Rna恒溫擴增的禽流感病毒h7n9(2013)核酸檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種RNA恒溫擴增的禽流感病毒H7N9（2013）核酸檢測試劑盒，包括：病毒保存液、核酸提取液、洗滌液、H7N9（2013）反應液、H7檢測液、N9檢測液、SAT酶液、H7N9（2013）陽性對照、H7N9（2013）陰性對照試劑。本發明的檢測試劑盒具有特異性高、靈敏度高、低污染和快速檢測的特點，在禽流感病毒H7N9（2013）的早期感染的臨床診斷中發揮重要作用。
【專利說明】RNA恒溫擴增的禽流感病毒H7N9 (2013)核酸檢測試劑盒

【技術領域】
[0001] 本發明涉及體外診斷試劑【技術領域】，具體涉及一種利用磁珠-RNA富集技術提取 純化靶標RNA及恒溫核酸同步放大檢測技術（SAT )對禽流感病毒H7N9 (2013 )進行檢測的 試劑盒。通過本發明的試劑盒可實現對禽類糞便等分泌物和人類咽鼻等分泌物中禽流感病 毒H7N9 (2013)的檢測。

【背景技術】
[0002] 禽流感病毒屬正粘病毒科甲型流感病毒屬，病毒顆粒呈多形性，其中球形直徑 80?120nm，有囊膜。禽甲型流感病毒除感染禽外，還可感染人、豬、馬、水貂和海洋哺乳動 物。2013年發生的人感染禽流感H7N9為新型重配病毒，其內部基因來自于H9N2禽流感病 毒。人感染H7N9禽流感是由H7N9亞型禽流感病毒引起的急性呼吸道傳染病。
[0003] 患者一般表現為流感樣癥狀，如發熱、咳嗽、少痰，可伴有頭痛、肌肉酸痛和全身不 適。重癥患者病情發展迅速，多在5-7天出現重癥肺炎，體溫大多持續在39°C以上，呼吸困 難，可伴有咯血痰；可快速進展為急性呼吸窘迫綜合征、膿毒癥、感染性休克，甚至多器官功 能障礙，部分患者可出現縱隔氣腫、胸腔積液等。
[0004] 目前，實驗室檢測方法有病毒分離法、直接測序、抗原檢測法、核酸檢測法。
[0005] 病毒分離培養，常用有雞胚接種法和細胞培養法，此法對病毒分離法較敏感，但操 作繁雜費時，無法滿足病毒流行期間同時處理大量樣本的需要。
[0006] 抗原檢測法靈敏度較低，不易推廣應用； H7N9為RNA病毒，如果通過直接測序，需先進行轉錄酶-聚合酶鏈式反應（Reverse Transcriptase-PCR，簡稱RT-PCR)。RT-PCR法需要經歷幾十個溫度變化的循環過程，擴增 反應時間長，且產物為DNA，易污染，且容易造成實驗結果的假陽性現象。
[0007] 核酸檢測法包括檢測DNA的實時突光聚合酶鏈式反應（Real Time Fluorescent PCR，簡稱RF-PCR)和檢測RNA的恒溫擴增檢測法，如轉錄介導擴增（Transcription Mediated Amplification，TMA)，實時突光核酸恒溫擴增（Simultaneous Amplification and Testing，SAT)。實時熒光PCR法，靈敏度和準確度較高，但同樣存在易污染，易造成實 驗結果假陽性。因此，開發一種快速、靈敏、特異且不易污染的試劑盒非常必要。
[0008] TM和SAT技術因直接擴增RNA，可快速、高靈敏度、高特異性的進行檢測，目前尚 未有TM的H7N9試劑盒的任何報道。
[0009] 本公司已申請了專利核酸恒溫同步放大檢測方法（Simultaneous Amplification and Testing，SAT) (ZL 200810111479. 0)以及利用磁珠-RNA富集技術提取純化靶標RNA 的方法（ZL 200810111478. 6);在此兩項技術的基礎上，本發明禽流感H7N9 (2013)核酸檢 測試劑盒采用的是SAT技術，核酸擴增使用M-MLV反轉錄酶和17 RNA多聚酶來同時實現， 反轉錄酶用于產生靶標核酸（RNA)的一個DNA拷貝，T7 RNA聚合酶從DNA拷貝上產生多個 RNA拷貝，帶有熒光標記的優化探針和擴增后產生的RNA拷貝特異結合，從而產生熒光，該 熒光信號可由檢測儀器捕獲。
