一種豬印跡基因Slc22a3的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種豬印跡基因Slc22a3，屬于分子遺傳學領域。本發明通過克隆獲得Slc22a3基因，并通過比較36頭親本豬耳組織測序結果發現Slc22a3的第10外顯子第20個堿基存在SNP突變，進一步應用該位點鑒定Slc22a3基因的印跡狀態。本發明所公開的豬印跡基因Slc22a3，豐富了豬印跡基因的數量，為探索印跡基因在不同物種間的保守性、調控機制以及在豬生長發育過程中的功能作用提供信息，可用于以豬作為動物模型研究人類Slc22a3基因異常疾病。
【專利說明】—種豬印跡基因Slc22a3 【技術領域】
[0001]本發明涉及一種印跡基因，尤其涉及一種豬印跡基因Slc22a3及其應用，屬于分子遺傳學領域。
【背景技術】
[0002]哺乳動物是二倍體生物，包含有兩套染色體，一套來源于母本，一套來源于父本。哺乳動物的正常發育需要雙親基因組的正確表達。在哺乳動物中，多數基因是雙等位基因表達的。然而，一部分基因的表達具有親源特異性，只表達來源于母本或父本的等位基因，這類基因被稱為印跡基因。將母源等位基因表達，父源等位基因不表達的基因，稱為父源印跡基因；父源等位基因表達，母源等位基因不表達的基因，稱為母源印跡基因。
[0003]印跡基因存在于哺乳動物中，作為一類不遵循傳統孟德爾遺傳規律的特殊基因而存在，其功能體現在對胚胎生長發育、胎盤功能的調控以及出生后行為的影響上。印跡基因的異常表達還引起多種疾病，比如在克隆豬的生產中，主要表現為胚胎和胎盤過度生長及胎盤異常等，主要由于體細胞的表觀重編程異常或印跡基因異常等所造成。對于印跡基因的研究，始終圍繞著三個層次展開:印跡基因的篩選鑒定、印跡基因功能的探索、印跡基因表達調控機制的研究。到目前為止，在小鼠和人中發現的印跡基因數量超過150個，研究內容涵蓋了包括基因功能、分子調控網絡、印跡機制和疾病相關等方面。
[0004]與對小鼠和人的研究相比較，印跡基因在豬中的研究仍集中于挖掘與鑒定階段。主要包括了候選印跡基因的克隆，印跡狀態的鑒定與不同組織器官的差異表達等方面。印跡基因的主要功能體現在對胚胎和胎盤的影響，印跡基因的異常表達，在人上會導致如生長過剩、侏儒癥等各種生長發育方面的問題，在動物中則較明顯的表現為流產率的提高、出生率的降低。
[0005]本發明根據印跡基因在哺乳動物中具有較高保守性這一特征，利用生物信息學方法，將小鼠的印跡基因序列與豬的基因組數據進行序列比對分析，從而對豬印跡基因進行預測并篩選、鑒定，以此豐富豬印跡基因的數量，為探索印跡基因在不同物種間的保守性、調控機制以及在豬生長發育過程中的功能作用提供信息。
[0006]Slc22a3 (solute carrier family22, member3),又稱 0CT3、EMT 等，位于小鼠 17 號染色體和人6號染色體，編碼包含有12個跨膜區的血漿內膜蛋白，作用是消除內源性有機陽離子等。在小鼠中，在胎盤組織和TS (Trophoblast stem cells)細胞中是印跡的,母源等位基因表達，在成體組織中雙等位基因表達。在人上，Slc22a3基因在早期胎盤中是印跡的，母源等位基因表達，在其他時期雙等位基因表達。

