的DNA用pH8. O的TE溶液溶解，提取的樣品DNA用紫外分光光度計測260nm和 280nm處的光密度值，取0D26(l/0D28(l比值在1. 7 1. 9之間的樣品DNA于西林瓶分裝。
3.根據權利要求1所述核酸標準品的應用，其特征在于，所述的菌懸液培養方法為(1)增菌從嗜水氣單胞菌標準菌株接種到LB培養基中，進行發酵，37°C培養12h制得發酵產物；將發酵產物再接入嗜水氣單胞菌培養基中進行發酵，32 37°C培養24 48h，至菌懸液菌含量的終濃度為IO7 101(lCfu/g ；所述的嗜水氣單胞菌培養基配制方法胰蛋白胨IOg,酵母提取物5g,氯化鈉IOg,葡萄糖5g，無需調節pH, 121°C下滅菌20min ；(2)洗滌將步驟(I)獲得的菌懸液重復下述清洗操作2飛次，以1:10的體積比與PBS 緩沖液充分混合，在800(Tl2000rpm條件下離心5"l0min,收集菌體。
4.根據權利要求1所述核酸標準品的應用，其特征在于，所述的PCR特異性擴增的條件為上游引物 5 ’ -GAAAGGTTGATGCCTAATACGTA-3，下游引物 5’ -CGTGCTGGCAACAAAGGACAG-3PCR擴增反應體系(25 μ L)為2. 5μ L的IOX緩沖液Buffer ;1μ L的MgCl 2 ;1μ L的 dNTPMix ；1 μ L 的引物 Pl(20mM)；l μ L 的引物 P2(20mM)；0. 2 μ L 的 TaqDNA 聚合酶；18. 3μ L 超純水；PCR反應條件為94°C預變性IOmin ;然后94°C變性30s，60。。退火30s，72。。延伸45s， 循環30次；并于72°C延伸IOmin ；PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電壓6V/cm，電泳20分鐘。
全文摘要
本發明公開一種嗜水氣單胞菌核酸標準品的應用，其包括下述步驟采用CTAB法提取樣品的核酸；以嗜水氣單胞菌核酸標準品作為陽性對照，對提取的樣品核酸進行PCR特異性擴增；對PCR特異性擴增產物進行電泳，對比樣品和陽性對照的結果判斷結果；其中陽性對照通過將提取的嗜水氣單胞菌ATCC 35654和/或嗜水氣單胞菌ATCC 7966的基因組核酸冷凍干燥獲得基因組核酸標準樣品，于-20℃中避光貯存。本發明產品適用于水生動物的疾病預防；制備成本低，保存時間長，無污染。對解決大批量水生動物養殖的嗜水氣單胞菌的防治具有重要的現實意義。
文檔編號C12Q1/04GK102994639SQ20121050872
公開日2013年3月27日 申請日期2012年11月29日 優先權日2012年11月29日
發明者王忠舉 申請人:王忠舉