L-氨基酸的生產方法
【專利摘要】本發明涉及L-氨基酸的生產方法，具體的涉及在含有甘油作為碳源的培養基中培養具有L-氨基酸生產能力、且經過修飾使得甘油脫氫酶和二羥基丙酮激酶的活性增強的屬于腸桿菌科的微生物，來生產L-氨基酸。
【專利說明】L-氨基酸的生產方法
[0001]本申請是申請日為2008年02月22日，申請號為200880005958.2 (國際申請號為PCT/JP2008/053020 )，發明名稱為“L-氨基酸的生產方法”的發明專利申請的分案申請。
【背景技術】
[0002]L-氨基酸是通過使用屬于短桿菌屬(Brevibacterium)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、埃希氏菌屬(Escherichia)等的微生物的發酵方法來進行工業生產的。在這些生產方法中，使用從自然界分離的菌株或該菌株的人工突變株，并且還使用通過重組DNA技術進行修飾從而增加了堿性L-氨基酸生物合成酶的活性的微生物等。(專利文獻I~9)
[0003]通常，在使用微生物進行氨基酸生產時，在基質中使用糖類作為主成分，但甘油也可以與糖類一樣用作基質。(專利文獻10、11)
[0004]已知大腸桿菌(Escherichia coli)中存在多個甘油代謝相關基因。然而，缺損甘油激酶的編碼基因glpK、或甘油3磷酸脫氫酶的編碼基因glpD中的任一個的突變株在以甘油為單 一碳源的培養基中不能生長，由此可知:甘油激酶和甘油-3-磷酸脫氫酶擔負著大腸桿菌的主要甘油同化途徑。(非專利文獻I)
[0005]大腸桿菌的甘油脫氫酶也是甘油代謝相關的酶之一，已知在使用缺損了glpR(glpK、glpD、glp調節子的阻遏物)的3個基因的突變株進行的篩選中，它可使在以甘油為單一碳源的培養基中的致死性得以回復。(非專利文獻2)
[0006]目前為止，如上述，經由甘油-3-磷酸的甘油激酶和甘油-3-磷酸脫氫酶被認為是屬于腸桿菌科的微生物的主要同化途徑，而經由二羥基丙酮的甘油同化途徑被認為是屬于腸桿菌科的微生物的甘油同化的非必要途徑。
[0007]專利文獻IEPOM3I35B
[0008]專利文獻2EP0733712B
[0009]專利文獻3EPH77565A
[0010]專利文獻4EP0796912A
[0011]專利文獻5EPO837IiMA
[0012]專利文獻6W001/53459
[0013]專利文獻7EP1170376A
[0014]專利文獻8W02005/010175
[0015]專利文獻9W096/17930
[0016]專利文獻IOEPl7I5O55A
[0017]專利文獻IlEPl7I5O56A
[0018]非專利文獻IJ.Bacteriol.23(2006)8259-8271
[0019]非專利文獻2J.Bacteriol.131 (1977) 1026-1028

【發明內容】
[0020]發明所要解決的問題
[0021]本發明的問題是提供一種與傳統方法相比進一步有所改良的、通過使用含有甘油的基質的發酵方法進行的L-氨基酸生產方法。
[0022]解決問題的方法
[0023]本發明人等為解決上述問題進行了深入研究，結果發現:雖然單獨增強甘油脫氫酶和二羥基丙酮激酶這兩種經由二羥基丙酮的甘油同化途徑中的酶沒有效果，但通過同時增強甘油脫氫酶和二羥基丙酮激酶，可以大幅提高從甘油生產L-氨基酸的能力，從而完成了本發明。
[0024]即，本發明如下所述。
[0025](I) 一種生產L-氨基酸的方法，包括在含有甘油作為碳源的培養基中培養具有L-氨基酸生產能力且經過修飾而增強了甘油脫氫酶和二羥基丙酮激酶的活性的屬于腸桿菌科的微生物，從而在該培養基中或菌體內生成和蓄積L-氨基酸，并且從該培養基或菌體收集L-氨基酸。
[0026](2) (I)所述的方法，其中，所述酶的活性是通過提高編碼所述甘油脫氫酶和二羥基丙酮激酶的基因的拷貝數或者通過修飾所述基因的表達調節序列來增強的。
