一種豬印跡基因Slc22a18的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種豬印跡基因Slc22a18及其應(yīng)用，屬于分子遺傳學(xué)領(lǐng)域。通過PCR、序列比較發(fā)現(xiàn)該豬Slc22a18基因第4外顯子79位堿基存在SNP位點(diǎn)，進(jìn)一步應(yīng)用該位點(diǎn)鑒定Slc22a18基因的印跡狀態(tài)。本發(fā)明所公開的豬印跡基因Slc22a18，豐富了豬印跡基因的數(shù)量，為探索印跡基因在不同物種間的保守性、調(diào)控機(jī)制以及在豬生長發(fā)育過程中的功能作用提供信息，可用于以豬作為動(dòng)物模型研究人類Slc22a18基因異常疾病。
【專利說明】—種豬印跡基因Slc22a18
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種印跡基因，尤其涉及一種豬印跡基因Slc22al8及其應(yīng)用，屬于分子遺傳學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]哺乳動(dòng)物是二倍體生物，包含有兩套染色體，一套來源于母本，一套來源于父本。哺乳動(dòng)物的正常發(fā)育需要雙親基因組的正確表達(dá)。在哺乳動(dòng)物中，多數(shù)基因是雙等位基因表達(dá)的。然而，一部分基因的表達(dá)具有親源特異性，只表達(dá)來源于母本或父本的等位基因，這類基因被稱為印跡基因。將母源等位基因表達(dá)，父源等位基因不表達(dá)的基因，稱為父源印跡基因；父源等位基因表達(dá)，母源等位基因不表達(dá)的基因，稱為母源印跡基因。
[0003]印跡基因存在于哺乳動(dòng)物中，作為一類不遵循傳統(tǒng)孟德爾遺傳規(guī)律的特殊基因而存在，其功能體現(xiàn)在對胚胎生長發(fā)育、胎盤功能的調(diào)控以及出生后行為的影響上。印跡基因的異常表達(dá)還引起多種疾病，比如在克隆豬的生產(chǎn)中，主要表現(xiàn)為胚胎和胎盤過度生長及胎盤異常等，主要由于體細(xì)胞的表觀重編程異?；蛴≯E基因異常等所造成。對于印跡基因的研究，始終圍繞著三個(gè)層次展開:印跡基因的篩選鑒定、印跡基因功能的探索、印跡基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制的研究。到目前為止，在小鼠和人中發(fā)現(xiàn)的印跡基因數(shù)量超過150個(gè)，研究內(nèi)容涵蓋了包括基因功能、分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、印跡機(jī)制和疾病相關(guān)等方面。
[0004]與對小鼠和人的研究相比較，印跡基因在豬中的研究仍集中于挖掘與鑒定階段。主要包括了候選印跡基因的克隆，印跡狀態(tài)的鑒定與不同組織器官的差異表達(dá)等方面。印跡基因的主要功能體現(xiàn)在對胚胎和胎盤的影響，印跡基因的異常表達(dá)，在人上會(huì)導(dǎo)致如生長過剩、侏儒癥等各種生長發(fā)育方面的問題，在動(dòng)物中則較明顯的表現(xiàn)為流產(chǎn)率的提高、出生率的降低。
[0005]本發(fā)明根據(jù)印跡基因在哺乳動(dòng)物中具有較高保守性這一特征，利用生物信息學(xué)方法，將小鼠的印跡基因序列與豬的基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行序列比對分析，從而對豬印跡基因進(jìn)行預(yù)測并篩選、鑒定，以此豐富豬印跡基因的數(shù)量，為探索印跡基因在不同物種間的保守性、調(diào)控機(jī)制以及在豬生長發(fā)育過程中的功能作用提供信息。
[0006]SLC22A18 (solute carrier family22, memberl8)，又稱 TSSC5、BWR1A、0RCTL2 等，位于小鼠7號染色體末端和人類染色體11ρ15.5， 編碼跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)體相似蛋白，有十個(gè)跨膜區(qū)，影響藥物敏感性，細(xì)胞代謝和生長。SLC22A18蛋白水平的調(diào)節(jié)可能是通過泛素化一蛋白酶體途徑，SLC22A18是泛素化連接酶RING105的底物，與細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)。
[0007]Slc22A18在小鼠和人類的肝，腎，腸，胚胎外膜和胎盤等組織器官中高表達(dá)。在小鼠胎兒和人類母源偏好表達(dá)，在小鼠的胎盤和TS細(xì)胞中母源等位基因表達(dá)。
[0008]Slc22al8基因的異常還被認(rèn)為與腫瘤有關(guān)。SLC22A18是成人肺的腫瘤抑制基因和胎兒腎印跡性腫瘤抑制基因。AzbreCht在肝母細(xì)胞瘤中有SLC22A18等位基因的丟失，肝癌中存在Slc22al8的印跡獲得。同樣，Schwienbache發(fā)現(xiàn)在人乳腺癌中亦存在Slc22al8基因印跡獲得。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種豬印跡基因Slc22al8，其cDNA序列為SEQID N0.1所示的核苷酸序列。
[0010]所述豬印跡基因Slc22al8在第4外顯子的79位堿基存在SNP位點(diǎn)；所述第4外顯子的序列如序列SEQ ID N0.2所示。 [0011]獲得所述豬印跡基因的方法，主要包括以下步驟:
[0012](I)以豬胎兒成纖維細(xì)胞cDNA為模版，PCR擴(kuò)增獲得Slc22al8基因；所述PCR擴(kuò)增引物為Slc22al8-基因克隆引物；