[0010] 在使用已知的磁珠-RNA富集技術和SAT技術（S卩RNA恒溫擴增）檢測臨床樣本中 某特定靶核酸的實踐中，為了減少和避免檢測結果的假陰性或假陽性，提高檢測的準確性， 一個關鍵性的技術環節是如何基于已知的靶多核苷酸序列設計并制備適當的捕獲探針、弓丨 物和單鏈核苷酸探針。本發明人將RNA恒溫擴增檢測技術應用于禽流感病毒H7N9 (2013) 的檢測，成功完成了本發明。


【發明內容】

[0011] 本發明涉及一種RNA恒溫擴增的禽流感病毒H7N9 (2013)核酸檢測試劑盒，特別 是涉及以磁珠-RNA富集技術和SAT恒溫擴增檢測技術早期、快速診斷人咽拭子和鼻拭子等 臨床樣本中禽流感病毒H7N9 (2013)存在的試劑盒。
[0012] 因此，本發明的目的是提供一種使用磁珠-RNA富集技術和SAT恒溫擴增檢測技術 來定性檢測人咽拭子和鼻拭子等臨床樣本中禽流感病毒H7N9 (2013)的試劑盒，特別是涉 及禽流感病毒H7N9 (2013)的早期感染在實驗室診斷中的應用。其基本原理為：首先由捕 獲探針對靶核酸(靶核酸序列如序列表中序列2、序列6)進行捕獲；然后利用帶17啟動子 的下游引物、特異上游引物和特異單鏈核酸探針，使用M-MLV反轉錄酶和17 RNA多聚酶來 同時實現核酸擴增，帶有熒光標記的優化探針和擴增后產生的RNA拷貝特異結合，從而產 生熒光，該熒光信號可由熒光檢測儀器捕獲。
[0013] 本發明提供了一種RNA恒溫擴增的禽流感病毒H7N9 (2013)核酸檢測試劑盒，試 劑盒包括：（1)分別裝有病毒保存液、核酸提取液、洗滌液、H7N9 (2013)反應液、H7檢測液、 N9檢測液、SAT酶液、H7N9 (2013)陽性對照、H7N9 (2013)陰性對照并加蓋密封的多個試 劑瓶或管，和（2)分隔并集中包裝這些試劑瓶或者管的包裝盒，其中H7檢測液、N9檢測液分 別包含一對上游引物、5'端帶有17啟動子序列的下游引物、兩端分別共價標記有熒光染料 和淬滅劑的單鏈核酸探針，所述的核酸提取液包括磁珠和捕獲探針。
[0014] 在另一優選例中，所述核酸提取液中用于靶核酸捕獲的探針序列如序列表中序列 1所示。
[0015] 在另一優選例中，所述H7檢測液的上游引物nT7的核苷酸序列如序列表中序列3 所示；下游引物T7的核苷酸序列如序列表中序列4所示，H7檢測探針的核苷酸序列如序列 表中序列5所示，5'端標記FAM熒光基團，3'端標記DABCYL淬滅基團。
[0016] 在另一優選例中，所述N9檢測液的上游引物nT7的核苷酸序列如序列表中序列7 所示；下游引物T7的核苷酸序列如序列表中序列8所示，N9檢測探針的核苷酸序列如序列 表中序列9所示，5'端標記FAM熒光基團，3'端標記DABCYL淬滅基團。
[0017] 在另一優選例中，所述的待測核酸來自于禽類糞便等分泌物或人類咽鼻分泌物樣 品中的核酸。
[0018] 應理解，在本發明范圍內中，本發明的上述各技術特征和在下文（如實施例） 中具體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方 案。限于篇幅，在此不再一一累述。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019] 圖1H7靈敏度檢測圖。
[0020] 圖2 N9靈敏度檢測圖。
[0021] 圖3 H7特異性檢測圖。
[0022] 圖4 N9特異性檢測圖。
[0023]

【具體實施方式】 下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。
