一種來源于瘤胃細菌產琥珀酸絲狀桿菌β-葡聚糖酶基因的優化、表達及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明屬于生物基因工程及酶工程領域，特別是涉及一種來源于瘤胃細菌產琥珀酸絲狀桿菌β-葡聚糖酶基因的優化、表達及其應用。將來源于瘤胃細菌產琥珀酸絲狀桿菌（Fibrobactersuccinogenes）的β-葡聚糖酶基因SEQIDNO.2通過密碼子優化得到SEQIDNO.3所示的優化葡聚糖酶基因；此基礎上構建了葡聚糖酶基因的酵母表達載體pPIC9K-GLUm，轉化畢赤酵母GS115。經核苷酸序列優化的β-葡聚糖酶基因GLUm表達的酶活力比優化前提高25.1%。經高密度發酵，GLUm葡聚糖酶的活力為51976U/g干培養物。純化β-葡聚糖酶在胃蛋白酶和胰蛋白酶的共同作用60min后，仍保留了50.5%的酶活力，這種優化的產琥珀酸絲狀桿菌β-葡聚糖酶可用于非治療目的降解β-葡聚糖的應用。
【專利說明】一種來源于瘤胃細菌產琥珀酸絲狀桿菌β-葡聚糖酶基因的優化、表達及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物基因工程及酶工程領域。特別是涉及一種來源于瘤胃細菌產琥珀酸絲狀桿菌β-葡聚糖酶基因的優化、表達及其應用。
【背景技術】
[0002]我國是一個人口大國，也是一個農業大國。在以畜牧業為主的農業大國里，人畜爭糧的矛盾十分突出，飼料原料資源的嚴重匱乏阻礙了畜牧業的發展。要保持我國畜牧業的持續發展，必須首先解決好飼料問題。對于單胃動物而言，解決人畜爭糧問題的途徑是開發利用非常規飼料，即降低玉米在飼糧配方中的比例而增加麩皮、大麥等飼料原料的比重。對于反芻家畜來說，充分利用農區大量農作物秸桿資源則有助于解決這一問題。但是，麥類和農作物稻桿中均含較高比例的非淀粉多糖(NSP, non-starch polysaccharides),如β -葡聚糖、阿拉伯木聚糖等，因此妨礙其消化吸收，造成畜禽動物飼料利用率降低、生長受阻以及排泄粘糞、污染環境等。麥類飼料從營養組成上，其潛在的營養價值較高，有些營養成分甚至高于玉米，但含量較高的水溶性NSP限制了其在畜禽飼料中的廣泛應用。
[0003]β -葡聚糖是植物細胞壁的多糖成分。由于β -葡聚糖會包裹一些營養物質，使消化酶不能接觸底物，從而降低飼料的營養價值。同時，某些β_葡聚糖如β_1，3-1，4-葡聚糖具有水溶性，可以使飼料在動物腸道中具有很大的黏性，給動物的生長和生產帶來負面影響。飼料中添加β_葡聚糖酶可有效降解β_葡聚糖的抗營養作用。
[0004]目前，用于工業和畜牧業的葡聚糖酶一般來自于可培養環境微生物的固體培養物，較典型的有芽孢桿菌屬、木霉屬以及青霉屬等。普遍認為，可培養微生物只占自然界微生物的I %，那么剩余的99%的不可培養的微生物中蘊藏著大量的β -葡聚糖酶資源，其中很可能存在高活力、更適宜動物消化道的葡聚糖酶。這為尋找和篩選新的葡聚糖酶類提供了一條新的途徑。
[0005]反芻動物瘤胃被認為是目前轉化NSP效率最高的生物反應器。瘤胃中棲居了大量的細菌、真菌和原蟲，其中細菌和真菌是降解纖維質的主體生物。目前，針對瘤胃纖維降解微生物資源以及基因資源的發掘研究工作正在逐漸成為酶學領域的研究熱點。
[0006]產琥拍酸絲狀桿菌sWcciflogefles)是反會家畜瘤胃中降解植物細胞壁的主要微生物之一。從該細菌中先后分離出數種降解纖維素和半纖維素的酶類。由產琥珀酸絲狀桿菌產生的@-1，3-1，4-葡聚糖酶化.(:.3.2.1.73，簡稱β-葡聚糖酶)被認為是比活力最高的。然而由于產琥珀酸絲狀桿菌屬于厭氧細菌，培養條件苛刻，因此其在工業上還未得到應用。
