一種山羊乳腺上皮細胞的分離和純化方法
【專利摘要】本發明涉及組織與細胞工程領域，尤其提供了一種山羊乳腺上皮細胞的分離和純化方法，該方法主要包括以下步驟：1）組織取樣：無菌采集山羊乳腺腺泡組織；2）分離細胞：組織塊培養法分離乳腺上皮細胞和成纖維細胞；3）純化細胞：差速消化法結合差速貼壁法除去成纖維細胞即可得到純化的乳腺上皮細胞。本發明方法操作簡便，通過常規的細胞培養操作即可得到充分純化的乳腺上皮細胞。采用本發明獲得的乳腺上皮細胞形態整齊、增殖旺盛，可應用于乳腺生長發育、泌乳機制以及驗證乳腺組織特異性表達載體有效性的研究。
【專利說明】一種山羊乳腺上皮細胞的分離和純化方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及組織與細胞工程領域，尤其提供了一種山羊乳腺上皮細胞的分離和純化方法。
【背景技術】
[0002]乳腺為復管泡狀腺，由被膜、間質和實質組成。一般來說，上皮細胞構成了乳腺實質的腺泡和導管系統。多數上皮是內襯于腺泡腔表面，具有分泌功能的腺泡上皮，除此之外還有構成導管系統的導管上皮以及包繞在導管和腺泡外表面的肌上皮。構成間質的主要是脂肪細胞，但是成纖維細胞、造血系統細胞、血管和神經也存在其中。
[0003]乳腺上皮細胞是研究乳腺生長發育、泌乳機制以及驗證乳腺組織特異性表達載體有效性的體外模型。目前原代乳腺上皮細胞培養大都采用膠原酶消化法和組織塊培養法。利用膠原酶消化乳腺組織，再經過密度梯度離心可以得到較純凈的上皮細胞，但此種方法操作復雜，往往因為消化和離心而損失大量細胞，對后期的傳代培養和實驗造成不利影響。組織塊培養法操作過程簡單，節約組織樣品，而且避免了消化和離心對細胞造成的不良影響。但是細胞從組織塊中長出所需的時間較長，成纖維細胞等結締組織細胞最先長出，上皮細胞大量出現較為滯后。無論是采用膠原酶消化法還是組織塊培養法，原代乳腺上皮細胞的培養均得到上皮細胞和成纖維細胞的混合物。
[0004]現在研究可知目前沒有可用于研究的商品化的反芻動物乳腺上皮細胞系，當前用于研究的乳腺上皮細胞多是由科研人員自行從乳腺組織中分離，主要應用的分離方法是組織塊培養法和酶消化法。乳腺組織中細胞類型眾多，采用上述方法獲得的乳腺上皮細胞都是多種類型細胞的混合體，必須進行純化培養后才能用于后續實驗，但是其分離和純化效果都難以令人滿意，因此需要更加有效的分離和純化方法。

【發明內容】

[0005]本發明基于上述原因，提供了一種山羊乳腺上皮細胞的分離和純化方法，該方法主要包括以下步驟:1)組織取樣:無菌采集山羊乳腺腺泡組織；2)分離細胞:組織塊培養法分離乳腺上皮細胞和成纖維細胞；3)純化細胞:差速消化法結合差速貼壁法除去成纖維細胞即可得到純化的乳腺上皮細胞。本發明方法操作簡便，通過常規的細胞培養操作即可得到充分純化的乳腺上皮細胞。采用本發明獲得的乳腺上皮細胞形態整齊、增殖旺盛，可應用于乳腺生長發育、泌乳機制以及驗證乳腺組織特異性表達載體有效性的研究。
[0006]本發明的具體技術方案是:
[0007]一種山羊乳腺上皮細胞的分離和純化方法，該方法主要包括以下步驟:
[0008]I)組織取樣:無菌采集山羊乳腺腺泡組織；
[0009]2)分離細胞:組織塊培養法分離乳腺上皮細胞和成纖維細胞；
[0010]3)純化細胞:差速消化法結合差速貼壁法除去成纖維細胞即可得到純化的乳腺上皮細胞。[0011]更為具體的方法是:
[0012]I)組織取樣:無菌采集山羊乳腺腺泡組織；發明人發現當選用純種嶗山奶山羊泌乳期30天的乳腺腺泡組織時，可以為后續工作取得更好的效果。
[0013]2)分離細胞:組織塊培養法分離乳腺上皮細胞和成纖維細胞，具體步驟為:
[0014]a.用含有200U/ml青霉素和200 μ g/ml鏈霉素的PBS清洗上述獲得的乳腺腺泡組織，并將其分割成0.5-lmm3的小組織塊 ；