[0013](2)以豬耳組織DNA模版，分別PCR擴(kuò)增Slc22al8基因第2、3、4、5外顯子，測序法尋找到在第4外顯子第79位堿基存在SNP位點(diǎn)；所述PCR擴(kuò)增引物分別為:Slc22al8_exon2、Slc22al8_exon3、Slc22al8_exon4、Slc22al8_exon5。
[0014]本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供該豬印跡基因Slc22al8在以豬作為動(dòng)物模型研究人類Slc22al8基因異常疾病與腫瘤發(fā)生及指示豬的生長發(fā)育中的應(yīng)用，可用于區(qū)分父母源等位基因、鑒定印跡方向。
[0015]以I月齡仔豬15種組織器官和45d胎盤的cDNA為模板，以Slc22al8_表達(dá)檢測引物為引物，對于第4外顯子79位堿基的SNP位點(diǎn)進(jìn)行cDNA測序，確定其印跡方向，結(jié)果表明，Slc22al8基因在I月齡仔豬各組織器官中均雙等位基因表達(dá)，在45d胎盤中是印跡的、母源等位基因表達(dá)。
[0016]以Slc22al8_realtime引物為引物對I月齡仔豬15種組織器官和胎盤進(jìn)行SYBR法熒光定量PCR，描述基因在各組織器官的表達(dá)模式；結(jié)果表明，Slc22a3在豬各組織器官中廣泛表達(dá)，其中在肝、腎、小腸中的表達(dá)水平顯著高于其他各組織器官。
[0017]本發(fā)明所提供的豬印跡基因Slc22al8，豐富了豬印跡基因的數(shù)量，為探索印跡基因在不同物種間的保守性、調(diào)控機(jī)制以及在豬生長發(fā)育過程中的功能作用提供信息。同時(shí)可應(yīng)用于以豬作為動(dòng)物模型研究人類Slc22al8基因異常疾病與腫瘤發(fā)生，區(qū)分父母源等位基因、鑒定印跡方向。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖lSlc22al8基因克隆引物的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖譜。
[0019]圖2Slc22al8基因測序結(jié)果與NCBI序列比對。
[0020]圖3Slc22al8外顯子基因克隆引物的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖譜。
[0021]圖4Slc22al8_exon4第79位堿基PCR膠回收產(chǎn)物測序峰圖；1:父本c? 021023的耳組織DNA測序峰圖；2:母本早NBBffllOOllO的耳組織DNA測序峰圖；3:F1代仔豬c? 021026的耳組織DNA測序峰圖；4:父本3 021002的耳組織DNA測序峰圖；5:母本早NBBWl 100114的耳組織DNA測序峰圖；6:F1代仔豬早021035的耳組織DNA測序峰圖。
[0022]圖5豬Slc22al8基因印跡表達(dá)狀態(tài)峰圖；1月齡仔豬15種組織器官和胎盤的測序峰圖，I~16分別為:肌肉、脂肪、舌、肝、肺、心、腎、卵巢、子宮、睪丸、脾、胃、小腸、膀胱、腦、胎盤；箭頭指向SNP位點(diǎn)。
[0023]圖6豬Slc22al8在各組織器官的相對表達(dá)水平?！揪唧w實(shí)施方式】
[0024]在本發(fā)明中所使用的術(shù)語，除非有另外說明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。下面結(jié)合具體的制備實(shí)施例和應(yīng)用實(shí)施例，并參照數(shù)據(jù)進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。在以下的實(shí)施例中，未詳細(xì)描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。
[0025]實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基地，用于SNP位點(diǎn)檢測的豬包括大白豬5頭、長白豬10頭、叢江豬4頭和巴馬豬17頭，選取耳組織用于DNA提取。Fl代I月齡雜合仔豬3頭，屠宰選取組織器官，_80°C冰箱保存。所用引物序列見表1。
[0026]表1引物序列表
[0027]
【權(quán)利要求】
1.一種豬印跡基因Slc22al8，其特征在于，其cDNA序列為SEQ ID N0.1所示核苷酸序列。
2.如權(quán)利要求1所述Slc22al8基因，其特征在于，在第4外顯子的79位堿基存在SNP位點(diǎn)；所述第4外顯子的序列如序列SEQ ID N0.2所示。
3.獲得權(quán)利要求1所述豬印跡基因的方法，包括以下步驟: (1)以豬胎兒成纖維細(xì)胞cDNA為模版，PCR擴(kuò)增獲得Slc22al8基因； (2)以豬耳組織DNA模版，分別PCR擴(kuò)增Slc22al8基因第2、3、4、5外顯子，測序法尋找到在第4外顯子第79位堿基存在SNP位點(diǎn)。
4.權(quán)利要求1所述基因Slc22al8在以豬為動(dòng)物模型研究人類Slc22al8基因異常疾病引發(fā)的腫瘤和指示豬的生長發(fā)育中的應(yīng)用。
5.如權(quán)利要求4所述應(yīng)用，其特征在于，可用于區(qū)分父母源等位基因、鑒定印跡方向。
【文檔編號】C12N15/12GK103468706SQ201310409327
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月10日
【發(fā)明者】孔慶然, 尹智, 劉忠華, 周洋 申請人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)