[0007]基因工程技術是目前大量獲得目的蛋白的常用方法。常用的表達系統有大腸桿菌表達系統、酵母菌表達系統等。呂文平等(2004)從地衣芽孢桿菌UaciJAz1SBcAmifbiTBi1S)基因組DNA中獲得了 β -1, 3-1，4-葡聚糖酶基因，在大腸桿菌中表達后，酶活力為67.34 U/mL，其活力是出發菌的60倍(呂文平，許梓榮，杜文理，李衛芬，孫建義.地衣芽孢桿菌β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因的克隆和表達.農業生物技術學報，2004，12 (4):446-449)ο李永仙等(2009)則對來源于淀粉液化芽孢桿菌amyloliquefaciensBS5582的β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因進行了表達，通過培養條件的優化，該基因在大腸桿菌中表達的最高活力為1883.3 U/mL (李永仙，謝焱，朱林江，張一心，顧國賢，李崎.淀粉液化芽孢桿菌β -1, 3-1，4-葡聚糖酶基因的克隆及表達.生物工程學報，2009，25 (4):542-548)。畢赤酵母表達系統因其培養條件簡單、表達水平高、分泌表達、遺傳穩定等特點，被用于多種蛋白質的表達。樊英等(2007)利用表達載體pPIC9k在畢赤酵母GS115表達了地衣芽孢桿菌β -1, 3-1，4-葡聚糖酶，酶活力最高達333.7U/mL,比活力為1334.8 U/mg(樊英.地衣芽袍桿菌來源β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因克隆、改造及其表達.2007，中國農業科學院學位論文)。
[0008]Shyur等(2000)最早利用基因工程技術在大腸桿菌BL21 (DE3)中表達產琥珀酸絲狀桿菌β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因，通過去除C端部分氨基酸以提高β-1，3-1，4-葡聚糖酶的熱穩定性(專利號:US7037696 BI)。Wen等(2005)則嘗試在大腸桿菌和畢赤酵母Χ-33中表達產琥珀酸絲狀桿菌β -1, 3-1，4-葡聚糖酶基因，在畢赤酵母中該基因的表達水平為1940 U/mL,要高于大腸桿菌中的表達水平(Wen Tuan-Nan, Chen Ju1-Lin, LeeShu-Hua, Yang Ning-Sun, and Shyur Lie-Fen.A truncated Fibrobacter succinogenesI, 3-1, 4-β -D-glucanase with improved enzymatic activity and thermotolerance.Biochemistry.2005, 44(25), 9197-9205)。在國內利用基因工程技術表達產琥珀酸絲狀桿菌β -1, 3-1，4-葡聚糖酶基因的文獻和專利還未見報道。
[0009]開展NSP水解酶基因資源的發掘與利用對于畜牧業開發非常規飼料資源和農作物秸桿的高效利用，緩解糧食短缺危機及環境污染危機具有重要意義；同時對于生物質能源開發緩解能源危機也具有深遠意義；另外，開展相關研究對于紡織、食品、釀酒、醫藥、造紙等工業領域的發展也具有積極的推動作用。

【發明內容】

[0010]本發明的目的是提供一種人工合成編碼的產琥珀酸絲狀桿菌β -1, 3-1，4-葡聚糖酶GLUm (簡稱β-葡聚糖酶GLUm)優化的核苷酸序列。
[0011]本發明的另一目的是提供包含上述優化的產琥珀酸絲狀桿菌β-葡聚糖酶基因的重組載體。
[0012]本發明的另一目的是提供包含上述優化的產琥珀酸絲狀桿菌β_葡聚糖酶基因的重組畢赤酵母菌株。