[0027](3) (I)~(2)所述的方法，其特征在于，所述二羥基丙酮激酶以ATP為磷酸供體。
[0028](4) (I)~(3)中任一項所述的方法，其中，所述微生物還經過修飾而增強了甘油的攝入活性。
[0029](5) (I)~(4)中所述`的方法，其中，所述微生物還經過修飾而增強了選自由丙糖磷酸異構酶、果糖二磷酸醛縮酶、果糖1，6- 二磷酸酶和果糖-6-磷酸醛縮酶組成的群組中的I種以上的酶活性。
[0030](6) (I)~(5)中所述的方法，其中，所述微生物還經過修飾而降低了甘油激酶和/或膜結合型甘油-3-磷酸脫氫酶的酶活性。
[0031](7) (I)~(6)中所述的方法，其中，所述屬于腸桿菌的微生物為埃希氏菌屬細菌或泛菌屬(Pantoea)細菌。
[0032](8)⑴~(7)中所述的方法，其中，所述L-氨基酸為選自由L-谷氨酸、L-賴氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸、L-纈氨酸、L-色氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-蘇氨酸、L-甲硫氨酸、L-半胱氨酸、L-精氨酸、L-絲氨酸、L-脯氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-谷氨酰胺和L-組氨酸組成的群組中的I種或2種以上的L-氨基酸。
[0033]本發明還涉及如下方面:
[0034]1.一種生產L-氨基酸的方法，包括在含有甘油作為碳源的培養基中培養具有L-氨基酸生產能力且經過修飾而增強了甘油脫氫酶和二羥基丙酮激酶的活性的屬于腸桿菌科的微生物，從而在該培養基中或菌體內生成和蓄積L-氨基酸，并且從該培養基或菌體收集L-氨基酸。
[0035]2.項I所述的方法，其中，所述酶的活性是通過提高編碼所述甘油脫氫酶和二羥基丙酮激酶的基因的拷貝數或者通過修飾所述基因的表達調節序列而增強的。
[0036]3.項I或2所述的方法，其特征在于，所述二羥基丙酮激酶以ATP為磷酸供體。
[0037]4.項I~3中任一項所述的方法，其中，所述微生物還經過修飾而增強了甘油的攝入活性。[0038]5.項I~4中任一項所述的方法，其中，所述微生物還經過修飾而增強了選自由丙糖磷酸異構酶、果糖二磷酸醛縮酶、果糖1，6- 二磷酸酶和果糖-6-磷酸醛縮酶組成的群組中的I種以上的酶活性。
[0039]6.項I~5中任一項所述的方法，其中，所述微生物還經過修飾而降低了甘油激酶和/或膜結合型甘油-3-磷酸脫氫酶的酶活性。
[0040]7.項I~6中任一項所述的方法,其中,所述屬于腸桿菌科的微生物為埃希氏菌屬細菌或泛菌屬細菌。
[0041]8.項I~7中任一項所述的方法，其中，所述L-氨基酸為選自由L-谷氨酸、L-賴氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸、L-纈氨酸、L-色氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-蘇氨酸、L-甲硫氨酸、L-半胱氨酸、L-精氨酸、L-絲氨酸、L-脯氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-谷氨酰胺和L-組氨酸組成的群組中的I種或2種以上的L-氨基酸。
[0042]實施本發明的最佳模式
[0043]以下，對本發明進行詳細說明。
[0044]<1>本發明的微生物
[0045]本發明的微生物是具有L-氨基酸生產能力，且經過修飾而增強了甘油脫氫酶和二羥基丙酮激酶的活性增強的屬于腸桿菌科的微生物。這里，L-氨基酸生產能力是指:當在培養基中培養本發明的微生物時，在培養基中或菌體內生成并蓄積L-氨基酸的能力。而且，本發明的微生物可以是具有多種L-氨基酸的生產能力的微生物。作為具有L-氨基酸生產能力的微生物，可以是本身具有L-氨基酸生產能力的微生物，也可以是采用突變方法或重組DNA技術對如下所述的 微生物進行修飾而具有了 L-氨基酸生產能力的微生物。