[0015]b.用高濃度血清培養基浸潤a中所述小組織塊，以間隔0.5cm接種于培養皿底，在37°C、5vt%濃度CO2、飽和濕度的培養箱中靜置培養4小時，上述高濃度血清培養基為含有50vt%FBS的DF12培養基；
[0016]其中所述的高濃度血清培養基為FBS和DF12以體積比1:1配制出的培養基；這也是本發明與現有技術的不同之一，現有技術中一般FBS和DF12是以體積比1:9的配比制備培養基，如下述步驟c中的培養液，但是在該步驟中發明人卻采用了這種高濃度的血清培養基，實際上相當于傳統方法中在培養皿底包被膠原的步驟，但是步驟沒有包被膠原那么繁瑣，降低了操作的難度，能夠起到較好的效果，主要體現在1.有利于組織塊的貼壁，2.有利于組織細胞的游出與生長兩個方面；同時，發明人在實驗了現有技術中FBS和DF12以體積比1:9的配比制備培養基之后，發現這一培養基難以滿足組織貼壁的需要，故而進行了多次實驗和調整后，最終確定了采用FBS和DF12以體積比1:1配制出的培養基；采用這種培養基浸潤組織塊后可以實現快速貼壁，且這種培養基僅作為浸潤時使用，并不用于后續的培養，而由于采用了組織貼壁法，相比與現有的酶消化法獲得的細胞而言，這種方法避免了長時間酶消化可能對細胞造成的損傷。
[0017]c.向上述培養皿中加入培養液，使其剛好覆蓋培養皿底，置于37°C、5vt%濃度CO2、飽和濕度的培養箱中靜置培養，12小時后補加培養液至完全浸沒組織塊為止，2天后更換半量培養液，以后每2天更換半量培養液，總共培養至少8天后即得混合其它細胞生長的乳腺上皮細胞，
[0018]上述培養液為體積比FBS:DF12為1:9的溶液，其中還含有5mg/L牛胰島素、5mg/L氫化可的松、10 μ g/L表皮生長因子和10萬IU/L青鏈霉素雙抗；
[0019]上述所采用的各種材料均為市場上直接購得，在此不再贅述；
[0020]b步驟中，為了達到較好的效果且縮短整個操作的時間，一般將浸潤時間控制在2_4min ；
[0021]3)純化細胞:差速消化法結合差速貼壁法除去成纖維細胞，得到純化的乳腺上皮細胞，具體步驟如下:
[0022]a.差速消化法:向上述混合其它細胞生長的乳腺上皮細胞的培養物中加入消化液消化細胞，在倒置顯微鏡下觀察細胞形態變化，待成纖維細胞脫離底壁時，吸棄消化液去除成纖維細胞，利用殘留的消化液繼續消化1-2分鐘，加入培養液終止消化，將剩余的細胞吹打成單細胞懸液；
[0023]采用這種差速消化的方式，可以消化去除成纖維細胞，同時保留乳腺上皮細胞。在消化的過程中，成纖維細胞首先脫離底壁，漂浮在消化液中，而此時乳腺上皮細胞還沒有被消化脫離底壁，此時將培養皿內的消化液吸棄，從而將成纖維細胞和乳腺上皮細胞分離，由于底壁還會殘留少量消化液，而且它足以使乳腺上皮細胞脫離底壁，所以不用再添加新鮮的消化液，此后終止消化、吹打均勻后再傳代培養即可。
[0024]其中所述消化液為等體積混合的不含鈣鎂離子的PBS和0.25wt%胰蛋白酶的EDTA溶液，消化條件為室溫25°C，成纖維細胞消化時間為1.5-2分鐘，其中所采用的0.25wt%胰蛋白酶的EDTA溶液購自gibco公司，其英文名稱為0.25%Trypsin-EDTA, 一般使用時根據具體使用情況，控制消化液的用量過量即可保證全部消化完成；
[0025]所述的培養液為體積比FBS:DF12為1:9的溶液，其中還含有5mg/L牛胰島素、5mg/L氫化可的松、10 μ g/L表皮生長因子和10萬IU/L青鏈霉素雙抗；
[0026]b.差速貼壁法:將上述的單細胞懸液移入新的培養皿中培養20分鐘，待成纖維細胞貼壁后，轉移培養液至另一個新的培養皿中繼續培養，原培養皿添加新的培養液繼續培養，如此轉移3次，每次轉移的時間間隔均為20分鐘，12小時后更換培養液，以后每2天換液一次；