[0013]本發明的另一目的是提供制備上述優化的產琥珀酸絲狀桿菌β_葡聚糖酶的方法，該方法包括以下步驟:
(1)采用全基因合成方法獲得SEQID N0.3所示核苷酸序列；
(2)構建含有SEQID N0.3所示核苷酸序列的表達載體pPIC9K_GLUm ；
(3)將重組載體pPIC9K-GLUm轉化宿主細胞GSl15，獲得重組菌株；以及
(4)純化所表達的β-葡聚糖酶。
[0014]所述宿主細胞為畢赤酵母GS115。
[0015]本發明的另一目的是上述優化的產琥珀酸絲狀桿菌葡聚糖酶用于非治療目的降解β-葡聚糖的應用。
[0016]本發明的有益效果:本發明提供了產琥珀酸絲狀桿菌β_葡聚糖酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，該酶蛋白由349個氨基酸組成，理論等電點PI為6.67，分子量為37737.75道爾頓。本發明涉及的產琥珀酸絲狀桿菌β -葡聚糖酶，其原始核苷酸序列如序列表SEQ ID N0.2所示，命名為GLU。為提高產琥珀酸絲狀桿菌葡聚糖酶的表達水平，本發明根據畢赤酵母密碼子的利用效率、密碼子的簡并性以及基因的GC含量等對該基因的密碼子進行了優化。本發明涉及的產琥珀酸絲狀桿菌葡聚糖酶，其優化后的核苷酸序列如序列表SEQ ID N0.3所示，命名為GLUm。經檢測，產琥珀酸絲狀桿菌葡聚糖酶基因GLU在50 mL試管中表達的活力達到33.4 U/mL，經密碼子優化后的β -葡聚糖酶基因GLUm在試管中表達的活力達到41.8 U/mL，較優化前酶活力至少提高25.1%，遠高于預估的技術水平及效果。
[0017]GLUm在10 L發酵罐中誘導培養96 h時的活力為6424 U/mL,培養物經干燥后達到123.6 g/L，活力達到51976 U/g干培養物，與現有技術記載的水平相比有明顯提高。
[0018]本發明還提供了一種純化所表達的葡聚糖酶GLUm的方法。酶學性質研究表明:純化后重組產琥珀酸絲狀桿菌β -葡聚糖酶的最適反應溫度為37°C，最適反應pH為5.0,比活力為10397 U/mg。重組產琥珀酸絲狀 桿菌β _葡聚糖酶在pH5.0、溫度在2(T37°C時最為穩定。底物特異性研究表明:重組產琥珀酸絲狀桿菌葡聚糖酶可水解地衣多糖和大麥葡聚糖，活力分別為1352 U/mL和9583 U/mL ;不降解樺木木聚糖、燕麥木聚糖和羧甲基纖維素鈉。
[0019]在胰蛋白酶和胃蛋白酶共同作用60 min時，仍保留50.5%的酶活力，這是大大高于現有技術資料所記載的參數水平。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]下面結合附圖對本發明作進一步的說明。
[0021]圖1產琥珀酸絲狀桿菌β -葡聚糖酶基因優化前后表達的酶活力；
圖2平板剛果紅法鑒定重組產琥珀酸絲狀桿菌β-葡聚糖酶活力；
圖3重組畢赤酵母培養上清的SDS-PAGE電泳圖譜；
圖4重組產琥珀酸絲狀桿菌β -葡聚糖酶在IOL發酵罐中酶活力變化曲線；
圖5重組畢赤酵母在IOL發酵罐中菌體濕重和干重的變化曲線；
圖6葡聚糖凝膠層析蛋白質洗脫曲線；
圖7重組產琥珀酸絲狀桿菌β-葡聚糖酶的最適反應溫度；
圖8重組產琥珀酸絲狀桿菌β -葡聚糖酶的最適反應pH值；
圖9重組產琥珀酸絲狀桿菌β-葡聚糖酶的溫度穩定性；
圖10重組產琥珀酸絲狀桿菌β -葡聚糖酶的pH穩定性；
圖11重組產琥珀酸絲狀桿菌β-葡聚糖酶的底物特異性；
圖12重組產琥珀酸絲狀桿菌葡聚糖酶對胃蛋白酶和胰蛋白酶的耐受性。
【具體實施方式】