[0046]對于L-氨基酸的種類沒有特殊限制，可以列舉:L_賴氨酸、L-鳥氨酸、L-精氨酸、L-組氨酸、L-瓜氨酸等堿性氨基酸，L-異亮氨酸、L-丙氨酸、L-纈氨酸、L-亮氨酸、L-甘氨酸等脂肪族氨基酸，L-蘇氨酸、L-絲氨酸等作為羥基單氨基羧酸的氨基酸，L-脯氨酸等環式氨基酸，L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-色氨酸等芳香族氨基酸，L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-甲硫氨酸等含硫氨基酸，L-谷氨酸、L-天冬氨酸等酸性氨基酸，L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺等側鏈具有酰胺基的氨基酸。本發明的微生物可以是具有2種以上氨基酸的生產能力的微生物。
[0047]作為本發明的屬于腸桿菌科的微生物，可以使用以埃希氏菌屬細菌、泛菌屬細菌為代表的屬于腸桿菌科的微生物。作為其它的屬于腸桿菌科的微生物，可以列舉:腸桿菌屬(Enterobacter)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、沙雷氏菌屬(Serratia)、歐文氏菌屬(Erwinia)、沙門氏菌屬(Salmonella)、摩根氏菌屬(Morganella)等屬于Y-變形細菌的屬于腸桿菌科的微生物。
[0048]在本發明中，“甘油脫氫酶”是指:以NAD為輔酶，可逆地催化將甘油轉變為二羥基丙酮的以下氧化反應的酶(EC:1.1.1.6)。
[0049]甘油(glycerol)+NAD=二羥基丙酮(dihydroxyacetone)+NADH+H+
[0050]在本發明中，“經過修飾而升高了甘油脫氫酶的活性”對應于下列情形:相對于野生株或非修飾株，平均每個細胞的甘油脫氫酶分子數增加，或者甘油脫氫酶的平均每個分子的活性提高。此外，當在野生株中不能檢出的酶活性提高到能夠檢出的程度時，這種情況也包含在所述的“活性升高”中。這里，在本發明中，甘油脫氫酶的活性只要能夠檢出即可，優選經過修飾從而具有0.05U/mg以上、優選0.25U/mg以上、更優選0.5U/mg以上的酶活性。這里，作為屬于腸桿菌科的微生物中的作為對照的野生株，可以列舉大腸桿菌MG1655株(ATCC N0.47076)、和 W3110株(ATCC N0.27325),Pantoea ananatis AJ13335 株(FERM BP-6615)等。甘油脫氫酶活性可以參考Ansis，R.E等的方法來測定((1953) J.Biol.Chem.2-3，153-159)。
[0051]在本發明中，“二羥基丙酮激酶”是指:可逆地催化將二羥基丙酮轉變為磷酸二羥基丙酮的以下反應的酶，該酶中有的以ATP為磷酸供體(EC2.7.1.29)，有的以PEP為磷酸供體(EC2.7.1.29) (Cell.Mol.Life Sc1.63 (2006) 890-900, Biochemistry.43 (2004) 1337-13045)。
[0052]ATP+二羥基丙酮(dihydroxyacetone) =ADP+憐酸二羥基丙酮(dihydroxyacetonephosphate) (EC2.7.1.29)
[0053]憐酸烯醇丙酮酸(phosphoenolpyruvate) + 二羥基丙酮(dihydroxyacetone)=丙酮酸(pyruvate) + 憐酸二羥基丙酮(dihydroxyacetone phosphate) (EC2.7.1.29)
[0054]在本發明中，特別優選使用以ATP為磷酸供體的二羥基丙酮激酶。