[0027]上述各培養皿培養3-4天后，選擇其中純化程度和生長密度最好的培養皿，重復步驟a和步驟b進行傳代純化，如此傳至第4代即得到純化的乳腺上皮細胞。
[0028]之所以采用b步驟這種方法，主要原因在于:由于貼壁速度的差異，通過轉移含有細胞的培養液，將貼壁速度快的成纖維細胞留在原先的培養皿中，從而達到純化乳腺上皮細胞的目的；
[0029]而再轉移3次的意思是:將a步驟中獲得的單細胞懸液依次轉移經過4個培養皿，每個培養皿中停留20分鐘，每次轉移的均是培養皿中的停留20分鐘的培養液，這樣就使得培養液中的細胞按順序在4 個培養皿中貼壁，由于成纖維細胞貼壁快于乳腺上皮細胞，所以轉移經過的前兩個培養皿，成纖維細胞貼壁多，而后兩個培養皿貼壁得到的是較為純凈的乳腺上皮細胞，每次轉移后再在原培養皿中補加新鮮培養液繼續培養，2-3天后比較各培養皿細胞形態，選擇最佳繼續純化即可，而之所以限定總共轉移的次數為3次，主要原因在于如果轉移兩次可能分離不徹底，轉移次數過多貼壁存活的細胞也會大大減少，浪費試劑及實驗材料，實驗表明轉移3次可以充分分離成纖維細胞，得到純化的乳腺上皮細胞。
[0030]而之所以選擇培養皿培養3-4天后進行傳代純化，主要原因就是采用本發明的方法后，一般需要上述的時間，才能保證貼壁細胞增殖占據培養皿底壁面積的90%左右，才能達到傳代的要求；而如果細胞貼壁很多，兩天左右即可傳代，如果貼壁較少，則需要生長更長時間才能傳代，因此3-4天為一般性選擇；
[0031]選擇其中純化程度和生長密度最好的培養皿時，一般采用現有技術的常用方法進行判定，如觀察細胞形態，本發明的具體做法是:鑒于成纖維細胞和上皮細胞的形態不同，這里選擇的標準是顯微鏡下觀察到的成纖維細胞數量最少，細胞形態一致生長密度最佳，選取這種培養皿繼續進行純化培養，其后期獲得的乳腺上皮細胞純化效果最好；
[0032]本發明的發明人發現，采用本發明的方法后，一般經過4代的純化后就得到了形態一致的乳腺上皮細胞，再經過多次傳代也沒有出現成纖維細胞明顯生長的現象，說明純化4代即可得到充分純化的乳腺上皮細胞，而低于4代則達不到最佳的純化效果，故而選擇純化至第4代即可，純化次數過多則會浪費大量細胞，而且會增加整個方法的成本。
[0033]對于本領域而言，本發明的最大進步就在于采用了 FBS和DF12以體積比1:1配制出的高濃度血清培養基，浸潤小組織塊后直接貼壁培養，分離得到乳腺上皮細胞。使用該方法不但避免了長時間酶消化對組織細胞造成的損傷，同時省去了傳統方法中制備膠原的步驟，獲得了組織貼壁良好，細胞生長旺盛的混合培養體系。純化法中采用的消化液的濃度、消化成纖維細胞的時間、溫度以及差速貼壁時細胞轉移的次數和轉移時間間隔均為本發明所特有，與現有技術有著較大的差距。本方法在室溫條件下采用低濃度胰蛋白酶，快速、有效地消化分離了混合體系中的成纖維細胞，同時降低了胰蛋白酶消化可能對細胞造成的不利影響；根據成纖維細胞和乳腺上皮細胞貼壁時間的差異，采用間隔20分鐘連續轉移培養皿培養的方法，進一步分離除去成纖維細胞，得到了純凈的乳腺上皮細胞培養體系，本發明方法保證了上皮細胞的純度、活力以及其本身固有的特性。
[0034]綜上所述，本發明提供的方法操作簡便，通過常規的細胞培養操作即可得到充分純化的乳腺上皮細胞。采用本發明獲得的乳腺上皮細胞形態整齊、增殖旺盛，可應用于乳腺生長發育、泌乳機制以及驗證乳腺組織特異性表達載體有效性的研究。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0035]圖1是培養至第8天的組織塊及其周圍的細胞；
[0036]圖2是組織塊培養法分離獲得的第一代混合生長的乳腺細胞；
[0037]圖3是純化的第4代乳腺上皮細胞；