[0024] 實施例1 :禽流感病毒H7N9 (2013)核酸檢測試劑盒檢測試劑的研制及優化 1、捕獲探針（TC0)、引物和靶核酸檢測探針的設計： 通過對Genbank數據庫已有的禽流感病毒H7N9 (2013)核酸序列進行序列比對分析， 以禽流感病毒H7N9 (2013)的HA的保守基因片段及NA的保守基因片段為擴增靶位點，選 擇無二級結構且高度保守的區段設計引物和探針。
[0025] 2、提取體系和反應體系的建立與優化： 本發明的提取體系和反應體系參照專利ZL 200810111479. 0和ZL 200810111478. 6， 除了捕獲探針（TC0)、引物和檢測探針序列、濃度及反應時間。因此本發明主要是對捕獲探 針（TC0)、引物和檢測探針進行篩選，并對反應時間進行確定。
[0026] 參考品的準備：以體外構建、轉錄和測序鑒定為HA基因 RNA陽性及NA基因 RNA陽 性做為靈敏度參考品； 引物、靶核酸檢測探針的篩選：以上述設計的多組引物、靶核酸檢測探針分別檢測以上 參考品，經過反復試驗，篩選出特異性、靈敏度和重復性好的最佳引物和靶核酸檢測探針。
[0027] 捕獲探針（TCO)的篩選：以上述1中設計的多組捕獲探針（TCO)對上述參考品進 行提取，然后將提取產物用上述篩選出的最佳引物、靶核酸檢測探針進行進行檢測，經過反 復試驗，篩選出靈敏度和重復性好的最佳捕獲探針（TCO)。
[0028] 引物、靶核酸檢測探針的濃度優化：在反應體系中其他組分不變的情況下，分別使 用從0. I U M至I ii M濃度的引物和從0. 05 ii M至0. 5 ii M濃度梯度的H7、N9核酸檢測探針進 行SAT反應，經過多次重復試驗，最終確定最佳的HA基因檢測的上游引物濃度為0. 27 ii M、 下游引物濃度為0.27 iiM，H7檢測探針濃度為0. 18 iiM。NA基因檢測的上游引物濃度為 0. 27 ii M、下游引物濃度為0. 27 ii M，N9檢測探針濃度為0. 18 ii M。
[0029] 捕獲探針（TCO)濃度的優化：在提取體系中其他組分不變的情況下，分別使用從 0. I y M至10 y M濃度梯度的TCO進行靶核酸提取，然后將提取產物用上述篩選好的引物、靶 核酸檢測探針進行SAT檢測，經過多次重復試驗，最終確定最佳的TCO濃度為0. 25 ii M。
[0030] 反應液中各組分濃度的優化：在反應體系中其他組分不變的情況下，參照專利 200810111479. 0中反應液各組分的濃度范圍進行SAT檢測，最終確定反應液中最佳組分 為：25mM Tris，20mM KCl，10mM MgCl2,5mM NTPs，lmM dNTPs，5% (V/V)甘油。
[0031] SAT酶液中各組分濃度的優化：在反應體系中其他組分不變的情況下，經過多次 重復試驗，最終確定SAT酶液中最佳組分為：2000U M-MLV反轉錄酶、2000U 17 RNA聚合酶， 20 mM Tris，0. 1% (V/V) Triton X-100,30mM KCl，0.01mM EDTA，0. ImM DTT，50% (V/V)甘 油。
[0032] 病毒保存液中各組分濃度的優化：在提取體系其他組分不變的情況下，經過多次 重復試驗，確定病毒保存液最佳組分為：50mMTris (pH7.0)，0.1% (V/V) SDS，1% (V/V) Triton X-100,0. 1% (V/V) NP-40〇
[0033] 核酸提取液體中磁珠濃度的優化：在提取體系其他組分不變的情況下，經過多次 重復試驗，確定磁珠的最佳濃度為250mg/mL。
[0034] 實施例2禽流感病毒H7N9 (2013)核酸檢測試劑盒的組成及檢測 1、制備包括下列組成組分的試劑盒： 試劑盒分為標本處理單元A盒和核酸擴增檢測單元B盒。A盒包括病毒保存液，核酸提 取液、洗滌液；B盒包括H7N9 (2013)反應液、H7檢測液、N9檢測液、SAT酶液、H7N9 (2013) 陽性對照、H7N9 (2013 )陰性。