【發明內容】

[0007]本發明所要解決的技術問題是提供一種豬印跡基因Slc22a3，其cDNA序列為SEQID N0.1所示的核苷酸序列。
[0008]所述Slc22a3在第10外顯子第20個堿基存在SNP位點，所述第10外顯子序列為SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列。 [0009]獲得所述豬印跡基因Slc22a3的方法，主要包括以下步驟:
[0010](I)以豬胎兒成纖維細胞cDNA為模版，PCR擴增獲得Slc22a3基因；所述 PCR 擴增引物為 cl-Slc22a3 為:正向 5’-CAATGCTTGGATGCTGGAC-3’ 反向:5，-GACGCCAGGATACCAAAGAT-3，；
[0011](2)以豬耳組織DNA為模版，分別PCR擴增Slc22a3基因的第9、10、11外顯子，測序法尋找到在第10外顯子第20個堿基存在SNP位點；所述PCR擴增引物分別為 cl-Slc22a3-exon9:正向 5，-GATACTCGTCAGATTCATTTCCACT-3，反向5，-GTTTATCTTTCATTGCGGTGC-3，，cl-Slc22a3_exonlO:正向 5，-GGGCTTCACTGAGGGTTTGG-3’反向:5’ -CTTTGCTTTGGATGTGAGCT-S’，cl-Slc22a3-exonl1:正向5’-TGCCTTTTCTAGGGCCGCTC-3’ 反向 5’-CACAGGCGTCTCTGAAAGGCAC-3’。
[0012]本發明第二個目的是提供該豬印跡基因Slc22a3在以豬作為動物模型研究人類Slc22a3基因異常疾病與腫瘤發生及指示豬的生長發育中的應用，可用于區分父母源等位基因、鑒定印跡方向中的應用。
[0013]以I月齡仔豬11種組織器官和胎盤cDNA為模板，realtime_Slc22a3為引物,對于Slc22a3在第10外顯子第20個堿基的SNP位點進行cDNA測序，確定其印跡方向，結果表明Slc22a3基因在I月齡仔豬各組織器官中均雙等位基因表達，在胎盤中是印跡的、母源等位基因表達。
[0014]以realtime-SlC22a3為引物對I月齡仔豬11種組織器官和胎盤進行SYBR法熒光定量PCR，描述基因在各組織器官的表達模式，結果表明，Slc22a3基因在豬體內廣泛表達，其中在肺中表達水平最高，肌肉中最低；所述引物realtime-Slc22a3為:正向5，- GCGTTCACCTTGGGCTAC-3，反向 5，-CACAATCCTTCTTTGCTTCG-3，。
[0015]本發明所提供的新的豬印跡基因Slc22a3，豐富了豬印跡基因的數量，為探索印跡基因在不同物種間的保守性、調控機制以及在豬生長發育過程中的功能作用提供信息。本發明所提供的豬Slc22a3基因，可用于以豬作為動物模型研究人類Slc22a3基因異常疾病。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖lSlc22a3基因克隆引物的PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖譜。
[0017]圖2Slc22a3基因測序結果與NCBI序列比對。
[0018]圖3Slc22a3外顯子基因克隆引物的PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖譜。
[0019]圖4Slc22a3_exonlO第20個堿基PCR膠回收產物測序峰圖；1:母本早NBBffl 100113的耳組織DNA測序峰圖；2:父本? 021023的耳組織DNA測序峰圖；3:F1代仔豬的耳組織DNA測序峰圖；箭頭指向SNP位點。
[0020]圖5豬Slc22a3基因印跡表達狀態峰圖；1月齡仔豬11種組織器官和胎盤的測序峰圖，I~12分別為:肌肉、脂肪、舌、肝、肺、心、腎、脾、胃、小腸、腦、胎盤；箭頭指向SNP位點。
[0021]圖6豬Slc22a3在各組織器官的相對表達水平。
【具體實施方式】[0022]在本發明中所使用的術語，除非有另外說明，一般具有本領域普通技術人員通常理解的含義。下面結合具體的制備實施例和應用實施例，并參照數據進一步詳細地描述本發明。應理解，這些實施例只是為了舉例說明本發明，而非以任何方式限制本發明的范圍。在以下的實施例中，未詳細描述的各種過程和方法是本領域中公知的常規方法。 [0023]實驗動物選自東北農業大學大動物實驗基地，用于SNP位點檢測的豬包括大白豬5頭、長白豬10頭、叢江豬4頭和巴馬豬17頭，選取耳組織用于DNA提取。Fl代I月齡雜合仔豬3頭，屠宰選取組織器官，液氮凍存運輸回實驗室，_80°C冰箱保存。所用引物序列見表1。
[0024]表1引物序列
[0025]
_引物名稱_引物序列_
d-Slc22a3-^xou9I:丨丨::5'GATACTCGTCAGATTCATTTCC/\CT3'



)? π.: 5'(--? ΙΛΙ ( I I I CAI I GC 0010( V

cl-.S7V,\^^-cxonlO1: ?；: S1GGGCTTCACTGAGGGTTTGGr


K ； -,CTITGCTTTGGATGTGAGCTT
d-S!c22a3-^xon Il|; π； ； 5TGCX:TTTTCTAGGGCCGCTC3'