[0022]以下實施例中未作具體說明的分子生物學方法均參照《分子克隆實驗指南》(第三版)中所列的具體方法進行，或者按照產品說明書進行。[0023]實施例1、產琥珀酸絲狀桿菌β -葡聚糖酶基因的優化與合成。
[0024]在GenBank中檢索出產琥珀酸絲狀桿菌β -葡聚糖酶基因序列(登錄號:Μ33676)。選取產琥珀酸絲狀桿菌β -葡聚糖酶成熟肽編碼區，根據畢赤酵母密碼子的利用效率、密碼子的簡并性、基因的GC含量，對該編碼區進行密碼子優化。Java Codon Adaptation Tool(JCat)軟件分析優化后的核苷酸序列相對優化度(CAI)由0.088提高到0.976，GC含量由68.57%下降到49.06%。利用RNAStructure 5.3軟件對優化前后的最低自由能進行分析，最低自由能由-240.1 KJ/mol下降到-255.8 KJ/mol。
[0025]優化后的序列送交上海生工生物工程有限公司進行合成，DNA測序確認合成的序列為 1050 bp ο
[0026]實施例2、包含產琥珀酸絲狀桿菌β -葡聚糖酶基因的畢赤酵母工程菌的構建。
[0027]優化后的產琥珀酸絲狀桿菌葡聚糖酶基因和畢赤酵母表達載體PPIC9K (購自美國Invitrogen公司)用EcoR I和Not I雙酶切，酶切產物采用DNA純化試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)進行回收純化。純化的目的基因和表達載體采用Τ4 DNA連接酶進行連接，轉化大腸桿菌DH5 α，經菌落PCR和限制性內切酶鑒定獲得重組表達載體pPIC9K-GLUm。采用SacI分別對pPIC9K_GLU和pPIC9K_GLUm線性化，電擊轉化畢赤酵母GSl 15感受態細胞(購自美國Invitrogen公司)。將轉化后的菌液涂布在MD平板上，于28~30°C培養 48 ho
[0028]挑選生長正常的菌落進行甲醇利用表型鑒定。對甲醇利用表形正確的克隆通過遺傳霉素G418篩選獲得含高拷貝目的基因的重組酵母工程菌。
[0029]實施例3、產琥珀酸絲狀桿菌β -葡聚糖酶GLU和GLUm活力比較。
[0030]從抗4 mg/mL遺傳霉素G418的克隆中隨機挑選15個，分別在50 mL試管中接種于5 mL BMGY培養基中，28~30°C振蕩培養24 h，加入甲醇至終點濃度為0.5%誘導培養48 ho培養結束后收集培養上清用于測定酶活力。
[0031]優化前后產琥珀酸絲狀桿菌β -葡聚糖酶活力如圖1所示，優化前產琥珀酸絲狀桿菌β -葡聚糖酶基因GLU表達的酶活力為33.4 U/mL,優化后β -葡聚糖酶基因GLUm表達的酶活力為41.8 U/mL,比優化前提高25.1%。
[0032]實施例4、重組產琥珀酸絲狀桿菌β -葡聚糖酶的活性測定。
[0033]采用DNS法測定β -葡聚糖酶活力。取適當稀釋的酶液200 yL，0.8%的大麥葡聚糖(Sigma) 400 yL，于37°C反應5 min，立即加入I mL DNS，振蕩混勻后于95°C水浴5min顯色。自來水冷卻后加入3.4 mL去離子水,振蕩混勻后于540 nm處測定吸光度。
[0034]同時，設置對照樣品，即取適當稀釋的酶液200 UL,DNS I mL，0.8%的大麥葡聚糖400 yL,于37°C反應5 min后于95°C水浴5min顯色。自來水冷卻后加入3.4 mL去離子水，振蕩混勻后于540 nm處測定吸光度。
[0035]I個酶活力單位(U)定義為:在pH5.0、37°C條件下，每分鐘水解產生I μ mol葡萄
糖所需要的酶量。
[0036]實施例5、產琥珀酸絲狀桿菌β -葡聚糖酶GLUm重組菌株的高效表達。
[0037](I)種子液的準備