[0055]“經過修飾而升高了二羥基丙酮激酶活性”對應于這樣的情況:與野生株或非修飾株相比，每個細胞平均的二羥基丙酮激酶分子數增加，或者二羥基丙酮激酶的平均每個分子的活性提高。此外，當在野生株中不能檢出的酶活性提高到能夠檢出的程度時，這種情況也包含在所述的“活性升高”中。優選經過修飾使得二羥基丙酮激酶的活性與野生株或非修飾株相比，平均每個菌體提高150%以上、優選200%以上，更希望平均每個菌體提高300%以上。這里，作為對照的屬于腸桿菌科的微生物的野生株包括例如大腸桿菌MG1655株(ATCCN0.47076)和 W3110 株(ATCC` N0.27325)、Pantoea ananatis AJ13335 株(FERM BP-6615)等。二羥基丙酮激酶活性可以參考Johnson EA等的方法來測定(J Bacteriol.19840ct ；160(1):55-60)。
[0056]編碼甘油脫氫酶的基因包括例如gldA基因，這其中希望使用屬于腸桿菌科的微生物來源的gldA基因。作為屬于腸桿菌科的微生物，可以列舉大腸桿菌。這里，作為大腸桿菌的基因，可以列舉例如SEQ ID NO:1的gldA基因(GenBank登錄號NC_000913的堿基序號4135955..4137058的互補鏈)。
[0057]而且，編碼甘油脫氫酶的基因的同源物可以是基于與上述示例的基因的同源性，從埃希氏囷屬、腸桿囷屬、克雷伯氏囷屬、沙雷氏囷屬、歐文氏囷屬、耶爾森囷屬(Yersinia)、志賀氏菌屬(Shigella)、沙門氏菌屬、弧菌屬(vibrio)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、芽抱桿菌屬(Bacillus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、腸球菌屬(Enterococcus)、梭菌屬(Clostridium)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)、朽1 樣酸桿菌屬(Citrobacter)、棒狀桿菌屬細菌等克隆得到的基因。表1示出了與大腸桿菌gldA基因具有高同源性、可以在本發明中作為編碼甘油脫氫酶的基因利用的基因的例子。
[0058][表 I]
[0059]與大腸桿菌gldA基因的同源性高的、編碼甘油脫氫酶的基因
【權利要求】
1.一種生產L-氨基酸的方法,包括: 在含有甘油作為碳源的培養基中培養具有L-氨基酸生產能力且經過修飾而增強了甘油脫氫酶和二羥基丙酮激酶活性的大腸桿菌，從而在該培養基中或菌體內生成和蓄積L-氨基酸，并且 從該培養基或菌體收集L-賴氨酸， 其中所述甘油脫氫酶源自大腸桿菌且所述二羥基丙酮激酶源自釀酒酵母。
2.權利要求1所述的方法，其中所述甘油脫氫酶是具有SEQID N0:2的氨基酸序列的蛋白質。
3.權利要求1所述的方法，其中所述二羥基丙酮激酶以ATP為磷酸供體。
4.權利要求1所述的方法，其中所述二羥基丙酮激酶是具有SEQID N0:4的氨基酸序列的蛋白質。
5.權利要求1所述的方法，其中所述甘油脫氫酶和二羥基丙酮激酶活性是通過增加編碼甘油脫氫酶和二羥基丙酮激酶的基因的拷貝數，和/或修飾所述基因的表達控制序列而增強的。
6.權利要求1所述的方法，其中所述微生物還經過修飾而增強了甘油易化蛋白活性， 其中甘油易化蛋白活性是通過增加編碼甘油易化蛋白的基因的拷貝數，或者將所述基因的啟動子更換成更強的啟動子而增強的。
7.權利要求1所述的方法，其中所述微生物還經過修飾而增強了選自由丙糖磷酸異構酶、果糖二磷酸醛縮酶、果糖1，6- 二磷酸酶和果糖-6-磷酸醛縮酶組成的群組中的I種以上的酶活性。
8.權利要求1所述的方法，其中，所述微生物還經過修飾而降低了甘油激酶和/或膜結合型甘油-3-磷酸脫氫酶的酶活性。
【文檔編號】C12R1/19GK103642863SQ201310367411
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2008年2月22日 優先權日:2007年2月22日
【發明者】長井由利, 林和之, 植田拓嗣, 臼田佳弘, 松井和彥 申請人:味之素株式會社