一種測(cè)定發(fā)酵乳活菌總數(shù)的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種測(cè)定發(fā)酵乳活菌總數(shù)的方法，所述方法是通過向發(fā)酵乳樣品中加入預(yù)稀釋體積分?jǐn)?shù)為2-6%的2g/L?EDTA溶液，然后稀釋發(fā)酵乳樣品并調(diào)節(jié)pH值為6.8-8.8，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算發(fā)酵乳樣品活菌總數(shù)。本發(fā)明能使發(fā)酵乳稀釋液在短時(shí)間內(nèi)變澄清，菌體細(xì)胞均勻分散，免去測(cè)定過程中對(duì)樣品稀釋液振蕩20min左右的步驟且測(cè)定結(jié)果的精密度要高于GB4789.35-2010測(cè)定結(jié)果的精密度。
【專利說明】一種測(cè)定發(fā)酵乳活菌總數(shù)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種食品檢測(cè)方法，具體地說，涉及一種測(cè)定發(fā)酵乳活菌總數(shù)的方法?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]益生菌具有多種調(diào)節(jié)生理功能的作用，如促進(jìn)消化作用，調(diào)節(jié)胃腸道菌群平衡，糾正腸道的功能紊亂，調(diào)節(jié)免疫，降低血清膽固醇等。益生菌進(jìn)入人體并發(fā)揮上述功效的主要產(chǎn)品載體是益生菌發(fā)酵乳。因此，益生菌發(fā)酵乳中的活菌數(shù)是保證其功能特性的關(guān)鍵因素，要獲得理想的效果，益生菌必需達(dá)到足夠多的數(shù)量。判斷市售產(chǎn)品以及文獻(xiàn)方法制備的發(fā)酵乳產(chǎn)品品質(zhì)的一項(xiàng)重要指標(biāo)就是測(cè)定其中的活菌總數(shù)。
[0003]目前乳酸菌活菌計(jì)數(shù)的方法主要采用GB4789.35-2010 (國標(biāo)法)中改良MRS固體培養(yǎng)基平板傾注法。其方法主要適用于含活性乳酸菌的食品中乳酸菌的檢驗(yàn)，步驟主要是將樣品用生理鹽水稀釋成1:10的樣品勻液，而在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行具體操作步驟中，其制備過程一般需要用手或放于搖床上振蕩20min左右，使樣品中的微生物細(xì)胞分散。然后逐級(jí)稀釋成一系列的稀釋菌液，選擇2-3個(gè)稀釋度采用傾注法進(jìn)行培養(yǎng)，并對(duì)培養(yǎng)基中形成的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)(GB4789.35-2010.食品安全國家標(biāo)準(zhǔn):食品微生物學(xué)檢驗(yàn)[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010)。
[0004]有文獻(xiàn)采用直接鏡檢計(jì)數(shù)法來測(cè)定活性酸乳中的活菌總數(shù)。方法是將樣品適當(dāng)稀釋后涂片染色，在顯微鏡下計(jì)數(shù)一定面積內(nèi)定量樣品中乳酸菌的數(shù)量，再根據(jù)取樣量和稀釋倍數(shù)計(jì)算每毫升樣品所含乳酸菌總數(shù)。通過與國標(biāo)檢測(cè)方法測(cè)得的結(jié)果相比較，該方法可快速、準(zhǔn)確、直接地計(jì)數(shù)乳酸菌總數(shù)(辛若竹，劉洋來，魏昆民.活性酸乳中乳酸菌的直接鏡檢計(jì)數(shù)法[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2007，17 (3):476-477.)。
[0005]上述方法用于測(cè)定發(fā)酵乳活菌總數(shù)的時(shí)候，則存在一定的問題。由于發(fā)酵的過程中，產(chǎn)生的乳酸使酪蛋白發(fā)生凝集沉淀，采用國標(biāo)法測(cè)定的過程中，使用生理鹽水稀釋發(fā)酵乳的時(shí)候，很難保證在振蕩的過程中使菌體分散均勻，而且振蕩20min分鐘以后，若不馬上移取稀釋液，則會(huì)出現(xiàn)分層的現(xiàn)象。采用直接鏡檢計(jì)數(shù)法來測(cè)定活性酸乳中的活菌總數(shù)時(shí)同樣難以保證稀釋的發(fā)酵乳中菌體的均勻分散性。這不僅給后期取樣的測(cè)定帶來一定困難，而且當(dāng)菌體分散不均勻的時(shí)候，將會(huì)降低測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。
[0006]有文獻(xiàn)采用平板計(jì)數(shù)的方法，研究了不同振蕩時(shí)間對(duì)合生素中芽孢桿菌檢出量的影響，結(jié)果表明當(dāng)振蕩時(shí)間為40min后產(chǎn)品中的菌含量基本穩(wěn)定。采用適當(dāng)振蕩時(shí)間才能更精確的顯示產(chǎn)品中有效菌的含量。因?yàn)榫w從載體上解析并均勻分散到溶液中需要一定的時(shí)間。振蕩充分才能避免因菌體未完全釋放而引起結(jié)果中細(xì)菌含量偏低的現(xiàn)象(孫笑非，李超.細(xì)菌菌落總數(shù)檢測(cè)常見誤差原因分析[J].飼料研究，2010 (6):72-73)。