取_80°C冷凍保存液I mL，室溫解凍后接種至盛有100 mL YI3D培養基的500 mL三角瓶中，于28~30°C，150~300 rpm，振蕩培養24~48h。
[0038](2)發酵罐和培養基的滅菌
按照說明書分別對空氣管道和發酵罐(IOL)進行滅菌。配制6L ?1122培養基(42.9 gKH2PO4, 5.0 g (NH4)2SO4,1.0 g CaS04.2H20，14.3 g K2SO4,11.7 g MgSO4*7H20,40.0 g 甘油，
2mL消泡劑，加水溶解定容至I L)，滅菌后用KOH調節pH到4.5~5.0后加入過濾除菌的PMT4 溶液(2.0 g CuSO4.5Η20，0.08 g NaI, 3.0 g MnSO4.H2O, 0.2 g Na2 MoO4.2Η20，0.02g H3BO3,0.5 g CaSO4.2Η20,0.5 g CoCl2, 7.0 g ZnCl2, 22.0 g FeSO4.7Η20,0.2 g biotin,I mL濃硫酸,加水溶解定容至I L) 6 mL。
[0039](3)菌體生長階段
用30%的NH4OH將培養基調至pH4.5~5.0 ;按照10%的比例加入種子液，控制溶氧(DO)在35%左右，攪拌轉速500~800 rpm，通氣量5~10 L/min，培養溫度28~30°C，罐壓
0.03、.06 MPa，培養20 h，以耗盡甘油。
[0040](4)添加甘油生長階段
流加50%的甘油4h，流速為15 mL/L*h，控制DO在30~35%之間。培養溫度28~30°C，罐壓 0.03~0.06MPa, ρΗ4.5~5.0。
[0041](5)誘導階段
甲醇流加的初始速度為3.5~5 mL/L.h，48 h后逐漸增大到11-12 mL/L*h，持續72h。發酵攪拌速度為600~800 rpm,培養溫度為28~30°C，培養基ρΗ4.5^5.0,60%>0D>35%,通氣量為>9 L/min。`
[0042]在發酵過程中每12 h取樣測定酶活力、菌體濕重和干重。同時取0、36h和96h的樣品平板剛果紅法定性判斷β_葡聚糖酶的活力。另外，取誘導培養后的0、12、24、36、48、72、84和96 h時的樣品進行SDS-PAGE電泳。
[0043]平板剛果紅法定性判斷β -葡聚糖酶活力的結果見圖2，在誘導O h時無β -葡聚糖酶活性，36 h時的透明圈小于96 h時的透明圈，表明96 h時的活力高于36 h時。
[0044]不同時間點樣品的SDS-PAGE結果見圖3所示，隨著誘導時間的延長培養上清中分子量介于44.3~29 KD有一條明顯的蛋白質條帶，與本發明中β-葡聚糖酶的理論分子量接近。
[0045]發酵過程中葡聚糖酶的活性如圖4所示，在發酵第96 h時發酵液中的酶活力為6424 U/mL。發酵過程中菌體濕重和干重隨時間的變化曲線如圖5所示，在發酵第96 h時菌體濕重和干重達到最大值，為274.6 g/L和123.6 g/L，活力達到51976 U/g干培養物。
[0046]實施例6、重組產琥珀酸絲狀桿菌β -葡聚糖酶的純化。
[0047]取適量充分膨脹的G-75葡聚糖凝膠填裝100 cm層析柱，經磷酸鈉-檸檬酸緩沖溶液(PH5.0)平衡后用加入I mL樣品，打開流出口，使樣品緩慢的滲入凝膠床內，然后連接好恒流泵和部分收集器，保持流速恒定，每管收集I min，收集洗脫樣品測定在280 nm處吸光度，直至恒定不變關閉儀器結束純化。根據0D280值將處于同一吸收峰的樣品進行合并，并測定合并樣品的酶活力。
[0048]結果如圖6所示，重組產琥珀酸絲狀桿菌葡聚糖酶酶活力集中在第60~80管。純化后的葡聚糖酶比活力達到10397 U/mg。
[0049]實施例7、重組產琥珀酸絲狀桿菌β -葡聚糖酶的酶學性質。[0050]( I)最適反應溫度及最適反應pH值