[0038]圖4是乳腺上皮細胞角蛋白免疫熒光圖像；
[0039]圖5為圖4的彩色示意圖。
【具體實施方式】
[0040]下面通過具體的制備實施例進一步說明本發明，但是，應當理解為，這些實施例和試驗例僅僅是用于更詳細具體地說明之用，而不應理解為用于以任何形式限制本發明。
[0041]實施例1山羊乳腺上皮細胞的取樣與處理
[0042]采用現有技術直接無菌采集青島奧特種羊場純種嶗山奶山羊泌乳期30天的乳腺組織；
[0043]用PBS沖洗采集乳腺組織塊，除去其表面的血液和羊奶；沖洗干凈后后浸入含有200U/ml青霉素和200 μ g/ml鏈霉素的DFl2培養基中，置于冰盒內迅速帶回實驗室處理，用含有200U/ml青霉素和200 μ g/ml鏈霉素的PBS反復沖洗乳腺組織，直到沖洗液變清亮為止，在超凈臺上分割修剪，去除脂肪組織和結締組織并沖洗至沖洗液清亮，即可得到得到的白色顆粒狀的腺泡組織。
[0044]實施例2組織塊培養法分離乳腺上皮細胞和成纖維細胞
[0045]a.用眼科剪和眼科鑷將上述白色顆粒狀的乳腺腺泡組織分割成0.5-lmm3左右的小組織塊，同時用含有200U/ml青霉素和200 μ g/ml鏈霉素的PBS漂清獲得的小組織塊；
[0046]b.用FBS和DF12以體積比1:1配制出的培養基浸潤所述小組織塊2_4分鐘，間隔
0.5cm接種于培養皿底，置于37°C、5vt%濃度CO2、飽和濕度的培養箱中靜置培養4小時；
[0047]c.向上述培養皿中加入培養液，使其剛好覆蓋培養皿底，置于37°C、5vt%濃度CO2、飽和濕度的培養箱中靜置培養，12小時后補加培養液至完全浸沒組織塊為止，2天后更換半量培養液，以后每2天更換半量培養液，5天左右可以看到組織塊周圍有細胞遷出，8天左右可以看到混合生長的乳腺上皮細胞和成纖維細胞。如附圖1所示，陰影部分為為組織塊，橢圓形或呈鋪路石狀的為乳腺上皮細胞，形態為長形或梭形的是成纖維細胞。[0048]將原代細胞消化傳代，即可得到更為明顯的混合生長的乳腺上皮細胞和成纖維細胞。如圖2所示，島嶼狀聚集生長的橢圓形或鋪路石狀細胞為乳腺上皮細胞，乳腺上皮細胞周圍游離生長的長形或梭形細胞為成纖維細胞。
[0049]上述培養為液體體積比FBS:DF12為1:9的溶液，其中還含有5mg/L牛胰島素、5mg/L氫化可的松、10 μ g/L表皮生長因子和10萬IU/L青鏈霉素雙抗。
[0050]實施例3
[0051]速消化法結合差速貼壁法除去成纖維細胞，得到純化的乳腺上皮細胞，具體步驟如下:
[0052]a.差速消化法:向實施例2中獲得的混合其它細胞生長的乳腺上皮細胞的培養物中加入消化液消化細胞，在倒置顯微鏡下觀察細胞形態變化，待成纖維細胞脫離瓶壁時，吸棄消化液去除成纖維細胞，利用殘留的消化液繼續消化1-2分鐘，加入培養液終止消化，將剩余的細胞吹打成單細胞懸液；[0053]其中所述消化液為等體積混合的不含鈣鎂離子的PBS和0.25%Trypsin-EDTA溶液，消化條件為室溫25°C，成纖維細胞消化時間為1.5-2分鐘；
[0054]所述的培養液為液體體積比FBS:DF12為1:9的溶液，其中還含有5mg/L牛胰島素、5mg/L氫化可的松、10 μ g/L表皮生長因子和10萬IU/L青鏈霉素雙抗；
[0055]b.差速貼壁法:將上述的單細胞懸液移入新的培養皿中培養20分鐘，待成纖維細胞貼壁后，轉移培養液至另一個新的培養皿中繼續培養，20分鐘后再次轉移到新的培養皿中，如此轉移3次，原培養皿添加新的培養液繼續培養，12小時后更換培養液，以后每2天換液一次，直至貼壁生長的細胞占據培養皿底面積的90%左右，時間一般為3-4天；
[0056]選擇步驟b中純化程度和生長密度最好的培養皿，重復步驟a和步驟b進行傳代純化，如此傳至第4代即得到純化的乳腺上皮細胞。如圖3所示，細胞形態整齊，呈橢圓形或鋪路石狀，為典型的上皮細胞形態。