H；: S'CAC^Ga-1TCTCTC^
Ql-Sfc22αJI； H；: 5'CAATGCTT(:K:1ATG(；TGGAC?V



}'λ 丨丨::5'GACGCXV\GGATACCAAAG^^
r^\ll\m^-Sic22a3 1: 1.丨::5' GVGV VCALX^llKK^CVACV_、文: 51 G\C//VR CTTCTTTGCTTCG3j_
[0026]實施例lSlc22a3基因的克隆
[0027]以豬胎兒成纖維細胞cDNA為模板，以cl_Slc22a3為引物進行PCR擴增，PCR反應體系為 50 μ L:LA Taq DNA 聚合酶 0.5 μ L，10XLA Taq Buffer (Mg2+Plus)5 μ L, dNTPs8 μ L(Takara)，模板50ng，10ymol/L上下游引物各lyL，ddH20補足。PCR反應條件為:94°C預變性5min ;94°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸60s，40個循環;72°C終延伸IOmin0擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，結果見圖1。
[0028]將PCR產物進行膠回收并連接pMD18-T載體進行測序，得到長度為1077bp的cDNA序列(SEQ ID N0.1)。克隆序列測序結果與NCBI預測序列XM_003121106.1比對，第779位T — C，第 851 位 G — C，見圖 2。
[0029]實施例2Slc22a3基因外顯子的克隆
[0030]以豬耳組織DNA 為模版，分別以 cl-Slc22a3_exon9、cl-Slc22a3_exonlO、cl-Slc22a3-exonll為引物對Slc22a3的外顯子9、外顯子10及外顯子11進行PCR擴增，PCR 反應體系為 50 μ L:Ex Taq DNA 聚合酶 0.25 μ L，IOXEx Taq Buffer (Mg2+Plus)5 μ L, dNTPs4 μ L (Takara),模板 50ng, 10 μ mol/L 上下游引物各 I μ L, ddH20 補足。PCR 反應條件為:94°C預變性5min ;94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸30s，40個循環；72°C終延伸lOmin，擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，結果見圖3。
[0031]實施例3Slc22a3基因外顯子SNP的尋找
[0032]根據實施例2中的方法，對36頭親本豬的耳組織進行測序比對，用于SNP位點的檢測，見圖4，結果表明，在巴馬豬早NBBWl 100113與巴馬豬? 021023的Slc22a3第10外顯子第20個堿基存在SNP突變，第10外顯子序列如SEQ ID N0.2所示。[0033]實施例4Slc22a3基因印跡狀態鑒定
[0034]選擇雜合型的Fl代仔豬進行印跡狀態分析。以realtime-Slc22a3為引物，I月齡仔豬11種組織器官和胎盤cDNA為模板，檢測該基因在各組織器官中的印跡表達狀態，見圖5，測序結果表明，Slc22a3基因在I月齡仔豬各組織器官中均雙等位基因表達，在胎盤中是印跡的、母源等位基因表達。
[0035]實施例5Slc22a3基因在各組織器官的表達水平分析
[0036]為了檢測Slc22a3基因在豬中各組織器官的表達水平， 以11種組織器官和胎盤cDNA為模版、以realtime-SlC22a3為引物使用SYBR實時定量PCR對仔豬11種組織器官和胎盤的Slc22a3表達水平進行分析，見圖6，結果表明，Slc22a3基因在豬體內廣泛表達，其中在肺中表達水平最高，肌肉中最低。
[0037]雖然本發明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發明的精神和范圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發明的保護范圍應該以權利要求書所界定的為準。
【權利要求】
1.一種豬印跡基因Slc22a3，其特征在于其cDNA序列為SEQ ID N0.1所示核苷酸序列。
2.如權利要求1所述豬印跡基因，其特征在于，在第10外顯子第20個堿基存在SNP位點；所述第10外顯子序列為SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列。
3.獲得權利要求1所述豬印跡基因Slc22a3的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1）以豬胎兒成纖維細胞cDNA為模版，PCR擴增獲得Slc22a3基因； (2)以豬耳組織DNA為模版，分別擴增Slc22a3基因的第9、10、11外顯子，測序法尋找到在第10外顯子第20個堿基存在SNP位點。
4.權利要求1所述基因在以豬為動物模型研究人類Slc22a3基因異常疾病和指示豬的生長發育中的應用。
5.權利要求4中所述基因的應用，其特征在于，可用于區分父母源等位基因、鑒定印跡方向。
【文檔編號】C12Q1/68GK103468705SQ201310409326
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月10日 優先權日:2013年9月10日
【發明者】孔慶然, 尹智, 劉忠華, 周洋 申請人:東北農業大學