[0035] 具體的： 病毒保存液：含有 50mM Tris (pH7.0)，0.1% (V/V) SDS，1% (V/V) Triton X-100， 0? 1% (V/V) NP-40 的溶液。
[0036] 核酸提取液：含有250mg/mL磁珠和0. 25 ii M捕獲探針（TCO)的溶液。捕獲探針序 列為：5> accaaccaacaatttgagttgatagacaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa, 3〇
[0037] 洗滌液：含有150mM NaCl的溶液。
[0038] H7N9 (2013)反應液：25mM Tris，20mM KC1，IOmM MgCl2, 5mM NTPs，ImM dNTPs，5% (V/V)甘油的溶液。
[0039] H7 檢測液：含有 0? 27iiM 上游引物（H7 n!7)、0. 27iiM 下游引物（H7 I7)、0. 18iiM 單鏈靶核酸檢測探針的溶液，具體的為： H7 nT7 引物的序列為：5' ttacacatatgaagacaa' 3。
[0040] H7 17 引物序列為：5，aatttaatacgactcactatagggagaatagaatacagattgacccagtc a' 3〇
[0041] N9 檢測探針序列為：5' ccaggugaugccccgaagccugg' 3。
[0042] N9 檢測液：含有 0? 27iiM 上游引物（N9 n!7)、0. 27iiM 下游引物（N9 I7)、0. 18iiM 單鏈靶核酸檢測探針的溶液，具體的為： N9 nT7 引物的序列為：5' attgacatcctggatttgcc' 3。
[0043] N9 T7 引物序列為：5' aatttaatacgactcactatagggagaccctgataagctggccact，3。
[0044] N9 檢測探針序列為：5' ccaggcuaguacuugaccccugg' 3。
[0045] SAT 酶液：含有 2000U M-MLV 反轉錄酶、2000U 17 RNA 聚合酶，20 mM Tris，0. 1% (V/V) Triton X-100,30mM KC1，0. OlmM EDTA，0. ImM DTT，50% (V/V)甘油。
[0046] H7N9 (2013)陽性對照：含有H7N9 (2013)HA部分基因和NA部分基因的體外轉錄 RNA稀釋物，濃度分別為I X 106copies/mL。
[0047] H7N9 (2013 )陰性：為生理鹽水和裂解液I : 1混合的溶液。
[0048] 2、樣品采集、運送和保存 (1)樣品采集，預處理 拭子和采集管要求：標本應使用頭部為合成纖維的拭子(如聚酯纖維)，用鋁或塑料做 柄(不推薦棉拭子和木柄)。標本采集管中應含有3毫升無菌病毒采樣液(含有蛋白質穩定 齊U，阻止細菌和真菌生長的抗生素，緩沖液)。
[0049] (3)樣本運輸 標本采集后立即用冰塊或冰排保存或置于4°C (冰箱)，低溫密閉送檢，不能立即檢測的 保存在4°C (不能超過4天）或者-70°C或-70°C以下。
[0050] 3、檢測步驟 (1)核酸提取 H7陽性對照制備：取0. 2ml生理鹽水，加入IOiU陽性對照品，混勻備用。
[0051] N9陽性對照制備：取0. 2ml生理鹽水，加入10 陽性對照品，混勻備用。
[0052] H7陰性對照制備：取0. 2ml生理鹽水，加入10 ill陰性對照品，混勻備用。
[0053] N9陰性對照制備：取0. 2ml生理鹽水，加入10 ill陰性對照品，混勻備用。