[0007]乙二胺四乙酸(EDTA)是一種能與Mg2+、Ca2+、Mn2+、Fe2+等二價(jià)金屬離子結(jié)合的一種螯合劑。有文獻(xiàn)根據(jù)發(fā)酵乳中酪蛋白酸鈣ca2+在堿性條件下與鹽類絡(luò)合而使發(fā)醉乳凝膠均勻分散成溶液狀態(tài)的原理，將296EDTA液與乳樣以9:1的比例混合后，在堿性條件(pH=ll-12)使乳凝膠均勻分散，并在波長為410mn下進(jìn)行比色，來測(cè)定乳中乳酸菌的生長程度一生物量。經(jīng)實(shí)驗(yàn)表明:乙二胺四乙酸絡(luò)合鈣離子能力強(qiáng)，對(duì)溶液的分散程度及菌體細(xì)胞的穩(wěn)定性都優(yōu)于其它試劑，而且EDTA對(duì)細(xì)胞的裂解作用極其輕微，可忽略不計(jì)(呂力平，董曉波，肖銳.發(fā)酵乳品中乳酸菌生物量測(cè)定方法的研究[J].肉品衛(wèi)生，1997 (2):3-7)。
[0008]當(dāng)環(huán)境的pH值超過了乳酸菌保持胞內(nèi)pH動(dòng)態(tài)平衡的能力時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的pH值也會(huì)隨之變化，因而乳酸菌的生長受到抑制，甚至死亡(熊素玉，姚新奎，譚小海，等不同溫度及PH條件對(duì)乳酸菌生長影響的研究[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，43 (6):533-538)。本發(fā)明通過大量的實(shí)驗(yàn)證明，當(dāng)周圍的環(huán)境PH值大于11時(shí)，部分菌體將會(huì)死亡，使測(cè)定的活菌總數(shù)下降。OD值測(cè)定的是活菌和死菌的總吸光度，因此文獻(xiàn)采用堿性條件(pH=ll-12)測(cè)定OD值，并不適用于活菌總數(shù)的測(cè)定。
[0009]另外，文獻(xiàn)表明，EDTA對(duì)細(xì)胞的裂解作用極其輕微，可忽略不計(jì)。但是并沒有證明高濃度的EDTA不會(huì)破壞細(xì)胞的滲透壓平衡而導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。本發(fā)明通過大量的實(shí)驗(yàn)證明，加入體積分?jǐn)?shù)為2-6%的EDTA溶液測(cè)定的活菌總數(shù)比加入體積分?jǐn)?shù)大于6%的EDTA溶液測(cè)定的活菌總數(shù)要大。文獻(xiàn)中采用EDTA液與乳樣以9:1的比例測(cè)定OD值時(shí)，對(duì)維持菌體的滲透壓平衡有很大的影響，會(huì)造成部分菌體的死亡，并不合適活菌總數(shù)的測(cè)定。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種測(cè)定發(fā)酵乳活菌總數(shù)的方法。
[0011]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供了一種測(cè)定發(fā)酵乳活菌總數(shù)的方法，所述方法是通過向發(fā)酵乳樣品中加 入預(yù)稀釋體積分?jǐn)?shù)為2-6%的2g/L EDTA溶液，然后稀釋發(fā)酵乳樣品并調(diào)節(jié)PH值為6.8-8.8，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算發(fā)酵乳樣品活菌總數(shù)。
[0012]進(jìn)一步地，所述方法包括如下步驟:
[0013]I)配制 2g/L EDTA 溶液；
[0014]2)向發(fā)酵乳樣品中加入預(yù)稀釋體積分?jǐn)?shù)為2-6%的2g/L EDTA溶液；
[0015]3)用 IMNaOH 溶液調(diào)節(jié) pH 值為 6.8-8.8 ；
[0016]4)將步驟3)得到的發(fā)酵乳稀釋液搖勻，待稀釋液中沒有乳濁狀的顆粒后，靜置30s左右，即成KT1稀釋液，整個(gè)操作過程不超過2min ;連續(xù)制成一系列稀釋度菌液供平板接種用，選擇lO'lO'lO—W個(gè)稀釋度采用傾注法在37°C條件下培養(yǎng)48h左右，且每個(gè)稀釋度做2個(gè)MRS瓊脂平板，最后對(duì)培養(yǎng)基中形成的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)；
[0017]5)根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果計(jì)算發(fā)酵乳活菌總數(shù)。
[0018]優(yōu)選地，向發(fā)酵乳樣品中加入預(yù)稀釋體積分?jǐn)?shù)為2-3%的2g/LEDTA溶液。
[0019]優(yōu)選地，稀釋發(fā)酵乳樣品并調(diào)節(jié)pH值為7-8。
[0020]優(yōu)選地，所述EDTA溶液的pH值為11.8-13.2。
[0021]優(yōu)選地，發(fā)酵乳樣品被稀釋10倍。
[0022]更為具體地，所述方法包括如下步驟:
[0023]I)配置固液比為2g/L的EDTA溶液:準(zhǔn)確稱取2g左右的EDTA (分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)，10009617,乙二胺四乙酸)，為使EDTA充分溶解，加入60_70mL左右的Imol/LNaOH溶液以及蒸餾水，使液體加入量為1L，得到pH值為11.8-13.2的EDTA溶液。[0024]2)將上述EDTA溶液，試驗(yàn)過程中用到的試劑(生理鹽水、NaOH溶液等)以及玻璃器皿在121 °C的條件下滅菌15min。
[0025]3)在超凈工作臺(tái)上，于干凈的錐形瓶中加入2-6%(總體積為250mL)上述滅菌EDTA溶液，以及25mL待測(cè)發(fā)酵乳，迅速加入滅菌的生理鹽水至總體積為245mL，得到發(fā)酵乳稀釋液。用lmol/L滅菌的NaOH溶液調(diào)節(jié)發(fā)酵乳稀釋液pH值在6.8-8.8。最后加入生理鹽水使發(fā)酵乳稀釋液的總體積為250mL，測(cè)定溶液最終pH值。
[0026]4)將步驟3)得到的最終pH值為6.79-8.79的發(fā)酵乳稀釋液迅速搖勻，待稀釋液中沒有乳濁狀的顆粒后，靜置30s左右，即成KT1稀釋液，整個(gè)操作過程不超過2min。再用ImL無菌吸管吸取KT1稀釋液ImL移入9mL無菌生理鹽水中，吹吸或振蕩數(shù)次，即成10_2稀釋液，按此方法，連續(xù)制成一系列稀釋度菌液供平板接種用。選擇lO'lO'lO—W個(gè)稀釋度采用傾注法在37 °C條件下培養(yǎng)48h左右，且每個(gè)稀釋度做2個(gè)MRS瓊脂平板，最后對(duì)培養(yǎng)基中形成的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)。
[0027]5)計(jì)算待測(cè)發(fā)酵乳活菌總數(shù)。
[0028]必要情況下，參照GB4789.35-2010所述方法進(jìn)行乳酸菌菌種鑒定。
[0029]選取菌落數(shù)在30CFU-300CFU之間、無蔓延菌落生長的平板計(jì)數(shù)菌落總數(shù)。每個(gè)稀釋度的菌落數(shù)采用兩個(gè)平板的平均數(shù)。若只有一個(gè)稀釋度平板上的菌落數(shù)在30CFU-300CFU之間，則樣品中活菌總數(shù)的計(jì)數(shù)按公式(I)計(jì)算:
【權(quán)利要求】
1.一種測(cè)定發(fā)酵乳活菌總數(shù)的方法，其特征在于，所述方法是通過向發(fā)酵乳樣品中加入預(yù)稀釋體積分?jǐn)?shù)為2-6%的2g/L EDTA溶液，然后稀釋發(fā)酵乳樣品并調(diào)節(jié)pH值為6.8-8.8，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算發(fā)酵乳樣品活菌總數(shù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟: 1)配制2g/LEDTA溶液； 2)向發(fā)酵乳樣品中加入預(yù)稀釋體積分?jǐn)?shù)為2-6%的2g/LEDTA溶液； 3)用IMNaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為6.8-8.8 ； 4)將步驟3)得到的發(fā)酵乳稀釋液搖勻，待稀釋液中沒有乳濁狀的顆粒后，靜置30s，即成10—1稀釋液，整個(gè)操作過程不超過2min ;連續(xù)制成一系列稀釋度菌液供平板接種用，選擇10' 10_9、10,3個(gè)稀釋度采用傾注法在37°C條件下培養(yǎng)48h，且每個(gè)稀釋度做2個(gè)MRS瓊脂平板，最后對(duì)培養(yǎng)基中形成的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)； 5)根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果計(jì)算發(fā)酵乳活菌總數(shù)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，向發(fā)酵乳樣品中加入預(yù)稀釋體積分?jǐn)?shù)為 2-3% 的 2g/L EDTA 溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，稀釋發(fā)酵乳樣品并調(diào)節(jié)pH值為7-8。
5.根據(jù)權(quán)利要 求1或2所述的方法，其特征在于，所述EDTA溶液的pH值為11.8-13.2。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，發(fā)酵乳樣品被稀釋10倍。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵乳活菌包括嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌、雙歧桿菌、干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌。
【文檔編號(hào)】C12Q1/06GK103451264SQ201310415852
【公開日】2013年12月18日 申請(qǐng)日期:2013年9月13日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月13日
【發(fā)明者】劉成國, 易文芝, 周輝 申請(qǐng)人:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)