[0057]實施例4上皮細胞角蛋白免疫熒光鑒定
[0058]對傳代培養分離純化的山羊乳腺上皮細胞進行角蛋白18免疫熒光鑒定，所用方法參照武漢博士德生物工程有限公司免疫熒光試劑盒說明書，操作完成后用H0echst33342復染細胞核，倒置熒光顯微鏡觀察并拍照，其結果如圖4和圖5所示。圖中紅色熒光部分為表達于細胞質中的角蛋白18，藍色部分為Hoechst33342染色的細胞核，本實驗結果說明了使用本發明獲得了充分純化的奶山羊乳腺上皮細胞。
【權利要求】
1.一種山羊乳腺上皮細胞的分離和純化方法，該方法主要包括以下步驟: 1)組織取樣:無菌采集山羊乳腺腺泡組織； 2)分離細胞:組織塊培養法分離乳腺上皮細胞和成纖維細胞； 3)純化細胞:差速消化法結合差速貼壁法除去成纖維細胞即可得到純化的乳腺上皮細胞。
2 .根據權利要求1所述的山羊乳腺上皮細胞的分離和純化方法，其特征在于:所述步驟(2)分離細胞:組織塊培養法分離乳腺上皮細胞和成纖維細胞，具體步驟為: a.用含有200U/ml青霉素和200μ g/ml鏈霉素的PBS清洗獲得的乳腺腺泡組織，并將其分割成0.5-lmm3的小組織塊； b.用高濃度血清培養基浸潤a中所述小組織塊，以間隔0.5cm接種于培養皿底，在37°C、5vt%濃度CO2、飽和濕度的培養箱中靜置培養4小時；上述高濃度血清培養基為含有50vt%FBS 的 DF12 培養基； c.向上述培養皿中加入培養液，使其剛好覆蓋培養皿底，置于37°C、5vt%濃度CO2、飽和濕度的培養箱中靜置培養，12小時后補加培養液至完全浸沒組織塊為止，2天后更換半量培養液，以后每2天更換半量培養液，總共培養至少8天后即得混合其它細胞生長的乳腺上皮細胞； 上述培養液為體積比FBS:DF12為1:9的溶液，其中還含有5mg/L牛胰島素、5mg/L氫化可的松、10 μ g/L表皮生長因子和10萬IU/L青鏈霉素雙抗。
3.根據權利要求1所述的山羊乳腺上皮細胞的分離和純化方法，其特征在于:所述步驟(3)純化細胞:差速消化法結合差速貼壁法除去成纖維細胞，得到純化的乳腺上皮細胞，具體步驟如下: a.差速消化法:向步驟(2)獲得的混合其它細胞生長的乳腺上皮細胞的培養物中加入消化液消化細胞，在倒置顯微鏡下觀察細胞形態變化，待成纖維細胞脫離底壁時，吸棄消化液去除成纖維細胞，利用殘留的消化液繼續消化1-2分鐘，加入培養液終止消化，將剩余的細胞吹打成單細胞懸液； 其中所述消化液為等體積混合的不含鈣鎂離子的PBS和0.25wt%胰蛋白酶的EDTA溶液，消化條件為室溫25°C，成纖維細胞消化時間為1.5-2分鐘； 所述的培養液為體積比FBS:DF12為1:9的溶液，其中還含有5mg/L牛胰島素、5mg/L氫化可的松、10 μ g/L表皮生長因子和10萬IU/L ； b.差速貼壁法:將上述的單細胞懸液移入新的培養皿中培養20分鐘，待成纖維細胞貼壁后，轉移培養液至另一個新的培養皿中繼續培養，原培養皿添加新的培養液繼續培養，如此轉移3次，每次轉移的時間間隔均為20分鐘，12小時后更換培養液，以后每2天換液一次； 上述各培養皿培養3-4天后，選擇其中純化程度和生長密度最好的培養皿，重復步驟a和步驟b進行傳代純化，如此傳至第4代即得到純化的乳腺上皮細胞。
4.根據權利要求2所述的山羊乳腺上皮細胞的分離和純化方法，其特征在于:所述步驟(2)中b步驟中浸潤時間控制在2-4min。
【文檔編號】C12N5/071GK103525752SQ201310435023
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年9月21日 優先權日:2013年9月21日
【發明者】王建民, 陳存仙, 董飛, 王桂芝, 紀志賓, 秦孜娟 申請人:山東農業大學