[0054] 使用潔凈Tip頭分別吸取0. 2ml待測樣本（每份樣本取兩份，一份用于H7檢測， 一份用于N9檢測）、H7陽性對照、H7陰性對照、N9陽性對照和N9陰性對照，加入對應標記 的樣品處理管； 每管分別加入200 ii 1病毒保存液和100 ii 1核酸提取液(用前混勻)，10 ii 1上述準備 的內標，關蓋震蕩30秒；置于60°C保溫5分鐘；然后室溫放置10分鐘。
[0055] 將樣品處理管置于磁珠分離裝置上，靜置5分鐘(如果在磁珠吸附過程中有個別 磁珠難以吸附至管壁則應適當延長吸附時間）。
[0056] 待磁珠吸附于管壁后，保持樣品處理管于磁珠分離裝置上，吸棄液體，保留磁珠。
[0057] 用洗滌液(洗滌液如果有白色絮狀沉淀物，用之前應先42°C加熱，直至澄清）洗滌 兩次，每次加入Iml洗滌液后取下樣品處理管震蕩30秒后置磁珠分離裝置上，靜置5分鐘； 保持樣品處理管于磁珠分離裝置上，吸棄液體，保留磁珠。
[0058] 將樣品處理管移離磁珠分離裝置，管中的磁珠-核酸復合物備用（此步應清晰可 見磁珠)。
[0059] 每管分別加入40 iU相應擴增檢測液，震蕩混勻。
[0060] (2) SAT 擴增 從震蕩混勻后的上述擴增檢測液中取，取30 iU磁珠懸液至新的微量反應管中，60°C 保溫10分鐘，42°C保溫5分鐘；同時將SAT酶液也預熱到42°C。
[0061] 向微量反應管中加入10 ill已預熱的SAT酶液(加樣tip頭不要接觸微量反應管， 如有接觸請務必更換tip頭)，加酶后蓋上管蓋1200rpm震蕩15秒鐘混勻。
[0062] 將微量反應管快速轉至合適的恒溫熒光檢測儀器，42°C反應60分鐘，設定每1分 鐘檢測一次熒光，共檢測60次。
[0063] (3)結果與分析 閾值設定：以閾值線剛好超過正常陰性對照擴增曲線的最高點。讀取dt值，dt表示樣 本曲線與閾值線交點的橫坐標讀數(與一般實時熒光PCR實驗結果的ct值類似)。
[0064] 結果判斷：

【權利要求】
1. 一種RNA恒溫擴增的禽流感病毒H7N9 (2013)核酸檢測試劑盒，試劑盒包括：（1)分 別裝有病毒保存液、核酸提取液、洗滌液、H7N9 (2013)反應液、H7檢測液、N9檢測液、SAT 酶液、H7N9 (2013)陽性對照、H7N9 (2013)陰性對照并加蓋密封的多個試劑瓶或管，和（2) 分隔并集中包裝這些試劑瓶或者管的包裝盒，其中所述的H7檢測液、N9檢測液分別包含一 對上游引物、5'端帶有17啟動子序列的下游引物、兩端分別共價標記有熒光染料和淬滅劑 的單鏈核酸探針，所述的核酸提取液包括磁珠和捕獲探針。
2. 根據權利要求1的試劑盒，其特征在于：所述的捕獲探針序列如序列表中序列1所 /_J、i 〇
3. 根據權利要求1的試劑盒，其特征在于：所述的H7檢測液的上游引物nT7的核苷酸 序列如序列表中序列3所示；下游引物17的核苷酸序列如序列表中序列4所示，H7檢測探 針的核苷酸序列如序列表中序列5所示，5'端標記FAM熒光基團，3'端標記DABCYL淬滅基 團。
4. 根據權利要求1的試劑盒，其特征在于：所述的N9檢測液的上游引物n!7的核苷酸 序列如序列表中序列7所示；下游引物17的核苷酸序列如序列表中序列8所示，N9檢測探 針的核苷酸序列如序列表中序列9所示，5'端標記FAM熒光基團，3'端標記DABCYL淬滅基 團。
5. 根據權利要求1的試劑盒或權利要求3所述的引物、探針的用途，其特征在于，用于 檢測禽類糞便等分泌物或人類咽鼻等分泌物樣品中是否存在禽流感病毒H7N9 (2013)。
【文檔編號】C12Q1/70GK104450953SQ201310415686
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2013年9月12日 優先權日:2013年9月12日
【發明者】尹華立, 白立志, 馬道亮, 于明輝, 居金良 申請人:上海仁度生物科技有限公司