最適反應溫度:取適量純化后酶液，分別在20°C、30 V、37°C、40 V、50°C、60 V、70°C、80°C、90°C、100°C條件下測定酶活。
[0051]最適反應pH值:取適量純化后酶液，分別在pH為2.2,3.0,4.0,5.0,5.6,6.0、
6.5,7.0,8.0,9.0、10.0、10.6時在最適溫度條件下測定酶活。
[0052]結果如圖7和圖8所示，該重組葡聚糖酶的最適反應溫度為37°C，最適反應pH 為 5.0。
[0053](2)溫度穩定性及pH值的穩定性
溫度穩定性:取適量純化后酶液，分別在20 0C >30 0C >37 0C >40 0C >50 0C >60 0C >70 V、80°C、90°C、10(rC條件下保持30 min,以未處理的酶液為對照，在相應溫度及pH值條件下測定其剩余酶活力。
[0054]pH值穩定性:取適量純化后酶液，分別在pH為2.2,3.0,4.0,5.0,5.6,6.0,6.5、
7.0、8.0、9.0、10.0、10.6下保持30 min,在最適溫度及pH值條件下測定其剩余酶活力。
[0055]結果如圖9和圖10所示，該重組葡聚糖酶在pH5.0、溫度在2(T37°C時最為穩定。
(3)底物特異性
取適量純化后酶液，分別以大麥β -葡聚糖，地衣多糖，羧甲基纖維素鈉，燕麥木聚糖和樺木木聚糖為底物在最適溫度及PH值條件下測定酶活。
[0056]結果見圖11，該重組葡聚糖酶可水解地衣多糖和大麥葡聚糖，活力分別為1352 U/mL和9583 U/mL ;不降解燕麥木聚糖、樺木木聚糖和羧甲基纖維素鈉。
[0057]實施例8、重組產琥珀酸絲狀桿菌β -葡聚糖酶對胃蛋白酶和胰蛋白酶的耐受性。
[0058]取適量酶液，分別加入適量胃蛋白酶(用pH為4.0的緩沖液配制，每I mL含胃蛋白酶活力2500 U)和胰蛋白酶(用pH為6.0的緩沖液配制，每I mL含胰蛋白酶活力40 U)(模擬家禽消化道內環境)，在37°C分別保溫O min、10 min、30 min、60 min、120 min,測定殘余酶活。
[0059]結果如圖12所示，該重組葡聚糖酶在胰蛋白酶和胃蛋白酶共同作用60 min時，仍保留50.5%的酶活力。
【權利要求】
1.優化的產琥珀酸絲狀桿菌β-葡聚糖酶基因GLUm，其特征在于:其核苷酸序列為SEQID N0.3 所示。
2.一種包含權利要求1所述優化的產琥珀酸絲狀桿菌葡聚糖酶基因的重組載體。
3.根據權利要求2所述優化的產琥珀酸絲狀桿菌β-葡聚糖酶基因的重組載體，其特征在于:所述重組載體為pPIC9K-GLUm。
4.一種包含權利要求1所述優化的產琥珀酸絲狀桿菌β -葡聚糖酶基因GLUm的重組菌株。
5.一種優化的產琥珀酸絲狀桿菌葡聚糖酶的制備方法，其特征在于:包括以下步驟: (1)采用全基因合成方法獲得SEQID N0.3所示核苷酸序列； (2)構建含有SEQID N0.3所示核苷酸序列的重組載體pPIC9K-GLUm; (3)將重組載體pPIC9K-GLUm轉化宿主細胞，獲得重組菌株；以及 (4)純化所表達的β-葡聚糖酶。
6.根據權利要求5所述的優化的產琥珀酸絲狀桿菌β-葡聚糖酶基因GLUm的宿主細胞，其特征在于:所述宿主細胞為畢赤酵母GS115。.
7.權利要求5所述的優化的產琥珀酸絲狀桿菌β-葡聚糖酶用于非治療目的降解β-葡聚糖的應用。
【文檔編號】C12R1/84GK103468726SQ201310420565
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月16日 優先權日:2013年9月16日
【發明者】陳勇, 楊玉霞, 張慧玲 申請人:新疆農業大學